專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)d-對(duì)羥基苯基甘氨酸和d-苯基甘氨酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及制備對(duì)映體純形式的D-對(duì)羥基苯基甘氨酸(D-HPG)和D-苯基甘氨酸(D-PG)的生化方法。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)D-HPG和D-PG的重組微生物。下文的縮寫(H)PG是指HPG和/或PG；需要的情況下提及(H)PG的特定對(duì)映異構(gòu)體。本發(fā)明由德國(guó)政府和美國(guó)政府資助，德國(guó)Bundesministerium für Bildung und Forschung(BMBF)BioRegio計(jì)劃授予的資助號(hào)為0311644號(hào)，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的資助號(hào)為RO1 A114937。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
本發(fā)明背景除甘氨酸之外，每種普通的天然氨基酸都以兩種可能對(duì)映體的其中一種形態(tài)存在。氨基酸的兩種對(duì)映體形式可稱為D-型和L-型對(duì)映體?？梢詢煞N對(duì)映體形式存在的化合物的對(duì)映體純度通常以其對(duì)映體過量(經(jīng)?？s寫為“e.e.”)表示；e.e.可定義為兩種對(duì)映體量差值除以量的總和，其商乘以100得到百分比值。對(duì)本申請(qǐng)而言，對(duì)映體純是指e.e.至少為90％，優(yōu)選超過95％，或者甚至更優(yōu)選超過98％。
D-型和L-型對(duì)映體之間的區(qū)別在于氨基酸α-碳構(gòu)象是L-型或D-型甘油醛(一種評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn))。大多數(shù)作用于氨基酸的酶都具有L-特異性結(jié)合域，因此，大多數(shù)天然蛋白質(zhì)都只含有L-氨基酸。
但也有些例外，D-氨基酸為微生物細(xì)胞所利用而且構(gòu)成微生物細(xì)胞。例如，細(xì)菌細(xì)胞生產(chǎn)胞壁質(zhì)前體物質(zhì)D-谷氨酸和D-丙氨酸，胞壁質(zhì)是一種典型的細(xì)胞壁組分。D-氨基酸通常不是直接產(chǎn)生，而是利用氨基酸特異性消旋酶將L-氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)應(yīng)的D-氨基酸。消旋酶催化L-氨基酸向D-氨基酸轉(zhuǎn)變，反之亦然。在平衡狀態(tài)，人們發(fā)現(xiàn)了L-對(duì)映體和D-對(duì)映體的外消旋(50％/50％)混合物，因此，消旋酶不能用作生產(chǎn)對(duì)映體純形式D-氨基酸的最終反應(yīng)步驟。
對(duì)抗菌藥物的需求增加導(dǎo)致半合成抗生素的大量生產(chǎn)，其中許多都摻入了旋光性D-氨基酸作為結(jié)構(gòu)單元。例如將D-HPG和D-PG摻入到某些β-內(nèi)酰胺抗生素(例如阿莫西林和頭孢氨芐)中。
為低成本有效地生產(chǎn)這些抗生素，需要利用有商業(yè)吸引力方法制備對(duì)映體純形式的D-(H)PG。但是，由于D-(H)PG的復(fù)雜結(jié)構(gòu)以及分子中存在手性中心，所以用常規(guī)化學(xué)方法生產(chǎn)D-(H)PG一般包括多個(gè)用于生產(chǎn)D-型和L-型(H)PG外消旋混合物的步驟，然后需要另外的旋光拆開步驟，以獲得對(duì)映體純形式的產(chǎn)物。額外的工藝步驟增加了工藝成本，使整個(gè)方法失去了商業(yè)吸引力。
生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的發(fā)酵法通常以能夠?qū)⑾鄬?duì)廉價(jià)的原料轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物而具有商業(yè)吸引力為人所知。發(fā)酵法包括的反應(yīng)通常具有高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性。因此，這些反應(yīng)能以相對(duì)簡(jiǎn)單的工藝生產(chǎn)復(fù)雜的對(duì)映體純產(chǎn)物。為此，在先有技術(shù)中對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)各種精細(xì)化學(xué)藥品已進(jìn)行了無數(shù)的嘗試。
已經(jīng)描述了以使用大腸桿菌菌株的發(fā)酵法生產(chǎn)D-苯丙氨酸的方法(EP 0736604A2)，所述大腸桿菌包含球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)立體保守D-轉(zhuǎn)氨酶?！傲Ⅲw保守D-轉(zhuǎn)氨酶”應(yīng)當(dāng)理解為專一地由D-型氨基供體生產(chǎn)D-型氨基酸的D-轉(zhuǎn)氨酶。另一方面，“立體轉(zhuǎn)化D-轉(zhuǎn)氨酶”應(yīng)當(dāng)定義為使用L-型氨基供體并專一生產(chǎn)D-型氨基酸的轉(zhuǎn)氨酶。例如，L-Glu或L-Asp可用作生產(chǎn)D-PG或D-HPG的氨基供體。
為了提供用于體內(nèi)立體-保守D-特異性轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)的D-型氨基供體，細(xì)胞中必須存在催化L-氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-氨基酸的消旋酶編碼基因，反之亦然。因此，D-型氨基供體由L-型對(duì)映體胞內(nèi)產(chǎn)生。D-型氨基供體的胞內(nèi)濃度是所述分子(D-型+L-型)總胞內(nèi)濃度的一半或一半以下。因?yàn)镈-型氨基供體(離析物)濃度的降低導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨反應(yīng)平衡向離析物一側(cè)移動(dòng)，所以氨基供體的外消旋混合物(即組合使用消旋酶和立體保守轉(zhuǎn)氨酶)不適于有效生產(chǎn)需要的D-氨基酸。
另外，將消旋酶克隆入細(xì)胞勞動(dòng)力昂貴，增加了細(xì)胞的“代謝負(fù)擔(dān)”，因?yàn)榧?xì)胞不得不合成其它的酶。用于生物合成消旋酶所消耗的前體代謝物和能量不能再用于細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成等。
本發(fā)明的目標(biāo)是使改進(jìn)的發(fā)酵方法可用于生產(chǎn)D-HPG和D-PG，這種方法克服了上述缺點(diǎn)。
該目標(biāo)令人驚奇地實(shí)現(xiàn)了，其中發(fā)酵方法中的丙酮酸苯酯(PP)或?qū)αu基丙酮酸苯酯(HPP)取自芳香族氨基酸途徑，分別轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜?MA)或?qū)αu基扁桃酸(HMA)，MA或HMA分別轉(zhuǎn)變?yōu)楸揭胰┧?PGL)或?qū)αu基苯乙醛酸(HPGL)，最后通過立體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)氨酶的作用分別轉(zhuǎn)變?yōu)镈-PG或D-HPG。
立體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)氨酶在發(fā)酵方法中的應(yīng)用提供了明顯的優(yōu)勢(shì)不需要消旋酶活性，立體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)氨酶使用天然L-型氨基供體(當(dāng)通過消旋酶由L-對(duì)映體產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的D-對(duì)映體時(shí)，胞內(nèi)存在的L-型氨基供體的濃度至少是所述D-對(duì)映體的兩倍)。發(fā)酵法的應(yīng)用使得可以利用廉價(jià)原料(例如葡萄糖和其它糖)生產(chǎn)D-(H)PG。
在本發(fā)明的含義中，發(fā)酵(和發(fā)酵法)應(yīng)當(dāng)理解為以下的過程以合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物、通過細(xì)胞組分的催化活性或自發(fā)性化學(xué)反應(yīng)將合適的培養(yǎng)基組分轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，并由培養(yǎng)液和/或生物體本身獲得產(chǎn)物。
在本發(fā)明的含義中，合適的培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)理解為微生物可以在其上生長(zhǎng)、增殖的物質(zhì)混合物和/或可以轉(zhuǎn)變?yōu)槟康漠a(chǎn)物的物質(zhì)混合物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于發(fā)酵的微生物選自一組比通常觀察到的野生型菌株更有效供給HPP和/或PP(在HPP和/或PP取自各自代謝庫(kù)的情況下)的微生物。選自所述微生物組的微生物應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是對(duì)HPP和/或PP具有“改進(jìn)的生產(chǎn)能力”，并“提供HPP和/或PP的效率更高”。
應(yīng)用提供HPP和/或PP的效率更高的微生物對(duì)有效生產(chǎn)D-HPG或D-PG很重要，因?yàn)樵谝幌盗蟹磻?yīng)中，不僅是系列中最慢的反應(yīng)控制反應(yīng)速率，而且每個(gè)酶反應(yīng)都在某種程度上控制反應(yīng)速率。因此，葡萄糖轉(zhuǎn)化為HPP和/或PP也對(duì)最終產(chǎn)物D-HPG或D-PG的總產(chǎn)量有影響。
適于增加HPP和PP在所述微生物中效率的方法包括選擇顯示有益自發(fā)突變的微生物、選擇由經(jīng)典菌株改進(jìn)程序(包括隨機(jī)誘變)演化出的微生物以及選擇由應(yīng)用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的生產(chǎn)能力改進(jìn)的微生物。例如，適于增加HPP和PP效率的方法可為引入關(guān)鍵酶的反饋抗性突變體或過表達(dá)一種或幾種途徑酶，如Berry綜述(1996，TIBTECH，14250-256)。應(yīng)用重組DNA技術(shù)也可以直接引入磷酸烯醇丙酮酸非依賴性糖吸收系統(tǒng)(WO 98/18936)、去除磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)(Berry，1996，TIBTECH，14250-256)和/或通過修飾對(duì)胞內(nèi)磷酸烯醇丙酮酸濃度起作用的反應(yīng)而增加磷酸烯醇丙酮酸的效率(Berry，1996，TIBTECH，14250-256)。應(yīng)用重組DNA技術(shù)也可以直接引入增加的胞內(nèi)轉(zhuǎn)酮酶和/或轉(zhuǎn)醛酶活性(WO 98/18936)。
另一種適于提供HPP和/或PP的效率更高的方法是在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別提供L-酪氨酸和L-苯丙氨酸。在單步轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)中微生物容易將L-酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镠PP，而容易將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镻P。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的微生物在對(duì)羥基扁桃酸合酶(p-HmaS)催化的單步酶轉(zhuǎn)化中將PP轉(zhuǎn)變?yōu)镸A和/或?qū)PP轉(zhuǎn)變?yōu)镠MA。Choroba等(2000，J.Am.Chem.Soc.，122(22)5389-90)描述了用稱為p-HmaS的酶將HPP轉(zhuǎn)化為HMA。
使用單個(gè)酶將HPP或PP轉(zhuǎn)化為HMA或MA的優(yōu)勢(shì)在于在進(jìn)行相同的整體轉(zhuǎn)化時(shí)，單個(gè)酶的克隆和體內(nèi)活性確定通常比多個(gè)酶的克隆和活性確定容易。
另一方面，按照本發(fā)明的微生物以一系列反應(yīng)將PP轉(zhuǎn)變?yōu)镸A和/或?qū)PP轉(zhuǎn)化為HMA，所述反應(yīng)包括由PP或HPP分別例如轉(zhuǎn)化為苯乙醛或?qū)αu基苯乙醛、再分別轉(zhuǎn)化為乙酸苯酯或?qū)αu基乙酸苯酯、再分別轉(zhuǎn)化為MA或HMA的反應(yīng)。相信該系列反應(yīng)是一條可能的代謝途徑，因?yàn)镵rings等(1996，Journal of Biotechnology，51123-129))在擔(dān)子菌的苯丙氨酸降解中觀察到該途徑。
按照本發(fā)明的微生物，不考慮其生產(chǎn)HMA或MA的途徑，分別通過扁桃酸脫氫酶和/或?qū)αu基扁桃酸脫氫酶的酶活性將MA轉(zhuǎn)化為PGL和/或?qū)MA轉(zhuǎn)化為HPGL?；蛘?，所述微生物分別通過氧依賴性扁桃酸氧化酶和/或氧依賴性對(duì)羥基扁桃酸氧化酶的酶活性將MA轉(zhuǎn)化為PGL和/或?qū)MA轉(zhuǎn)化為HPGL。按照本發(fā)明的微生物還能夠通過立體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)氨酶的作用將HPGL和PGL分別轉(zhuǎn)化為D-HPG和D-PG。
本發(fā)明還涉及通過在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組細(xì)胞，并由培養(yǎng)液或微生物自身獲得產(chǎn)物，產(chǎn)生D-(H)PG。
本發(fā)明還涉及能夠分泌可檢測(cè)量的D-HPG和/或D-PG并包含酶編碼基因的重組微生物(即重組細(xì)胞)，其中所述酶在單一步驟中和/或通過組合和序貫作用催化HPP轉(zhuǎn)變?yōu)镠MA和/或PP轉(zhuǎn)變?yōu)镸A、HMA轉(zhuǎn)變?yōu)镠PGL和/或MA轉(zhuǎn)變?yōu)镻GL，以及HPGL轉(zhuǎn)變?yōu)镈-HPG和/或PGL轉(zhuǎn)變?yōu)镈-PG，最后一步由立體轉(zhuǎn)化D-氨基轉(zhuǎn)移酶作用催化。
值得注意的是，Wiyakrutta和Meevootisom(1997，Journal ofBiotechnology，55193-203)描述了使用立體轉(zhuǎn)化氨基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)D-PG和D-HPG。但是，他們未考慮全細(xì)胞發(fā)酵法。相反，這些作者提及使用純化酶的反應(yīng)。此外，Taylor等(1998，TIBTECH，16412-418)提及PGL和HPGL離析物與終產(chǎn)物D-PG和D-HPG的價(jià)值相比非常昂貴。因此，這些參考文獻(xiàn)未提出立體轉(zhuǎn)化氨基轉(zhuǎn)移酶對(duì)生產(chǎn)D-HPG或D-PG的任何切實(shí)可行的應(yīng)用。
而且，應(yīng)該預(yù)期到的是，將HPGL或PGL的發(fā)酵途徑和立體轉(zhuǎn)化D-氨基轉(zhuǎn)移酶的體內(nèi)酶活性組合在一起限制了成功的機(jī)會(huì)，因?yàn)楦鱾€(gè)酶的最優(yōu)pH不匹配。據(jù)報(bào)道大腸桿菌細(xì)胞的胞內(nèi)pH在7.4-7.8的范圍內(nèi)(Neidhardt等，1996，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，Cellularand molecular biology，第1卷，96章，1539頁(yè)，ASM Press，Washington，D.C.)。但是，據(jù)Wiyakrutta和Meevootisom(參見上文)報(bào)道，立體轉(zhuǎn)化氨基轉(zhuǎn)移酶的最優(yōu)pH為9-10，于中性pH時(shí)活性非常低。因此，人們預(yù)期立體轉(zhuǎn)化氨基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌細(xì)胞中的體內(nèi)活性不足以有效生產(chǎn)D-HPG或D-PG。
除了最優(yōu)pH不匹配之外，當(dāng)不同生物的酶在宿主細(xì)胞中組合成新代謝途徑時(shí)還可預(yù)見到其它幾個(gè)問題。新引入酶的親和性可能與胞內(nèi)代謝物濃度非常不同。而且，外源酶的穩(wěn)定性可能由于外源蛋白對(duì)胞內(nèi)蛋白酶的高度敏感性而非常低。新構(gòu)建途徑的中間體自身可能不穩(wěn)定或被宿主細(xì)胞原有酶代謝。正確翻譯的氨基酸鏈的不合適折疊或可能阻礙外源酶有效功能性表達(dá)的密碼子選擇差異也可以引起外源酶功能性表達(dá)的問題。
盡管預(yù)計(jì)在構(gòu)建新代謝途徑時(shí)有眾多問題，但令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)以本發(fā)明方法通過重組微生物可以生產(chǎn)D-HPG和D-PG。
最后，本發(fā)明還涉及包含至少一種基因的重組質(zhì)粒，所述基因序列對(duì)應(yīng)于本申請(qǐng)下文公開的[SEQ IDNO.9]和/或[SEQ IDNO.15]和/或[SEQ IDNO.21]中的任一種，或者與這些序列中的任一種至少80％、優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％同源的同源序列。
在以下實(shí)施例描述過程中，本發(fā)明的其它特征將更會(huì)顯而易見。
一般方法標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)如質(zhì)粒DNA分離、凝膠電泳、核酸的酶促限制修飾、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等，都按照Sambrook等，1989，“MolecularCloninga laboratory manual”，Cold spring Harbor Laboratories，ColdSpring Harbor，NY所述實(shí)施。合成寡脫氧核苷酸得自MWG-BiotechAG(Ebersberg，Germany)、Sigma-Genosys(The Woodlands，TX，USA)和LifeTechnologies(Paisley，Scotland，UK)。DNA序列分析使用染料標(biāo)記雙脫氧終止子的鏈終止法， 由BaseClear(Leiden，TheNetherlands)、GATC Biotech AG(Konstanz，Germany)和Johns HopkinsUniversity School of Medicine Biosynthesis and Sequencing Facility(Baltimore，MD，USA)進(jìn)行。粗提物的蛋白濃度用Bradford試劑按照供應(yīng)商的說明于595nm(Roth，Karlsruhe，Germany)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)部分I(實(shí)施例1-19)編碼活性的相關(guān)單個(gè)基因的克隆和確定實(shí)施例1構(gòu)建質(zhì)粒pBAD-Ao-HmaS、pBAD-Ao-HmaO、pBAD-Sc-HmaS、pBAD-Sc-HmaO東方諾卡氏菌(Amycolatopsis orientalis)NRRL 18098(美國(guó)專利第5,843,437號(hào))得自ARS(農(nóng)業(yè)研究局)專利培養(yǎng)物保藏中心，Peoria，Illinois，USA。
在1％葡萄糖、0.5％酵母提取物(Difco，Detroit，Michigan，USA)、2％淀粉、0.1％酪蛋白氨基酸(Difco)、NaOH調(diào)節(jié)至pH7.5的溶液中于28℃培養(yǎng)東方諾卡氏菌。在含3g/l酵母提取物(Difco)、5g/l蛋白胨(Difco)、3g/l麥芽提取物(Oxoid，Basingstoke，UK)、10g/l葡萄糖、340g/l蔗糖的YE-ME培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)John Innes Institute，Norwich(UK)的M.J.Bibb教授惠贈(zèng)的天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)(Streptomyces coelicolor)。滅菌后加入10g/l甘氨酸和5mM MgCl2。
通過鹽析法(Pospiech and Neumann，1995，Trends Genet.11217-218)分離東方諾卡氏菌和天藍(lán)色鏈霉菌的基因組DNA。
將天藍(lán)色鏈霉菌和東方諾卡氏菌的HmaS和HmaO基因克隆在表達(dá)載體pBAD/Myc-HisC(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中。通過翻譯起始(ATG)融合和利用其原有的終止密碼子克隆基因。1.1構(gòu)建質(zhì)粒pBAD-Ao-HmaS使用以下引物5′-GTCCACGGTCTCCCATGCAGAATTTCGAGAT-3′[SEQ IDNo.1](下劃線為Bsa I識(shí)別切割位點(diǎn))和5′-ACATCCCAAGCTTCACGTTCGAGGTC-3′[SEQ IDNo.2](下劃線為Hind III切割位點(diǎn))，通過PCR由東方諾卡氏菌NRRL 18098染色體DNA(保藏號(hào)AJ223998的核苷酸14957-16030；擴(kuò)增區(qū)為核苷酸14957-16060)擴(kuò)增含對(duì)羥基扁桃酸合酶可讀框(ORF)的1131bp片段。
本申請(qǐng)上下文中使用的所有寡核苷酸序列表見本文附件4。
通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小，并由該凝膠純化所述片段。用酶Bsa I和Hind III消化所述片段，以產(chǎn)生粘性末端。用Nco I和Hind III消化質(zhì)粒pBAD/Myc-HisC。隨后連接兩種片段，并用于轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌Top10細(xì)胞(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。將顯示正確插入序列(通過測(cè)序確定)的質(zhì)粒命名為pBAD-Ao-HmaS，該質(zhì)粒按照布達(dá)佩斯條約已于2000年10月23日保藏于Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen，Braunschweig，Germany(DSMZ)，保藏號(hào)為DSM 13786，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。1.2構(gòu)建質(zhì)粒pBAD-Ao-HmaO使用以下引物5′-CGCTCGGTCATGACGTACGTTTCCCTG-3′[SEQ IDNo.3](下劃線為BspH I切割位點(diǎn))和5′-ACGAAGAAGCTTATCAAACAACCCCCAG-3′[SEQ IDNo.4](下劃線為Hind III切割位點(diǎn))，通過PCR由東方諾卡氏菌NRRL 18098染色體DNA(保藏號(hào)AJ223998的核苷酸16027-17100；擴(kuò)增區(qū)為核苷酸16027-17101)擴(kuò)增含對(duì)羥基扁桃酸氧化酶ORF的1096bp片段。
通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小，并由該凝膠純化所述片段。
用酶BspH I和Hind III消化所述片段，用Nco I和Hind III消化質(zhì)粒pBAD/Myc-HisC。連接兩種片段，并引入大腸桿菌Top10細(xì)胞。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。將顯示正確插入序列(通過測(cè)序確定)的質(zhì)粒稱作pBAD-Ao-HmaO，該質(zhì)粒按照布達(dá)佩斯條約已于2000年10月23日保藏于DSMZ，保藏號(hào)為DSM13791，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。1.3構(gòu)建質(zhì)粒pBAD-Sc-HmaS使用以下引物5′-ATGCCGCCCAGTGACATCGCGTACGC-3′[SEQ IDNo.5]和5′-CCCTCGGTACCAGGTCATCGGCCGGCCACTTCC-3′[SEQ IDNo.6](下劃線為Kpn I限制位點(diǎn))，通過PCR由天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)菌株M145染色體DNA(由保藏號(hào)AL035640的核苷酸1418-2533編碼；擴(kuò)增區(qū)為核苷酸1415-2494)擴(kuò)增含對(duì)羥基扁桃酸合酶ORF的1091bp片段。
通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小，并由該凝膠純化所述片段。按照Dietmaier等(1993，Nucleic Acids Res.21，3603-3604)所述將擴(kuò)增片段克隆入載體pBAD/Myc-HisC的Nco I/Kpn I位點(diǎn)。
通過電穿孔將獲得的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Top10細(xì)胞中。在含100mg/l羧芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。
收集所有由轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的菌落，并將獲得的細(xì)胞懸浮液用于質(zhì)粒DNA分離。用Hind III消化總質(zhì)粒DNA，并在瓊脂糖凝膠上分離。由凝膠中分離出線性形式的為目標(biāo)質(zhì)粒的5kb DNA片段，再連接并通過電穿孔導(dǎo)入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌Top10細(xì)胞中。
在含100mg/l羧芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。
顯示正確插入序列(通過測(cè)序確定)的質(zhì)粒稱作pBAD-Sc-HmaS，該質(zhì)粒按照布達(dá)佩斯條約于2000年10月23日保藏于DSMZ，保藏號(hào)為DSM13790，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。1.4構(gòu)建質(zhì)粒pBAD-Sc-HmaO使用以下引物5′-ATGCGGGAGCCGCTCACGCTCGAC-3′[SEQIDNo.7]和5′-CCAACTGGTACCTGGTCATCCGTGGCTCCTGTCTCG-3′[SEQIDNo.8](下劃線為Kpn I限制位點(diǎn))，通過PCR由天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)菌株M145染色體DNA(保藏號(hào)AL035640的核苷酸135-1268；擴(kuò)增區(qū)為核苷酸132-1267)擴(kuò)增含對(duì)羥基扁桃酸氧化酶ORF的1149bp片段。
通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小，并由該凝膠純化所述片段。按照Dietmaier等(1993，Nucleic Acids Res.21，3603-3604)所述將擴(kuò)增片段克隆入載體pBAD/Myc-HisC的Nco I/Kpn I位點(diǎn)，隨后將將獲得的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Top10細(xì)胞中。在含100mg/l羧芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。
分離所有轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA，用Hind III消化，并在瓊脂糖凝膠上分離。由凝膠中分離出線性形式的為目標(biāo)質(zhì)粒的5.2kb DNA片段，再連接并導(dǎo)入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌Top10細(xì)胞中。在含100mg/l羧芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。
顯示正確插入序列(通過測(cè)序確定)的質(zhì)粒稱作pBAD-Sc-HmaO，該質(zhì)粒按照布達(dá)佩斯條約已于2000年10月23日保藏于DSMZ，保藏號(hào)為DSM 13789，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。實(shí)施例2由東方諾卡氏菌和天藍(lán)色鏈霉菌表達(dá)對(duì)羥基扁桃酸合酶和對(duì)羥基扁桃酸氧化酶在含100mg/l羧芐青霉素的50ml LB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒pBAD-Ao-HmaS或pBAD-Sc-HmaS(對(duì)于對(duì)羥基扁桃酸合酶)和質(zhì)粒pBAD-Ao-HmaO或pBAD-Sc-HmaO(對(duì)于對(duì)羥基扁桃酸氧化酶)的大腸桿菌Top10菌株的單菌落。于OD620nm為1.2時(shí)加入0.002％(終濃度)阿拉伯糖誘導(dǎo)所述細(xì)胞。3.5小時(shí)后收獲細(xì)胞，并用pH7.4的1mM MgSO4清洗。于-20℃冷凍等份的清洗細(xì)胞待以后使用。作為對(duì)照，相應(yīng)地處理攜帶質(zhì)粒pBAD/Myc-HisC的大腸桿菌Top10。
臨用前用pH7.5的200mM磷酸鉀緩沖液超聲處理制備粗提物。實(shí)施例3分析東方諾卡氏菌和天藍(lán)色鏈霉菌的對(duì)羥基扁桃酸合酶3.1對(duì)對(duì)羥基丙酮酸苯酯的活性3ml的測(cè)定混合物包含200mM磷酸鉀緩沖液pH7.5、5mM對(duì)羥基丙酮酸苯酯、10％乙醇(使用50mM對(duì)羥基丙酮酸苯酯母液的96％乙醇溶液)、44mM抗壞血酸鹽、0.3mM FeSO4和至終濃度為0.6mg/ml可溶性蛋白的無細(xì)胞提取物。對(duì)照實(shí)驗(yàn)使用煮沸的提取物。
通過加入HPP開始測(cè)定，于28℃1小時(shí)后通過加入0.1ml 1N HCl至0.5ml等份的反應(yīng)系統(tǒng)中終止測(cè)定。通過HPLC分析樣品并于215nm檢測(cè)。使用Nucleosil-120-5-C18柱(250×4mm，Macherey-Nagel，Düren，Germany)。用洗脫液A(50mM H3PO4)和洗脫液B(100％甲醇)洗脫該柱。梯度0-5分鐘，0％ B；5-37分鐘，0％-90％ B；37-42分鐘，90％ B；42-50分鐘，90％-0％ B；50-55分鐘，0％ B。流速為1.0ml/分鐘，柱溫設(shè)定在30℃。
得自大腸桿菌/pBAD-Ao-HmaS的無細(xì)胞提取物在1小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)65mg/l的對(duì)羥基扁桃酸，而得自大腸桿菌/pBAD-Sc-HmaS的提取物生產(chǎn)35.6mg/l的對(duì)羥基扁桃酸。對(duì)照實(shí)驗(yàn)(大腸桿菌/pBAD/Myc-HisC的粗提物和煮沸的提取物)未產(chǎn)生對(duì)羥基扁桃酸。3.2對(duì)丙酮酸苯酯活性3ml的測(cè)定混合物包含200mM磷酸鉀緩沖液pH7.5、5mM丙酮酸苯酯、44mM抗壞血酸鹽和0.3mM FeSO4以及終濃度為0.6mg/ml可溶性蛋白的無細(xì)胞提取物。
通過加入無細(xì)胞提取物于28℃開始測(cè)定，通過加入0.1ml 1NHCl至0.5ml等份的反應(yīng)系統(tǒng)中終止測(cè)定。如上所述通過HPLC分析樣品。煮沸的提取物和大腸桿菌/pBAD/Myc-HisC的粗提物都用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
使用得自大腸桿菌/pBAD-Ao-HmaS的無細(xì)胞提取物在1小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)63mg/l的扁桃酸。得自大腸桿菌/pBAD-Sc-HmaS的無細(xì)胞提取物在6小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)25mg/l的扁桃酸。對(duì)照實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到扁桃酸。實(shí)施例4分析東方諾卡氏菌和天藍(lán)色鏈霉菌的對(duì)羥基扁桃酸氧化酶4.1對(duì)D，L-對(duì)羥基扁桃酸的活性將含0.5-0.8mg蛋白的100μl粗提物與總體積1ml的200mM磷酸鉀緩沖液pH7.5、2mM D，L-對(duì)羥基扁桃酸、20mg/l過氧化氫酶溫育。用分光光度計(jì)于340nm監(jiān)測(cè)對(duì)羥基扁桃酸的氧化。為消除對(duì)羥基扁桃酸的非特異性氧化，使用沒有無細(xì)胞提取物的測(cè)定混合物進(jìn)行對(duì)照測(cè)定。
大腸桿菌Top10/pBAD-Sc-HmaO提取物的比活為30nmol/分鐘/mg總蛋白，而大腸桿菌Top10/pBAD-Ao-HmaO的比活為5nmol/分鐘/mg總蛋白。4.2對(duì)(S)-或(R)-扁桃酸的活性3ml測(cè)定混合物包含100mM磷酸鉀緩沖液pH7.5、2mM(S)-或(R)-扁桃酸、20mg/l過氧化氫酶以及終濃度為0.6mg/ml可溶性蛋白的無細(xì)胞提取物。
通過加入無細(xì)胞提取物開始測(cè)定，并通過向0.5ml等份的反應(yīng)系統(tǒng)中加入0.1ml 1N HCl終止測(cè)定。以實(shí)施例3的方法通過HPLC分析樣品。對(duì)照實(shí)驗(yàn)使用煮沸的提取物。
使用(R)-扁桃酸作為底物，得自大腸桿菌/pBAD-Ao-HmaO或大腸桿菌/pBAD-Sc-HmaO的無細(xì)胞提取物未生產(chǎn)苯乙醛酸。用(S)-扁桃酸作為底物，使用大腸桿菌/pBAD-Ao-HmaO的無細(xì)胞提取物在1小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)9mg/l的苯乙醛酸，而用得自大腸桿菌/pBAD-Sc-HmaO的無細(xì)胞提取物在1小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)27mg/ml的苯乙醛酸。實(shí)施例5構(gòu)建質(zhì)粒pMAL-Nu-HmaS和pMAL-Nu-HmaO由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA，USA)獲得均勻諾卡氏菌津山亞種(Nocardia uniformis subsp.tsuyamanensis)ATCC21806。培養(yǎng)均勻諾卡氏菌津山亞種，按照J(rèn).Biol.Chem.1998，273，30695-30703所述分離基因組DNA。將基因及其原有終止密碼子克隆入pMAL-c2表達(dá)載體(New England BioLabs，Beverly，MA，USA)，獲得麥芽糖結(jié)合蛋白融合蛋白。還將HmaS克隆入pET-29b(Novagen，Madison，WI，USA)作為C-末端His-6標(biāo)記融合體。5.1構(gòu)建質(zhì)粒pMAL-Nu-HmaS使用以下引物5′AGAATTCGCGGCACAGGCAGGCAGCG-3′[SEQ IDNo.11](下劃線為EcoRI切割位點(diǎn))和5′-TTATAAGCTTTCAGCGCTCGGTCCGGTGGC-3′[SEQ IDNo.12](下劃線為Hind III切割位點(diǎn))，通過PCR由均勻諾卡氏菌津山亞種染色體DNA(附件1給出的SEQ IDNo.9的核苷酸52-1086，編碼SEQ IDNo.10的蛋白；擴(kuò)增區(qū)為核苷酸55-1089)擴(kuò)增含對(duì)羥基扁桃酸合酶可讀框(ORF)的1052bp片段。
通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小，并由該凝膠純化所述片段。用EcoR I和Hind III消化所述片段。用EcoR I和Hind III消化質(zhì)粒pMAL-c2，隨后連接兩種片段，并通過電穿孔轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TB1細(xì)胞(New England BioLabs，Beverly，MA，USA)。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。將顯示正確插入序列(通過測(cè)序確定)的質(zhì)粒命名為pMAL-Nu-HmaS，該質(zhì)粒按照布達(dá)佩斯條約已于2000年10月27日保藏于ATCC，專利保藏物名稱為PTA-2639，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。5.2構(gòu)建質(zhì)粒DET-Nu-HmaS使用以下引物5′-TATACCATGGCGGCACAGGCAGGC-3′[SEQIDNo.13](下劃線為Nco I切割位點(diǎn))和5′-TTATAAGCTTGCGCTCGGTCCGGTGGC-3′[SEQ IDNo.14](下劃線為Hind III切割位點(diǎn))，通過PCR由均勻諾卡氏菌津山亞種染色體DNA(附件1給出的SEQ IDNo.9的核苷酸52-1086，編碼SEQ IDNo.10的蛋白；擴(kuò)增區(qū)為核苷酸52-1086)擴(kuò)增含對(duì)羥基扁桃酸合酶可讀框(ORF)的1051bp片段。
通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小，并由該凝膠純化所述片段。用Nco I和Hind III消化所述片段。用Nco I和Hind III消化質(zhì)粒pET-29b，隨后連接兩種片段，并通過電穿孔轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Novagen，Madison，WI，USA)中。在含50mg/l卡那霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。將顯示正確插入序列(通過測(cè)序確定)的質(zhì)粒命名為pET-Nu-HmaS，該質(zhì)粒按照布達(dá)佩斯條約已于2000年10月27日保藏于ATCC，專利保藏物命名號(hào)為PTA-2638，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。5.3構(gòu)建質(zhì)粒pMAL-Nu-HmaO使用以下引物5′-AGAATTCGGCGTCCGCAACTCCGCAG-3′[SEQ IDNo.17](下劃線為EcoR I切割位點(diǎn))和5′-AATAAGCTTTCAGGGCGCACCTCGCC-3′[SEQ IDNo.18](下劃線為Hind III限制位點(diǎn))，通過PCR由均勻諾卡氏菌染色體DNA(附件2給出的SEQ IDNo.15的核苷酸50-1177，編碼SEQ IDNo.16的蛋白；擴(kuò)增區(qū)為核苷酸53-1180)擴(kuò)增含對(duì)羥基扁桃酸氧化酶ORF的1144bp片段。
通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小，并由該凝膠純化所述片段。用EcoR I和Hind III消化所述片段和質(zhì)粒pMAL-c2。連接兩種片段，并通過電穿孔轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TB1細(xì)胞。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。將顯示正確插入序列(通過測(cè)序確定)的質(zhì)粒命名為pMAL-Nu-HmaO，該質(zhì)粒按照布達(dá)佩斯條約已于2000年10月27日保藏于ATCC，專利保藏物命名號(hào)為PTA-2637，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。實(shí)施例6由均勻諾卡氏菌制備對(duì)羥基扁桃酸合酶和對(duì)羥基扁桃酸氧化酶6.1對(duì)羥基扁桃酸合酶(第一種方法)和對(duì)羥基扁桃酸氧化酶的表達(dá)用含100mg/l氨芐青霉素的100ml LB培養(yǎng)基(+0.02％葡萄糖)于37℃培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒pMAL-Nu-HmaS或pMAL-Nu-HmaO的大腸桿菌TB1菌株的單菌落。于OD600nm為0.6時(shí)加入0.3mM(終濃度)的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)所述細(xì)胞。3小時(shí)后收獲細(xì)胞，并重懸浮在緩沖液(HmaO為20mM Tris-HCl pH7.4、200mM NaCl、1mMEDTA，而HmaS為20mM Tris-HCl pH7.5、10mM EDTA、1％ TritonX-100)中，于-20℃冷凍待以后使用。作為對(duì)照，同樣地處理含質(zhì)粒pMAL-c2的大腸桿菌TB1細(xì)胞。6.2對(duì)羥基扁桃酸合酶(第一種方法)和對(duì)羥基扁桃酸氧化酶的純化在臨使用前通過超聲處理制備重懸浮沉淀的粗提物。通過離心去除提取物中的不溶性細(xì)胞碎片，將獲得的無細(xì)胞提取物上樣于直鏈淀粉樹脂柱。通過用含10mM麥芽糖的緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.4、200mM NaCl、1mM EDTA)洗脫獲得純度≥80％的目的蛋白。將部分純化的提取物用于進(jìn)一步的研究。6.3對(duì)羥基扁桃酸合酶的表達(dá)(第二種方法)用含50mg/l卡那霉素的100ml LB培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒pET-Nu-HmaS的大腸桿菌BL21(DE3)菌株的單菌落。于OD600nm為0.6時(shí)加入1mM(終濃度)的IPTG誘導(dǎo)所述細(xì)胞。4小時(shí)后收獲細(xì)胞，并重懸浮在緩沖液(50mM磷酸鈉pH8、300mM NaCl、10mM咪唑)中，于-20℃冷凍待以后使用。6.4對(duì)羥基扁桃酸合酶的純化(第二種方法)在臨使用前通過超聲處理制備粗提物。通過離心去除提取物中的不溶性細(xì)胞碎片，將獲得的無細(xì)胞提取物分批與Ni-NTA樹脂(Qiagen，Valencia，CA，USA)以200rpm溫育1小時(shí)。將CFE-樹脂漿傾注到柱中，通過用含濃度遞增的咪唑的緩沖液(50mM磷酸鈉pH8、300mM NaCl)洗脫獲得純度≥90％的目的蛋白。將部分純化的提取物用于進(jìn)一步的研究。實(shí)施例7均勻諾卡氏菌對(duì)羥基扁桃酸合酶活性0.4ml測(cè)定混合物包含50mM Tris-HCl緩沖液pH8.0、5mM對(duì)羥基丙酮酸苯酯、0.7％乙醇(使用50mg/ml對(duì)羥基丙酮酸苯酯母液)、0.5mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.1mM抗壞血酸鹽、0.025mM FeSO4和部分純化的HmaS。通過加入HmaS開始測(cè)定，于30℃1小時(shí)后通過于100℃熱失活5分鐘終止測(cè)定。通過離心去除變性蛋白，在用HmaO的相應(yīng)測(cè)定中使用0.35ml的反應(yīng)系統(tǒng)。該測(cè)定通過加入0.1mg/ml的HmaO開始，并根據(jù)對(duì)羥基扁桃酸氧化為HPGL而觀測(cè)332nm的吸光度增加。對(duì)照實(shí)驗(yàn)未產(chǎn)生HPGL。實(shí)施例8均勻諾卡氏菌對(duì)羥基扁桃酸氧化酶活性0.5ml測(cè)定混合物包含50mM Tris-HCl緩沖液pH8.0和2mM(R，S)-對(duì)羥基扁桃酸。加入終濃度為0.1mg/ml的部分純化的HmaO開始測(cè)定。用分光光度計(jì)于332nm監(jiān)測(cè)對(duì)羥基苯乙醛酸(HPGL)的形成。在沒有底物時(shí)未觀測(cè)到HPGL形成。HmaO比活測(cè)定為240μmol/分鐘/mg。
在使用由均勻諾卡氏菌純化的野生型酶的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，所述氧化酶顯示出黃素依賴性和(S)-扁桃酸特異性。實(shí)施例9構(gòu)建質(zhì)粒pGEM-mdlB和pGEM-Bldm惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)ATCC 12633得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA，USA)。用LB培養(yǎng)基(10g/l胰蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l NaCl)于28℃培養(yǎng)惡臭假單胞菌。在過夜培養(yǎng)后使用Ausubel等(1990，Current Protocols in MolecularBiology，第2、3、4章，1-9步，Whiley-Interscience，New York)描述的標(biāo)準(zhǔn)方法分離這種惡臭假單胞菌菌株的基因組DNA。用RNA酶(20mg/l)處理粗染色體DNA，隨后用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)處理，以去除蛋白。
使用Taq DNA-聚合酶以及以下引物5′-ACTCGCCAAGGGCTATGGTGTCC-3′[SEQ IDNo.19]和5′-GCCAACAGTTCCAACAGCGGTGTG-3′[SEQ IDNo.20]，通過PCR由惡臭假單胞菌ATCC 12633染色體DNA(由保藏號(hào)J05293的核苷酸2251-3432編碼；擴(kuò)增區(qū)為核苷酸2110-3518)擴(kuò)增含(S)-扁桃酸脫氫酶ORF的1409bp片段。
通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小。
將擴(kuò)增片段克隆入載體pGEM-T(Promega，Madison，Wisconsin，USA)，以其轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue MRF′(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。
對(duì)4種不同克隆的插入片段測(cè)序，結(jié)果揭示全部克隆都以GC代替了位置2291/2292的CG。其中一個(gè)沒有其它突變的克隆命名為pGEM-Bldm，按照布達(dá)佩斯條約已于2000年10月23日保藏于DSMZ，保藏號(hào)DSM 13787。該原始保藏物已錯(cuò)誤地命名為pGEM-mdlB，但正確地應(yīng)命名為pGEM-Bldm，將該保藏物用于進(jìn)一步的克隆實(shí)驗(yàn)。另一個(gè)克隆具有一個(gè)另外的沉默突變，命名為pGEM-mdlB，用于證實(shí)目的活性。要指出的是，在所述后一種質(zhì)粒中，扁桃酸脫氫酶基因的方向與載體攜帶的lac啟動(dòng)子的方向相匹配。實(shí)施例10由惡臭假單胞菌表達(dá)(S)-扁桃酸脫氫酶用含100mg/l羧芐青霉素和1mM IPTG的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌XL-1 MRF′/pGEM-mdlB。于37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，離心收獲細(xì)胞，并重懸浮在50mM磷酸鉀緩沖液pH6.8中。通過超聲處理破碎細(xì)胞，離心(5,000g，10分鐘，4℃)去除未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。最后，通過超離心步驟(1小時(shí)，200.000g，4℃)收集細(xì)胞膜，然后重懸浮在4ml 50mM磷酸鉀緩沖液pH6.8中，并保存在冰上。
通過改良Lowry蛋白測(cè)定法(Sandermann and Strominger，1972，J.Biol.2475123-5131)測(cè)定細(xì)胞膜蛋白濃度，在所述測(cè)定中向Lowry試劑A中加入1％SDS。細(xì)胞膜部分包含約1mg/ml的蛋白。實(shí)施例11(S)-扁桃酸脫氫酶活性證明利用Hegeman法(1996，J.Bacteriol.911140-1154)，使用2，6-二氯苯酚-靛酚作為受體染料以分光光度計(jì)測(cè)定(S)-扁桃酸脫氫酶活性。使用(S)-或(R)-扁桃酸作為底物檢測(cè)(S)-扁桃酸脫氫酶的立體選擇性。而且還分析(S)-扁桃酸脫氫酶是否也可以把羥基扁桃酸作為底物。
用(S)-扁桃酸和(R，S)-對(duì)羥基扁桃酸作為底物，大腸桿菌XL-1MRF′/pGEM-mdlB的細(xì)胞膜部分600nm的吸光度在5分鐘內(nèi)產(chǎn)生可檢測(cè)的變化。用(R)-扁桃酸未觀測(cè)到吸光度變化。實(shí)施例12分離D-對(duì)羥基苯基甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶(HpgAT)基因由惡臭假單胞菌NCIMB 12565(國(guó)立工業(yè)和海洋微生物保藏中心，Aberdeen，Scotland，UK)分離D-對(duì)羥基苯基甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因。使用Ausubel等(1990，Current Protocols in Molecular Biology，第2、3、4章，1-9步，Whiley-Interscienc，New York)描述的標(biāo)準(zhǔn)方法由指數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞(OD620nm1.9)提取DNA。用RNA酶(20mg/l)處理粗染色體DNA，隨后用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)處理，以去除蛋白。然后用Sau3A I部分消化染色體DNA。將消化的DNA上0.6％的瓊脂糖凝膠，分離出4-10kb大小的DNA片段。
按照Invitrogen的方法通過用BamHI消化1μg pZErO-2(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)制備載體DNA。
用T4 DNA連接酶連接載體DNA和惡臭假單胞菌染色體DNA片段。連接混合物用于轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌Top10細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化體平板接種在含50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上。總共獲得5000個(gè)菌落，它們構(gòu)成原始基因文庫(kù)。將全部5000個(gè)菌落倒入補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。加入甘油至終濃度為15％后，將原始基因庫(kù)以1ml等份儲(chǔ)存于-80℃。
在微量滴定板中用150μl補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基制備1800個(gè)菌落的培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物于28℃過夜培養(yǎng)，用Eppendorf5804R離心機(jī)(Eppendorf，Hamburg，Germany)離心收獲培養(yǎng)物。用50mM KPO4緩沖液pH7.0清洗細(xì)胞，并重懸浮在180μl反應(yīng)混合物(100mM磷酸鉀pH7.0、15mM α-酮戊二酸鹽、0.1mM吡哆醛磷酸和0.5％v/v Triton X-100)中。
通過加入D-對(duì)羥基苯基甘氨酸至終濃度為5mM開始反應(yīng)。使用Optimax微量滴定板讀數(shù)器(Molecular Devices，Sunnyvale，California，USA)監(jiān)測(cè)20分鐘內(nèi)每個(gè)孔的OD340nm。相應(yīng)地處理陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10)和陽(yáng)性對(duì)照(惡臭假單胞菌NCIMB12565)。
在篩選的1800個(gè)克隆中，一個(gè)克隆由于形成HPGL而顯示相對(duì)于陰性對(duì)照OD340m顯著增加。該克隆包含的惡臭假單胞菌D-HpgAT基因位于一個(gè)12kb質(zhì)粒pZErOTagp上。對(duì)pZErOTagp測(cè)序顯示出D-HpgAT基因的完整核苷酸序列。如附件3所示，[SEQ IDNo.21，編碼SEQ IDNo.22的蛋白]的核苷酸51-1376列出了該基因序列。實(shí)施例13構(gòu)建質(zhì)粒pBAD-HpgAT使用PCR將惡臭假單胞菌D-對(duì)羥基苯基甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因亞克隆入pBAD/Myc-HisC。使用5′-GTGCACGGTCTCGCATGTCTATTTATAGCGATTATGAACGTAAAAC-3′[SEQ IDNo.23]和5′-GTGCACGGTCTCCTCGAGTTAGCCCAGGAGGTTTTCTTCAGC-3′[SEQ IDNo.24]作為引物(下劃線為BsaI識(shí)別切割位點(diǎn))，使用惡臭假單胞菌NCIMB 12565染色體DNA作為模板，擴(kuò)增HpgAT ORF。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小(1361bp)。
用BsaI消化所述片段。用XhoI和NcoI消化載體pBAD/Myc-HisC。用T4 DNA連接酶連接純化的消化pBAD/Myc-HisC載體和消化的插入DNA。
用重組質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10細(xì)胞，并平板接種在補(bǔ)加100mg/l羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。
進(jìn)行菌落PCR，并在有或沒有0.002％阿拉伯糖作為誘導(dǎo)物的情況下，用補(bǔ)加100mg/l羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)8個(gè)PCR陽(yáng)性菌落以及大腸桿菌Top10/pBAD/Myc-HisC(陰性對(duì)照)。收獲細(xì)胞，并按實(shí)施例12所述測(cè)試細(xì)胞的HpgAT活性。在阿拉伯糖作為誘導(dǎo)物的情況下，全部8個(gè)菌落都顯示出HpgAT活性。在這些菌落中，有一個(gè)菌落攜帶顯示正確插入序列(通過測(cè)序確定)的質(zhì)粒，該菌落命名為大腸桿菌pBAD-HpgAT，按照布達(dá)佩斯條約于2000年10月23日保藏于Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen，Braunschweig，Germany(DSMZ)，保藏號(hào)為DSM 13788。實(shí)施例14制備無細(xì)胞提取物用補(bǔ)加阿拉伯糖(0.002％)和羧芐青霉素(100mg/l)的LB培養(yǎng)基于28℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌Top10/pBAD-HpgAT。離心收獲細(xì)胞，通過超聲處理然后離心由懸浮液(1g細(xì)胞+7ml 50mM KPO4pH7.0)制備無細(xì)胞提取物。實(shí)施例15.aD-HpgAT對(duì)對(duì)羥基苯乙醛酸的活性用小玻璃管于20℃溫育3ml反應(yīng)混合物，該混合物含有100mM磷酸鉀緩沖液pH7.0、60mM L-谷氨酸、0.1mM磷酸吡哆醛和無細(xì)胞提取物(0.27mg蛋白，實(shí)施例14)。該混合物在340nm的分光光度計(jì)活性檢測(cè)中用作空白。通過向反應(yīng)混合物中加入對(duì)羥基苯乙醛酸(0.67mM終濃度)開始反應(yīng)。該反應(yīng)20℃的最大比活為110nmole/分鐘/mg蛋白。實(shí)施例15.bD-HpgAT對(duì)D-PG和D-HPG的活性于30℃溫育4ml反應(yīng)混合物，該混合物含有100mM磷酸鉀緩沖液pH8.0、15mMα-酮戊二酸、0.1mM磷酸吡哆醛和無細(xì)胞提取物(0.01mg蛋白，實(shí)施例14)。通過加入底物D-PG(4mM)開始測(cè)定。以一定的時(shí)間間隔吸取1ml等份并轉(zhuǎn)移至0.4ml 1M H3PO4，以終止反應(yīng)。通過HPLC分析樣品(Astec Chirobiotic T 250mm×4.6mm 5μm柱，Advanced Separation Technologies，Whippany，NJ，20μl注樣體積，柱溫22℃、1.0ml/分鐘80％15mM乙酸銨pH4.1和20％甲醇，于215nm檢測(cè))。在20分鐘內(nèi)，7％的D-PG轉(zhuǎn)化為苯乙醛酸，而在用D-HPG作為底物的相似實(shí)驗(yàn)中，12％的D-HPG轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)羥基苯乙醛酸。實(shí)施例16D-HpgAT的最優(yōu)pH用5ml反應(yīng)混合物測(cè)定所述酶的最優(yōu)pH，所述反應(yīng)混合物包含100mM一定pH的緩沖液、6.5mM對(duì)羥基苯乙醛酸、0.05mM磷酸吡哆醛和100μl無細(xì)胞提取物(1.35mg蛋白，實(shí)施例14)。通過加入300μmole L-谷氨酸(合適pH、60mM終濃度)開始反應(yīng)。于35℃一定的時(shí)間間隔后，吸取樣品并通過加入相同體積的0.2M H3PO4終止反應(yīng)。通過HPLC(Biorad HPX-87C 300mm×7.8mm，20μl注樣體積，柱溫80℃、1ml/分鐘5mM磷酸鈣)分析樣品并于210nm檢測(cè)。
在pH5-11的范圍內(nèi)測(cè)試酶活性。分別應(yīng)用KH2PO4/Na2HPO4緩沖液(pH5-8)、TRIC-HCl緩沖液(pH8-9)、CHES-NaOH緩沖液(pH9-10)和CAPS-NaOH緩沖液(pH10-11)。
發(fā)現(xiàn)所述酶的最優(yōu)pH在8.5-9之間。在pH6-7.5觀察到顯著活性。這與Wiyakrutta和Meevootisom(1997，J.Biotechnol.，55193-203)相反，他們?cè)趐H7.5以下未觀測(cè)到施氏假單胞菌(Psedomonas stutzeri)的任何D-HpgAT活性。實(shí)施例17丙酮酸作為D-HpgAT的氨基受體應(yīng)用實(shí)施例12的分光光度計(jì)測(cè)定(但在測(cè)定混合物中沒有Triton)，用丙酮酸代替α-酮戊二酸作為氨基受體。由于形成HPGL，所以可觀測(cè)到吸光度增加。因此，惡臭假單胞菌D-HpgAT能夠利用丙酮酸作為氨基受體。Wiyakrutta和Meevootisom(1997，J.Biotechnol.，55193-203)描述的施氏假單胞菌轉(zhuǎn)氨酶利用α-酮戊二酸作為唯一的氨基受體。實(shí)施例18D-HpgAT的對(duì)映選擇性(I)使用實(shí)施例12的分光光度計(jì)測(cè)定測(cè)試D-HpgAT對(duì)L-HPG的活性。當(dāng)使用L-HPG作為底物時(shí)未觀測(cè)到吸光度增加。加入D-HPG后，吸光度開始增加。因此，所述D-HpgAT對(duì)D-對(duì)羥基苯基甘氨酸具有選擇性。
為測(cè)試L-谷氨酸的對(duì)映選擇性，于20℃溫育3ml反應(yīng)混合物，該混合物含有100mM磷酸鉀緩沖液pH7.0、60mM D-谷氨酸和0.1mM磷酸吡哆醛。該混合物在340nm的分光光度計(jì)活性檢測(cè)中用作空白。向反應(yīng)混合物中加入對(duì)羥基苯乙醛酸(0.5mM終濃度)。溫育2分鐘后，通過向反應(yīng)混合物中加入20μl無細(xì)胞提取物(0.27mg蛋白，實(shí)施例14)開始反應(yīng)。當(dāng)使用D-谷氨酸作為底物時(shí)未能鑒定出吸光度降低。加入L-谷氨酸后，吸光度開始下降。因此，所述D-HpgAT對(duì)L-谷氨酸具有選擇性。實(shí)施例19D-HpgAT的對(duì)映選擇性(II)為進(jìn)一步證實(shí)嚴(yán)格的對(duì)映選擇性，于35℃預(yù)溫育兩種反應(yīng)混合物(50ml終體積)10分鐘，這兩種混合物含有100mM磷酸鉀緩沖液pH8.0、13mM對(duì)羥基苯乙醛酸、0.05mM磷酸吡哆醛和無細(xì)胞提取物(13.5或1.35mg蛋白，實(shí)施例14)。通過加入34.8mmol L-谷氨酸pH8.O(終濃度0.7M)開始反應(yīng)。
一定間隔后吸取樣品(1.ml)，通過加入2ml 0.2M H3PO4終止反應(yīng)，以實(shí)施例15的方法通過HPLC分析。在反應(yīng)中僅產(chǎn)生D-HPG(沒有L-HPG)。
實(shí)驗(yàn)部分II(實(shí)施例20-35)構(gòu)建和測(cè)試人工D-(H)PG生物合成操縱子實(shí)施例20-35的一般性考慮因素選擇質(zhì)粒pJF119EH作為人工D-(H)PG生物合成操縱子的表達(dá)載體。這種宿主范圍廣泛的載體由Fǖrste等(1986，Gene，48119-131)構(gòu)建，適于在各種革蘭氏陰性菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)。pJF119EH表達(dá)系統(tǒng)使用IPTG誘導(dǎo)型tac啟動(dòng)子，并攜帶lac阻遏蛋白(lac Iq基因)，lac阻遏蛋白在沒有誘導(dǎo)物的情況下使克隆外源基因的表達(dá)保持在極低的水平。
在所有情況下，都通過PCR由實(shí)施例1、實(shí)施例9和實(shí)施例13描述的合適質(zhì)粒擴(kuò)增屬于D-(H)PG操縱子的不同基因。為確保在這些基因前存在最佳的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，包括實(shí)際上存在于pBAD/Myc-HisC中的RBS。
實(shí)施例20構(gòu)建質(zhì)粒pJU-Sc-HmaS使用PCR將天藍(lán)色鏈霉菌對(duì)羥基扁桃酸合酶基因亞克隆入pJF119EH。使用5′-GGGAATTCAGGAGGAATTAACC CCGCCgAGcGAC-3′[SEQIDNo.25](下劃線為EccoRI限制位點(diǎn)，雙下劃線為起始密碼子，將非大寫字母表示的密碼子3和4更改為大腸桿菌更常使用的密碼子)和5′-GAATTCCCATATTCTAGAAGG TCGGCCGGCCACT-3′[SEQ IDNo.26](下劃線為Xba I限制位點(diǎn)，雙下劃線為終止密碼子)作為引物，使用pBAD-Sc-HmaS(參見實(shí)施例1.3)質(zhì)粒DNA作為模板，擴(kuò)增包含RBS的HmaS ORF。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小(1120bp)。
用EcoRI和Xba I消化所述片段和質(zhì)粒pJF119EH。連接兩種片段，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。顯示正確插入序列(通過測(cè)序證實(shí))的質(zhì)粒叫做pJF-Sc-HmaS。
實(shí)施例21構(gòu)建質(zhì)粒pJF-Ao-HmaS使用PCR將東方諾卡氏菌對(duì)羥基扁桃酸合酶基因亞克隆入pJF119EH。使用5′-TGGGAATTCAGGAGGAATTAACC CAG-3′[SEQ IDNo.27](下劃線為EcoRI限制位點(diǎn)，雙下劃線為起始密碼子)和5′-GCCGGACCTCTAGATACG TCGCCG-3′[SEQ IDNo.28](下劃線為Xba I限制位點(diǎn)，雙下劃線為終止密碼子)作為引物，使用pBAD-Ao-HmaS(參見實(shí)施例1.1)質(zhì)粒DNA作為模板，擴(kuò)增包含RBS的HmaS ORF。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小(1115bp)。
用EcoR I和Xba I消化所述片段和質(zhì)粒pJF119EH。連接兩種片段，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。顯示正確插入序列(通過測(cè)序證實(shí))的質(zhì)粒叫做pJF-Ao-HmaS。
實(shí)施例22構(gòu)建質(zhì)粒pJF-Sc-HmaO使用PCR將天藍(lán)色鏈霉菌對(duì)羥基扁桃酸氧化酶基因亞克隆入pJF119EH。使用5′-TGGGTCTAGAGGAGGAATTAACC CGcGAGCCG-3′[SEQ IDNo.29](下劃線為XbaI限制位點(diǎn)，雙下劃線為起始密碼子，將非大寫字母表示的密碼子2更改為大腸桿菌更常使用的密碼子)和5′-GAATTCCCATAGCATGCCTGG TCCGTGGCTCC-3′[SEQ IDNo.30](下劃線為Sph I限制位點(diǎn)，雙下劃線為終止密碼子)作為引物，使用pBAD-Sc-HmaO(參見實(shí)施例1.4)質(zhì)粒DNA作為模板，擴(kuò)增包含RBS的HmaO ORF。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小(1178bp)。
用Xba I和Sph I消化所述片段和質(zhì)粒pJF119EH。連接兩種片段，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。顯示正確插入序列(通過測(cè)序證實(shí))的質(zhì)粒叫做pJF-Sc-HmaO，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例23構(gòu)建質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO在該實(shí)施例中，將實(shí)施例20和22的克隆Sc-HmaS和Sc-HmaO組合在表達(dá)載體pJF119EH中。通過用Xba I和Sph I消化切除表達(dá)載體中pJF-Sc-HmaO上的Sc-HmaO基因，通過凝膠電泳純化包含Sc-HmaO的該DNA片段。用Xba I和Sph I消化質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS，將其與Sc-HmaO Xba I/Sph I片段連接在一起，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。選擇不同的轉(zhuǎn)化體，小量制備質(zhì)粒，通過限制酶切作圖分析質(zhì)粒DNA。在pJF119EH中以正確的順序包含所述兩種基因的質(zhì)粒命名為pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例24構(gòu)建質(zhì)粒pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO在該實(shí)施例中，以和實(shí)施例23描述的pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO構(gòu)建相同的方式將實(shí)施例21和22的克隆Ao-HmaS和Sc-HmaO組合在表達(dá)載體pJF119EH中。在pJF119EH中以正確的順序包含所述兩種基因的質(zhì)粒命名為pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例25構(gòu)建質(zhì)粒pJF-HpgAT使用PCR將惡臭假單胞菌D-對(duì)羥基苯基甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因亞克隆入pJF119EH。使用5′-TTTCCCAAGCTTACAGGAGGAATTAACC [SEQ IDNo.31](下劃線為Hind III限制位點(diǎn)，雙下劃線為起始密碼子)和5′-GTACCAGCTGCAAAGCTTGAG GCCCAG-3′[SEQ IDNo.32](下劃線為Hind III限制位點(diǎn)，雙下劃線為終止密碼子)作為引物，使用pBAD-HpgAT(參見實(shí)施例13)質(zhì)粒DNA作為模板，擴(kuò)增包含RBS的HpgAT ORF。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小(1378bp)。
用Hind III消化所述片段和質(zhì)粒pJF119EH。連接兩種片段，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。使用限制酶切分析確認(rèn)目的片段以和tac啟動(dòng)子相同的方向插入。除了一個(gè)沉默突變(密碼子46由GCG變?yōu)镚CA)以外，顯示正確插入序列的質(zhì)粒叫做pJF-HpgAT，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。實(shí)施例26構(gòu)建質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT在該實(shí)施例中，將實(shí)施例25的克隆HpgAT亞克隆入實(shí)施例23的質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO。通過用Hind III消化切除表達(dá)載體中pJF-HpgAT上的HpgAT基因，通過凝膠電泳純化含HpgAT基因的該DNA片段。用Hind III消化質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO。去磷酸化后，將該片段與HpgAT Hind III片段連接在一起，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。選擇不同的轉(zhuǎn)化體，小量制備質(zhì)粒，通過限制酶切作圖分析質(zhì)粒DNA。在pJF119EH中以正確的順序和方向包含所述三個(gè)基因的質(zhì)粒命名為pJF-sc-HmaS-ScHmaO-HpgAT，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例27構(gòu)建質(zhì)粒pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT在該實(shí)施例中，以和實(shí)施例26描述的pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT構(gòu)建相同的方式將實(shí)施例25的克隆HpgAT亞克隆入實(shí)施例24的質(zhì)粒pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO。在pJF119EH中以正確的順序包含所述三個(gè)基因的質(zhì)粒命名為pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例28構(gòu)建質(zhì)粒p-JF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT在該實(shí)施例中，將存在于pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT(實(shí)施例26)中的克隆Sc-HmaO與惡臭假單胞菌的mdlB基因互換，獲得質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT。使用5′-GGGTCTAGAGGAGGAATTAACC AGCCAGAATCTCTTT-3′[SEQ IDNo.33](下劃線為Xba I限制位點(diǎn)，雙下劃線為起始密碼子)和5′-CTGCAGAACCAGCATCGGTGGTCAGTACTTCAC TGCG-3′[SEQ IDNo.34](下劃線為BstX I限制位點(diǎn)，雙下劃線為終止密碼子)作為引物，并使用pGEM-Bldm(參見實(shí)施例9)質(zhì)粒DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增包含RBS序列的惡臭假單胞菌扁桃酸脫氫酶基因，所述RBS序列實(shí)際上存在于質(zhì)粒pBAD/Myc-His中。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小(1236bp)。
用Xba I和BstX I消化所述片段。用Xba I和Sph I消化質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT，產(chǎn)生一個(gè)無HmaO基因的7692bp質(zhì)粒片段。將純化的7692bp Xba I/Sph I片段與含Xba I/BstX I片段的mdlB ORF連接在一起，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。選擇不同的轉(zhuǎn)化體，小量制備質(zhì)粒，通過限制酶切作圖分析質(zhì)粒DNA。在pJF119EH中以正確的順序包含所述三個(gè)基因的質(zhì)粒命名為pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。實(shí)施例29構(gòu)建質(zhì)粒pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT在該實(shí)施例中，以和實(shí)施例28描述的pJF-Sc-HmaS-Sc-mdlB-HpgAT構(gòu)建相同的方式將存在于pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT(實(shí)施例27)中的克隆Sc-HmaO與惡臭假單胞菌的mdlB基因互換，產(chǎn)生質(zhì)粒pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT。
將在pJF119EH中以正確的順序包含所述三個(gè)基因的質(zhì)粒命名為pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。實(shí)施例30人工D-(H)PG簇在質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT、pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT、pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT和pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT上的表達(dá)用攜帶質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT、pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT、pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT或pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT的大腸桿菌DH5α菌株的單菌落接種含氨芐青霉素(100μg/ml)的10ml LB培養(yǎng)基，并于30℃溫育16小時(shí)。
隨后用1ml這些培養(yǎng)物接種50ml同樣的培養(yǎng)基。于30℃、180rpm培養(yǎng)細(xì)胞。在OD620nm0.8時(shí)，通過加入0.1mM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞。4小時(shí)后，收獲細(xì)胞，并用100mM磷酸鉀緩沖液pH7.5清洗。于-20℃冷凍等份的清洗細(xì)胞待以后使用。作為對(duì)照，同樣處理攜帶質(zhì)粒pJF119EH的大腸桿菌DH5α。
臨使用前用B-PERTM(在磷酸緩沖液中)(Pierce，Rockford，Illinois，USA)制備粗提物。實(shí)施例31由對(duì)羥基丙酮酸苯酯體外生產(chǎn)D-HPG3ml的測(cè)定混合物包含200mM磷酸鉀緩沖液pH8.0、5mM對(duì)羥基丙酮酸苯酯(HPP)、10％乙醇(使用50mM對(duì)羥基丙酮酸苯酯母液的96％乙醇溶液)、44mM抗壞血酸、40mM L-谷氨酸、40mMNAD+、0.1mM磷酸吡哆醛和至終濃度為0.6mg/ml可溶性蛋白的實(shí)施例30的無細(xì)胞提取物。
通過加入HPP開始測(cè)定，于30℃、65小時(shí)后通過加入0.1ml 1NHCl至0.5ml等份的反應(yīng)系統(tǒng)中終止測(cè)定。按實(shí)施例3所述的HPLC分析樣品。
表1概述了所產(chǎn)生的對(duì)羥基扁桃酸(HMA)、對(duì)羥基苯乙醛酸(HPGL)和D-HPG的mg/l量。
表1質(zhì)粒 HMA HPGL D-HPGpJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT1767 9pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT0 16611pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT 3773 24pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT 0 97 26PJF119EH 0 0 0由表可見，在使用得自大腸桿菌DH5α/pJF119EH的無細(xì)胞提取物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到這些化合物(HMA、HPGL和D-HPG)。實(shí)施例32由丙酮酸苯酯體外生產(chǎn)D-PG3ml測(cè)定混合物包含200mM磷酸鉀緩沖液pH8.0、5mM丙酮酸苯酯(PP)、44mM抗壞血酸、40mM L-谷氨酸、40mM NAD+、0.1mM磷酸吡哆醛和至終濃度為0.3mg/ml可溶性蛋白的實(shí)施例30的無細(xì)胞提取物。
通過加入PP開始測(cè)定，于30℃、39小時(shí)后通過加入0.1ml 1NHCl至0.5ml等份的反應(yīng)系統(tǒng)中終止測(cè)定。按實(shí)施例3所述的HPLC分析樣品。
在39小時(shí)內(nèi)，用得自大腸桿菌DH5α/pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT的無細(xì)胞提取物生產(chǎn)32mg/l的D-PG，而用得自大腸桿菌DH5α/pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT的無細(xì)胞提取物生產(chǎn)27mg/l的D-PG。在使用得自大腸桿菌DH5α/pJF119EH的無細(xì)胞提取物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到D-PG。
實(shí)施例33構(gòu)建質(zhì)粒pCR-Bl-tyrA使用5′-GCGTGGAAGCTTAAGAGGTTTATT GTTGCTGAA-3′[SEQIDNo.35](下劃線為Hind III限制位點(diǎn)，雙下劃線為起始密碼子)和5′-GTGCACGGTCTCGAGCTGAATTC CTGGCGATTGTCAT-3′[SEQ IDNo.36](下劃線為Bsa I識(shí)別切割位點(diǎn)，雙下劃線為終止密碼子)作為引物，并使用野生型大腸桿菌菌株LJ110(Zeppenfeld等2000)染色體DNA作為模板，擴(kuò)增含大腸桿菌原有RBS的編碼大腸桿菌分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的tyrA ORF(保藏號(hào)AE000346的核苷酸4740-5877)。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確大小(1169bp)。
按照供應(yīng)商的說明書，將擴(kuò)增片段直接插入載體pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)，并轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌Top10(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)。在含50mg/l卡那霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。顯示正確插入序列(通過測(cè)序證實(shí))的質(zhì)粒叫做pCR-Bl-tyrA，將該質(zhì)粒用于進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例34構(gòu)建質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-mdlB-HDgAT-tyrA選擇大腸桿菌KB532(Δ(pheA-tyrA)，ΔtyrR，aroFfor，thiA，hsdR17，endAl，supE44)作為D-HPG的生產(chǎn)宿主菌株。KB532是L-酪氨酸和L-苯丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。該菌株沒有tyrA基因(分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫氫酶)、pheA基因(分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶)和全局調(diào)節(jié)子tyrR，并攜帶有編碼反饋(L-酪氨酸)抗性DAHP合酶的aroFOFfbr。tyrA基因在KB532中過表達(dá)導(dǎo)致大腸桿菌宿主產(chǎn)生酪氨酸，隨之也產(chǎn)生傳遞大量對(duì)羥基丙酮酸苯酯的菌株。
為能夠過表達(dá)tyrA和人工D-(H)PG操縱子，將實(shí)施例33的克隆tyrA基因亞克隆入實(shí)施例28的質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT。通過用Hind III和Bsa I消化切除表達(dá)載體中pCR-Bl-tyrA上的tyrA基因及其RBS，并通過凝膠電泳純化含tyrA ORF的DNA片段。
因?yàn)閜JF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT含有三個(gè)Hind III位點(diǎn)，所以用Hind III部分消化質(zhì)粒pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT，以獲得線性化質(zhì)粒片段。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)限制性片段的正確大小，并由該凝膠純化對(duì)應(yīng)于該線性化質(zhì)粒的8912bp片段。用堿性磷酸酶處理以防止質(zhì)粒再環(huán)化后，將這些8912bp片段與tyrA Hind III/Bsa I片段連接在一起。
通過轉(zhuǎn)化tyrA缺陷型大腸桿菌宿主KB532(參見上文)并在補(bǔ)加50mg/l L-苯丙氨酸和0.01mM IPTG的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，根據(jù)互補(bǔ)性選擇重組質(zhì)粒。選擇不同的轉(zhuǎn)化體，小量制備質(zhì)粒，并通過限制酶切作圖分析質(zhì)粒DNA。在pJF119EH中以正確的順序和方向包含所述四個(gè)基因的質(zhì)粒命名為pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT-tyrA，相應(yīng)菌株叫做KB532/pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT-tyrA，將其用于進(jìn)一步研究。實(shí)施例35發(fā)酵生產(chǎn)D-HPG用礦質(zhì)培養(yǎng)基研究大腸桿菌KB532/pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT-tyrA由葡萄糖生產(chǎn)D-HPG。該礦質(zhì)培養(yǎng)基包含檸檬酸鈉·3H2O(1.0g/l)、MgSO4·7H2O(0.3g/l)、KH2PO4(3.0g/l)、K2HPO4(12.0g/l)、NaCl(0.1g/l)、(NH4)2SO4(5.0g/l)、CaCl2·2H2O(15.0mg/l)、FeSO4·7H2O(75.0mg/l)、鹽酸硫胺素(維生素B1)(5.0mg/l)和L-苯丙氨酸(0.05g/l)。其它礦物質(zhì)以痕量元素溶液(1ml/l)形式加入，所述痕量元素溶液包括Al2(SO4)3·18H2O(2.0g/l)、CoCl2·6H2O(0.7g/l)、CuSO4·5H2O(2.5g/l)、H3BO3(0.5g/l)、MnCl2·4H2O(20.0g/l)、Na2MoO4·2H2O(3.0g/l)、NiSO4·6H2O(2.0g/l)、ZeSO4·7H2O(15.0g/l)。葡萄糖母液(30g/l)單獨(dú)高壓蒸汽滅菌，并加入到無菌培養(yǎng)基中至終濃度為4g/l。
使用大腸桿菌KB532/pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT-tyrA單菌落接種10ml含氨芐青霉素(100μg/ml)的基本培養(yǎng)基，并于30℃培養(yǎng)16小時(shí)。隨后用4ml該培養(yǎng)物接種50ml相同培養(yǎng)基，并于33℃、180rpm培養(yǎng)24小時(shí)。12小時(shí)后OD620nm約為0.6時(shí)，通過加入0.1mM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞。將培養(yǎng)物上清液樣品調(diào)節(jié)至pH5.8，凍干，并再溶解于D2O中。323K的600MHz1H-NMR顯示預(yù)期的諧振頻譜，形成少量HPG尖峰證實(shí)存在HPG。由2-D COSY實(shí)驗(yàn)獲得了大量證據(jù)。存在量測(cè)定為5mg/l。(除了HPG之外，還存在80mg/l的其前體對(duì)羥基苯乙醛酸，但沒有對(duì)羥基扁桃酸)。
序列表序列表<110>DSM N.V.
DSM Biotech GmbHJohns Hopkins University<120>發(fā)酵生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯基甘氨酸和D-苯基甘氨酸<130>發(fā)酵生產(chǎn)D-PG和D-HPG<140>美國(guó)<141>2000-10-27<160>36<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>1gtccacggtc tcccatgcag aatttcgaga t31<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>2acatcccaag cttcacgttc gaggtc 26<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>3cgctcggtca tgacgtacgt ttccctg 27<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>4acgaagaagc ttatcaaaca acccccag28<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>5atgccgccca gtgacatcgc gtacgc 26<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>6ccctcggtac caggtcatcg gccggccact tcc 33<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>7atgcgggagc cgctcacgct cgac24<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>8ccaactggta cctggtcatc cgtggctcct gtctcg 36<210>9<211>1140<212>DNA<213>均勻諾卡氏菌<220><221>CDS<222>(52)..(1086)<223>均勻諾卡氏菌津山亞種ATCC 21806對(duì)羥基扁桃酸合酶CDS<400>9aaaccgtcta taaatgctgc cggagggcga tcccacggct ggaggttcgt g atg gcg 57Met Ala1gca cag gca ggc agc gtg ttc gac ggc atg acg ctc gac cac acc gtg 105Ala Gln Ala Gly Ser Val Phe Asp Gly Met Thr Leu Asp His Thr Val5 10 15ttc tac gtc ggc gac gcg gac cgc gcg gcg ggc gag ctc acc gac aag 153Phe Tyr Val Gly Asp Ala Asp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Thr Asp Lys20 25 30tac ggg ctg gtg gtg ctc ggc acg tcc gag acc tcg tcg gtg cgc tcg 201Tyr Gly Leu Val Val Leu Gly Thr Ser Glu Thr Ser Ser Val Arg Ser35 40 45 50gtc gcg gtg ggc ggc ggc tcc atc cgg ctg gtg ttc tcc cag gcc atc 249Val Ala Val Gly Gly Gly Ser Ile Arg Leu Val Phe Ser Gln Ala Ile55 60 65gcc gac gac acc ccg gct gcc gcg tac gtg aag gtg cac ggc gac ggc 297Ala Asp Asp Thr Pro Ala Ala Ala Tyr Val Lys Val His Gly Asp Gly70 75 80gtg gcc gac ctc gcg ctg ggc gtc gcc gac gcc cgc gcc gcg ttc gcc 345Val Ala Asp Leu Ala Leu Gly Val Ala Asp Ala Arg Ala Ala Phe Ala85 90 95gag gcg gtg cgg cgg ggc gcg cgg ccg gtg gcc gag ccc acc gag gcc 393Glu Ala Val Arg Arg Gly Ala Arg Pro Val Ala Glu Pro Thr Glu Ala100 105 110gac ggc gcg gtg ctc gcc acg atc atg ggc ttc ggc gac gtg gtg cac 441Asp Gly Ala Val Leu Ala Thr Ile Met Gly Phe Gly Asp Val Val His115 120 125 130acc ttc gtc cag cgc ccc ggc ggc gcg ccc ggc gag gac ccg gag agc 489Thr Phe Val Gln Arg Pro Gly Gly Ala Pro Gly Glu Asp Pro Glu Ser135 140 145gcg ggc ggc ctg cgc gtg ctg gac cac ttc gcg gtc tgc ctc gag gcg 537Ala Gly Gly Leu Arg Val Leu Asp His Phe Ala Val Cys Leu Glu Ala150 155 160ggc ggg ctg gag ccg acc gtg gcg ttc tac cag gag gtg ctg gac ttc 585Gly Gly Leu Glu Pro Thr Val Ala Phe Tyr Gln Glu Val Leu Asp Phe165 170 175cgg gtg gtc ttc gag gag aag atc gtc gtc ggg gcg cag gcg atg aac 633Arg Val Val Phe Glu Glu Lys Ile Val Val Gly Ala Gln Ala Met Asn180 185 190tcc aag gtc gtg cag agc acg tcc ggc gcg gtc acg ctg acc ctc atc 681Ser Lys Val Val Gln Ser Thr Ser Gly Ala Val Thr Leu Thr Leu Ile195 200 205 210gaa ccg gac acc tcg cgc aag ccc ggt cag atc gac gac ttc atc aag 729Glu Pro Asp Thr Ser Arg Lys Pro Gly Gln Ile Asp Asp Phe Ile Lys215 220 225aac cac ggt ggc gcg ggc gtg cag cac atc gcc ttc gcc acc gac ggc 777Asn His Gly Gly Ala Gly Val Gln His Ile Ala Phe Ala Thr Asp Gly230 235 240atc gtg gac gcg gtg cgc cgg ttg cgc gag cgg ggc gtg gag ctg ctc 825Ile Val Asp Ala Val Arg Arg Leu Arg Glu Arg Gly Val Glu Leu Leu245 250 255acc acg ccc gcc gcc tac tac gac ctg ctg gcg gac cgc ctc gga ccg 873Thr Thr Pro Ala Ala Tyr Tyr Asp Leu Leu Ala Asp Arg Leu Gly Pro260 265 270acc cgg tac tcc acg gcc gag ctg gcc gag ctg aac ctg ctg gtc gac 921Thr Arg Tyr Ser Thr Ala Glu Leu Ala Glu Leu Asn Leu Leu Val Asp275 280 285 290gag gac cag gac ggc aag ctg tac cag atc ttc gcc cgg tcc acc cac 969Glu Asp Gln Asp Gly Lys Leu Tyr Gln Ile Phe Ala Arg Ser Thr His295 300 305ccc agg ggc acg ttc ttc ttc gag atc atc gag cgc gcg ggc gcg cac 1017Pro Arg Gly Thr Phe Phe Phe Glu Ile Ile Glu Arg Ala Gly Ala His310 315 320acc ttc ggc agc ggc aac atc aag gcc ctc tac gag gcc gtc gag gcc 1065Thr Phe Gly Ser Gly Asn Ile Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Ala325 330 335gag cgc cac cgg acc gag cgc tgagcgcggg gcacggcgat ggacccgctg 1116Glu Arg His Arg Thr Glu Arg340 345cgcgccggtg acctgcacgg ctcg 1140<210>10<211>345<212>蛋白質(zhì)<213>均勻諾卡氏菌<400>10Met Ala Ala Gln Ala Gly Ser Val Phe Asp Gly Met Thr Leu Asp His1 5 10 15Thr Val Phe Tyr Val Gly Asp Ala Asp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Thr20 25 30Asp Lys Tyr Gly Leu Val Val Leu Gly Thr Ser Glu Thr Ser Ser Val35 40 45Arg Ser Val Ala Val Gly Gly Gly Ser Ile Arg Leu Val Phe Ser Gln50 55 60Ala Ile Ala Asp Asp Thr Pro Ala Ala Ala Tyr Val Lys Val His Gly65 70 75 80Asp Gly Val Ala Asp Leu Ala Leu Gly Val Ala Asp Ala Arg Ala Ala85 90 95Phe Ala Glu Ala Val Arg Arg Gly Ala Arg Pro Val Ala Glu Pro Thr100 105 110Glu Ala Asp Gly Ala Val Leu Ala Thr Ile Met Gly Phe Gly Asp Val115 120 125Val His Thr Phe Val Gln Arg Pro Gly Gly Ala Pro Gly Glu Asp Pro130 135 140Glu Ser Ala Gly Gly Leu Arg Val Leu Asp His Phe Ala Val Cys Leu145 150 155 160Glu Ala Gly Gly Leu Glu Pro Thr Val Ala Phe Tyr Gln Glu Val Leu165 170 175Asp Phe Arg Val Val Phe Glu Glu Lys Ile Val Val Gly Ala Gln Ala180 185 190Met Asn Ser Lys Val Val Gln Ser Thr Ser Gly Ala Val Thr Leu Thr195 200 205Leu Ile Glu Pro Asp Thr Ser Arg Lys Pro Gly Gln Ile Asp Asp Phe210 215 220Ile Lys Asn His Gly Gly Ala Gly Val Gln His Ile Ala Phe Ala Thr225 230 235 240Asp Gly Ile Val Asp Ala Val Arg Arg Leu Arg Glu Arg Gly Val Glu245 250 255Leu Leu Thr Thr Pro Ala Ala Tyr Tyr Asp Leu Leu Ala Asp Arg Leu260 265 270Gly Pro Thr Arg Tyr Ser Thr Ala Glu Leu Ala Glu Leu Asn Leu Leu275 280 285Val Asp Glu Asp Gln Asp Gly Lys Leu Tyr Gln Ile Phe Ala Arg Ser290 295 300Thr His Pro Arg Gly Thr Phe Phe Phe Glu Ile Ile Glu Arg Ala Gly305 310 315 320Ala His Thr Phe Gly Ser Gly Asn Ile Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Val325 330 335Glu Ala Glu Arg His Arg Thr Glu Arg340 345<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>11agaattcgcg gcacaggcag gcagcg 26<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>12ttataagctt tcagcgctcg gtccggtggc 30<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>13tataccatgg cggcacaggc aggc24<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>14ttataagctt gcgctcggtc cggtggc 27<210>15<211>1227<212>DNA<213>均勻諾卡氏菌<220><221>CDS<222>(50)..(1177)<223>均勻諾卡氏菌津山亞種ATCC 21806對(duì)羥基扁桃酸氧化酶CDS<400>15ccccgcgcgt ggggaggcgg cgtgcccgac ggacaggagg caacgagcc atg ggc gtc 58Met Gly Val1cgc aac tcc gca ggg ggc ggc gcg gaa gac ccc gag gac ctg gct gag 106Arg Asn Ser Ala Gly Gly Gly Ala Glu Asp Pro Glu Asp Leu Ala Glu5 10 15gtg gaa cgg gcc gcc gcc gcc cgg ctg ccg ggg gac gtg cgc gac ttc 154Val Glu Arg Ala Ala Ala Ala Arg Leu Pro Gly Asp Val Arg Asp Phe20 25 30 35atc gcg ggc ggc agc ggc gac gag gtg acg ctg gcc gcc aac cgc gcg 202Ile Ala Gly Gly Ser Gly Asp Glu Val Thr Leu Ala Ala Asn Arg Ala40 45 50gcg ctc gac gac gtg gcc ctg ctc ccc agg gtg crc gcg ggt gtc cag 250Ala Leu Asp Asp Val Ala Leu Leu Pro Arg Val Leu Ala Gly Val Gln55 60 65gcg gcc gac acg agc acc tcg ctc gtg ggc acg gcg gcc acg ctg ccc 298Ala Ala Asp Thr Ser Thr Ser Leu Val Gly Thr Ala Ala Thr Leu Pro70 75 80gtc gcc gtg gcg ccg atg ggc tac cag tgc ctc gtc cae ccc gac ggc 346Val Ala Val Ala Pro Met Gly Tyr Gln Cys Leu Val His Pro Asp Gly85 90 95gag gtc gcg gct gcc gcc gcg gcg ggc gcc gcc ggc gtc ccc ttc acc 394Glu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Val Pro Phe Thr100 105 110 115gtc ggc acg ctg agc agc cgg tcg gtc gag gag atc gcc gag acc ggc 442Val Gly Thr Leu Ser Ser Arg Ser Val Glu Glu Ile Ala Glu Thr Gly120 125 130gcg tcg ctg tgg ttc cag ctc tac tgg ctg cgc gat cgc ggc ctg gtc 490Ala Ser Leu Trp Phe Gln Leu Tyr Trp Leu Arg Asp Arg Gly Leu Val135 140 145gcc gaa ctc gtg gcg cgg gcc gag gcg gcg ggc tgc cgg gcg ctg gtg538Ala Glu Leu Val Ala Arg Ala Glu Ala Ala Gly Cys Arg Ala Leu Val150 155 160atc acc gtg gac gtg ccg gtg atg ggc cgc agg ctc cgg gac gtg cgc586Ile Thr Val Asp Val Pro Val Met Gly Arg Arg Leu Arg Asp Val Arg165 170 175aac ggg atc acc ctg ccc cgg acc gtc cgg gcc gtc cac ctc gcc gac634Asn Gly Ile Thr Leu Pro Arg Thr Val Arg Ala Val His Leu Ala Asp180 185 190 195ggc ccg tca tcc gcg cac gag ccg cgc cag gtc ggc tcc ggc gtc gcc682Gly Pro Ser Ser Ala His Glu Pro Arg Gln Val Gly Ser Gly Val Ala200 205 210cag cac acg agc gcg gtc ttc gac ccc gcg ttc ggg tgg cgc gac ctg730Gln His Thr Ser Ala Val Phe Asp Pro Ala Phe Gly Trp Arg Asp Leu215 220 225gag tgg ctg cgg gcg cgc acc agg ctc ccc ctg gtg gtc aag ggc gtg778Glu Trp Leu Arg Ala Arg Thr Arg Leu Pro Leu Val Val Lys Gly Val230 235 240ctc gac ccg cgc gac gcc acc agg tgc gtc gag ctg ggc gcc tcg gcg826Leu Asp Pro Arg Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Leu Gly Ala Ser Ala245 250 255gtg gtg gtg tcc aac cac ggc ggg cgg cag ctc gac ggc gcg gcg ccc874Val Val Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Gly Ala Ala Pro260 265 270 275agc gcg gtg gcc ctg ccg cgc gtc gtc gac gcg gtg gcg ggc gcg gcc922Ser Ala Val Ala Leu Pro Arg Val Val Asp Ala Val Ala Gly Ala Ala280 285 290gag gtg ctg ttc gac agc ggc gtc cgc ggc ggc gtc gac gtg ctg cgc970Glu Val Leu Phe Asp Ser Gly Val Arg Gly Gly Val Asp Val Leu Arg295 300 305gcc ctc gcg ctc ggc gcg acc ggc gtg ctg ctc ggc cgc cca atc ctg1018Ala Leu Ala Leu Gly Ala Thr Gly Val Leu Leu Gly Arg Pro Ile Leu310 315 320tgg ggg ctc gcg gtc ggc ggc gag cgc ggc gcg gcg cgg gtg ctg gaa1066Trp Gly Leu Ala Val Gly Gly Glu Arg Gly Ala Ala ATg Val Leu Glu
325 330 335ctg ctg cgc acc gag ttc gcg cag gcc ctg ctg ctc gcc ggg tgc gcc 1114Leu Leu Arg Thr Glu Phe Ala Gln Ala Leu Leu Leu Ala Gly Cys Ala340 345 350 355gac gtc gac gcg gcc agg gga ctc gcg acc gcg cag gcc gcg ccg acc 1162Asp Val Asp Ala Ala Arg Gly Leu Ala Thr Ala Gln Ala Ala Pro Thr360 365 370cgg cga ggt gcg ccc tgaccgcctc ggggaccgcg atcggggccg gggcgcgggg 1217Arg Arg Gly Ala Pro375tcaggggaag 1227<210>16<211>376<212>蛋白質(zhì)<213>均勻諾卡氏菌<400>16Met Gly Val Arg Asn Ser Ala Gly Gly Gly Ala Glu Asp Pro Glu Asp1 5 10 15Leu Ala Glu Val Glu Arg Ala Ala Ala Ala Arg Leu Pro Gly Asp Val20 25 30Arg Asp Phe Ile Ala Gly Gly Ser Gly Asp Glu Val Thr Leu Ala Ala35 40 45Asn Arg Ala Ala Leu Asp Asp Val Ala Leu Leu Pro Arg Val Leu Ala50 55 60Gly Val Gln Ala Ala Asp Thr Ser Thr Ser Leu Val Gly Thr Ala Ala65 70 75 80Thr Leu Pro Val Ala Val Ala Pro Met Gly Tyr Gln Cys Leu Val His85 90 95Pro Asp Gly Glu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Val100 105 110Pro Phe Thr Val Gly Thr Leu Ser Ser Arg Ser Val Glu Glu Ile Ala115 120 125Glu Thr Gly Ala Ser Leu Trp Phe Gln Leu Tyr Trp Leu Arg Asp Arg130 135 140Gly Leu Val Ala Glu Leu Val Ala Arg Ala Glu Ala Ala Gly Cys Arg145 150 155 160Ala Leu Val Ile Thr Val Asp Val Pro Val Met Gly Arg Arg Leu Arg165 170 175Asp Val Arg Asn Gly Ile Thr Leu Pro Arg Thr Val Arg Ala Val His180 185 190Leu Ala Asp Gly Pro Ser Ser Ala His Glu Pro Arg Gln Val Gly Ser195 200 205Gly Val Ala Gln His Thr Ser Ala Val Phe Asp Pro Ala Phe Gly Trp210 215 220Arg Asp Leu Glu Trp Leu Arg Ala Arg Thr Arg Leu Pro Leu Val Val225 230 235 240Lys Gly Val Leu Asp Pro Arg Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Leu Gly245 250 255Ala Ser Ala Val Val Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Gly260 265 270Ala Ala Pro Ser Ala Val Ala Leu Pro Arg Val Val Asp Ala Val Ala275 280 285Gly Ala Ala Glu Val Leu Phe Asp Ser Gly Val Arg Gly Gly Val Asp290 295 300Val Leu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Ala Thr Gly Val Leu Leu Gly Arg305 310 315 320Pro Ile Leu Trp Gly Leu Ala Val Gly Gly Glu Arg Gly Ala Ala Arg325 330 335Val Leu Glu Leu Leu Arg Thr Glu Phe Ala Gln Ala Leu Leu Leu Ala340 345 350Gly Cys Ala Asp Val Asp Ala Ala Arg Gly Leu Ala Thr Ala Gln Ala355 360 365Ala Pro Thr Arg Arg Gly Ala Pro370 375<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>17agaat tcggc gtccgcaact ccgcag26<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>18aataagcttt cagggcgcac ctcgcc 26<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>19actcgccaag ggctatggtg tcc23<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>20gccaacagtt ccaacagcgg tgtg 24<210>21<211>1427<212>DNA<213>惡臭假單胞菌<220><221>CDS<222>(51)..(1376)<223>惡臭假單胞菌NCIMB 12565 D-對(duì)羥基苯基甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶CDS<400>21tcagttaact gccatgtaat ctcaaaaacc agtccaatag aggcatcagc atg tct56Met Ser1att tat agc gat tat gaa cgt aaa acg gtg ggc tcc gcg cat tgg gcg 104Ile Tyr Ser Asp Tyr Glu Arg Lys Thr Val Gly Ser Ala His Trp Ala5 10 15gat cgg gca cga gct gta atg cca gat ggc gta acg gct gat aca cgt 152Asp Arg Ala Arg Ala Val Met Pro Asp Gly Val Thr Ala Asp Thr Arg20 25 30gtt ttt gat ccg cat ggg ctg tac atc tgt gac gcg caa ggt gtt cac 200Val Phe Asp Pro His Gly Leu Tyr Ile Cys Asp Ala Gln Gly Val His35 40 45 50aag acc gat gtt gat ggc aac gta tac ctg gat ttt ttt ggt ggg cat 248Lys Thr Asp Val Asp Gly Asn Val Tyr Leu Asp Phe Phe Gly Gly His55 60 65ggc gct tta gtg ctt ggt cat gga cat cca cgt att aac aag gca atc 296Gly Ala Leu Val Leu Gly His Gly His Pro Arg Ile Asn Lys Ala Ile70 75 80tct gca gcg ctg acg cat ggc gtc caa tac ggt gca agc cat ccg ctt 344Ser Ala Ala Leu Thr His Gly Val Gln Tyr Gly Ala Ser His Pro Leu85 90 95gaa gtg cga tgg gcc gag cgc ttg gtc aac gcc ttc cct tcg atg cat 392Glu Val Arg Trp Ala Glu Arg Leu Val Asn Ala Phe Pro Ser Met His100 105 110aaa gtg cgc ttt gcc ggc agc ggc act gag gcg act tta ttg gca ctg 440Lys Val Arg Phe Ala Gly Ser Gly Thr Glu Ala Thr Leu Leu Ala Leu115 120 125 130cga atg gcg cgg gcg ttt act ggc agg tcg aaa ata cta cgt att gcc 488Arg Met Ala Arg Ala Phe Thr Gly Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ile Ala135 140 145acc cac tat cat ggc tgg cat gac ttc tcc gcc tct ggt tac aac agt536Thr His Tyr His Gly Trp His Asp Phe Ser Ala Ser Gly Tyr Asn Ser150 155 160cac ttc gac ggc cag cca gca ccg ggc gtc ctt gct gaa att gca cag584His Phe Asp Gly Gln Pro Ala Pro Gly Val Leu Ala Glu Ile Ala Gln165 170 175agc aca cta ctg gtt cgc cca gat gac ttc gaa gga tta cgc gca cta632Ser Thr Leu Leu Val Arg Pro Asp Asp Phe Glu Gly Leu Arg Ala Leu180 185 190ttc gct caa tac ggc ggt gag att gcg acc att att gcg gag cca gtc680Phe Ala Gln Tyr Gly Gly Glu Ile Ala Thr Ile Ile Ala Glu Pro Val195 200 205 210ggc tct cat ttc ggt atc act ccg gtc agc gac gat ttc ttg cta gaa728Gly Ser His Phe Gly Ile Thr Pro Val Ser Asp Asp Phe Leu Leu Glu215 220 225ggc gcc gcg ctg gct cga aag cac ggt gca ata ttc att ctt gac gaa776Gly Ala Ala Leu Ala Arg Lys His Gly Ala Ile Phe Ile Leu Asp Glu230 235 240gtg ata acc ggt ttt cgc gtg ggt aac cac ggt atg cag ggg ctt ctc824Val Ile Thr Gly Phe Arg Val Gly Asn His Gly Met Gln Gly Leu Leu245 250 255gac att gca ccg gat ctt acg tgc ttg gcc aag gcc agt gct gga ggt872Asp Ile Ala Pro Asp Leu Thr Cys Leu Ala Lys Ala Ser Ala Gly Gly260 265 270ctt cct gga ggc gta gtc gga gga agg gcg gat gtc atg gcg gta ctg920Leu Pro Gly Gly Val Val Gly Gly Arg Ala Asp Val Met Ala Val Leu275 280 285 290gat cgc ggt tca gac cgt aag gtt ctg cat caa ggc acc ttc acc gga968Asp Arg Gly Ser Asp Arg Lys Val Leu His Gln Gly Thr Phe Thr Gly295 300 305aac cca att acg gcg gcg gca gca atc gcg gcg atc gat acc att atc1016Asn Pro Ile Thr Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ile Asp Thr Ile Ile310 315 320gaa gat gac gtg tgc aca cac atc aat gcc ctc ggt caa tac gcc cgg1064Glu Asp Asp Val Cys Thr His Ile Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Ala Arg325 330 335gac tcg atg aac gaa ctc ttc gct cgt aag cat ttg gac tgg ttg gct1112Asp Ser Met Asn Glu Leu Phe Ala Arg Lys His Leu Asp Trp Leu Ala340 345 350tat ggc cgc ttt tcc ggc ttc cac ctg atg ccg gga tta tct ccg ctg 1160Tyr Gly Arg Phe Ser Gly Phe His Leu Met Pro Gly Leu Ser Pro Leu355 360 365 370acc act gac acg ggt gtg atc act cgc gga gaa gtt gca cgg ccc gca 1208Thr Thr Asp Thr Gly Val lle Thr Arg Gly Glu Val Ala Arg Pro Ala375 380 385gta aaa atg att gcc gct atg cgc atg gca tta atc ctt gag ggc atc 1256Val Lys Met Ile Ala Ala Met Arg Met Ala Leu Ile Leu Glu Gly Ile390 395 400gat att ggt ggc cgt gga tct gtg ttt ctc tct gcg cag cat gat cgc 1304Asp Ile Gly Gly Arg Gly Ser Val Phe Leu Ser Ala Gln His Asp Arg405 410 415gga cat gtc gac caa ctg gtg tcg acc ttt gat tcc att ctt ggc cgc 1352Gly His Val Asp Gln Leu Val Ser Thr Phe Asp Ser Ile Leu Gly Arg420 425 430ctg gct gaa gaa aac ctc ctg ggc taagccctta cacatctgtc tggaatatga 1406Leu Ala Glu Glu Asn Leu Leu Gly435 440atcatgaaaa ctagcctgaa a 1427<210>22<211>442<212>蛋白質(zhì)<213>惡臭假單胞菌<400>22Met Ser Ile Tyr Ser Asp Tyr Glu Arg Lys Thr Val Gly Ser Ala His1 5 10 15Trp Ala Asp Arg Ala Arg Ala Val Met Pro Asp Gly Val Thr Ala Asp20 25 30Thr Arg Val Phe Asp Pro His Gly Leu Tyr Ile Cys Asp Ala Gln Gly35 40 45Val His Lys Thr Asp Val Asp Gly Asn Val Tyr Leu Asp Phe Phe Gly50 55 60Gly His Gly Ala Leu Val Leu Gly His Gly His Pro Arg Ile Asn Lys65 70 75 80Ala Ile Ser Ala Ala Leu Thr His Gly Val Gln Tyr Gly Ala Ser His85 90 95Pro Leu Glu Val Arg Trp Ala Glu Arg Leu Val Asn Ala Phe Pro Ser100 105 110Met His Lys Val Arg Phe Ala Gly Ser Gly Thr Glu Ala Thr Leu Leu115 120 125Ala Leu Arg Met Ala Arg Ala Phe Thr Gly Arg Ser Lys Ile Leu Arg130 135 140Ile Ala Thr His Tyr His Gly Trp His Asp Phe Ser Ala Ser Gly Tyr145 150 155 160Asn Ser His Phe Asp Gly Gln Pro Ala Pro Gly Val Leu Ala Glu Ile165 170 175Ala Gln Ser Thr Leu Leu Val Arg Pro Asp Asp Phe Glu Gly Leu Arg180 185 190Ala Leu Phe Ala Gln Tyr Gly Gly Glu Ile Ala Thr Ile Ile Ala Glu195 200 205Pro Val Gly Ser His Phe Gly Ile Thr Pro Val Ser Asp Asp Phe Leu210 215 220Leu Glu Gly Ala Ala Leu Ala Arg Lys His Gly Ala Ile Phe Ile Leu225 230 235 240Asp Glu Val Ile Thr Gly Phe Arg Val Gly Asn His Gly Met Gln Gly245 250 255Leu Leu Asp Ile Ala Pro Asp Leu Thr Cys Leu Ala Lys Ala Ser Ala260 265 270Gly Gly Leu Pro Gly Gly Val Val Gly Gly Arg Ala Asp Val Met Ala275 280 285Val Leu Asp Arg GLy Ser Asp Arg Lys Val Leu His Gln Gly Thr Phe290 295 300Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ile Asp Thr305 310 315 320Ile Ile Glu Asp Asp Val Cys Thr His Ile Asn Ala Leu Gly Gln Tyr325 330 335Ala Arg Asp Ser Met Asn Glu Leu Phe Ala Arg Lys His Leu Asp Trp340 345 350Leu Ala Tyr Gly Arg Phe Ser Gly Phe His Leu Met Pro Gly Leu Ser355 360 365Pro Leu Thr Thr Asp Thr Gly Val Ile Thr Arg Gly Glu Val Ala Arg370 375 380Pro Ala Val Lys Met Ile Ala Ala Met Arg Met Ala Leu Ile Leu Glu385 390 395 400Gly Ile Asp Ile Gly Gly Arg Gly Ser Val Phe Leu Ser Ala Gln His405 410 415Asp Arg Gly His Val Asp Gln Leu Val Ser Thr Phe Asp Ser Ile Leu420 425 430Gly Arg Leu Ala Glu Glu Asn Leu Leu Gly435 440<210>23<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>23gtgcacggtc tcgcatgtct atttatagcg attatgaacg taaaac46<210>24<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>24gtgcacggtc tcctcgagtt agcccaggag gttttcttca gc42<210>25<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>25gggaattcag gaggaattaa ccatgccgcc gagcgac 37<210>26<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>26gaattcccat attctagaag gtcatcggcc ggccact 37<210>27<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>27tgggaattca ggaggaatta accatgcag 29<210>28<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>28cggccaggtc tagatacgtc atcgccg 27<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>29tgggtctaga ggaggaatta accatgcgcg agccg35<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>30gaattcccat agcatgcctg gtcatccgtg gctcc35<210>31<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>31tttcccaagc ttacaggagg aattaaccat g31<210>32<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>32gtaccagctg caaagcttga gttagcccag 30<210>33<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>33gggtctagag gaggaattaa ccatgagcca gaatctcttt 40<210>34<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>34ctgcagaacc agcatggtgg tcagtacttc actcatgcg39<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>35gcgtggaagc ttaagaggtt tattatggtt gctgaa 36<210>36<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR的基因特異性寡核苷酸<400>36gtgcacggtc tcgagctgaa ttcttactgg cgattgtcat 40
權(quán)利要求
1.一種重組微生物生產(chǎn)D-苯甘氨酸(D-PG)或D-對(duì)羥基苯基甘氨酸(D-HPG)的發(fā)酵方法，其中a)分別用于生產(chǎn)D-PG和D-HPG的丙酮酸苯酯和對(duì)羥基丙酮酸苯酯分別取自芳香族氨基酸途徑；b)并分別轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜峄驅(qū)αu基扁桃酸；c)此后分別轉(zhuǎn)變?yōu)楸揭胰┧峄驅(qū)αu基苯乙醛酸；d)此后通過立體轉(zhuǎn)化D-轉(zhuǎn)氨酶的作用苯乙醛酸或?qū)αu基苯乙醛酸分別轉(zhuǎn)變?yōu)镈-苯甘氨酸或D-對(duì)羥基苯基甘氨酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所應(yīng)用的微生物高效產(chǎn)生丙酮酸苯酯和對(duì)羥基丙酮酸苯酯。
3.權(quán)利要求2的方法，其中分別通過供給苯丙氨酸(對(duì)于丙酮酸苯酯而言)或酪氨酸(對(duì)于對(duì)羥基丙酮酸苯酯而言)高效產(chǎn)生丙酮酸苯酯或?qū)αu基丙酮酸苯酯。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述丙酮酸苯酯轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜峄驅(qū)αu基丙酮酸苯酯轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)羥基扁桃酸經(jīng)由對(duì)羥基扁桃酸合酶催化的一步酶反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述丙酮酸苯酯轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜峄驅(qū)αu基丙酮酸苯酯轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)羥基扁桃酸經(jīng)由多步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，所述多步反應(yīng)包括以下步驟PP或HPP分別轉(zhuǎn)變?yōu)楸揭胰┗驅(qū)αu基苯乙醛，然后分別轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜岜锦セ驅(qū)αu基乙酸苯酯，最后分別轉(zhuǎn)變?yōu)镸A或HMA。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中在酶存在下催化對(duì)羥基扁桃酸和扁桃酸分別轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)羥基苯乙醛酸和苯乙醛酸，所述酶選自扁桃酸脫氫酶、對(duì)羥基扁桃酸脫氫酶、氧依賴性扁桃酸氧化酶和氧依賴性對(duì)羥基扁桃酸氧化酶。
7.一種能夠分泌可檢測(cè)量D-HPG或D-PG的重組細(xì)胞，該細(xì)胞包含a)催化對(duì)羥基丙酮酸苯酯轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)羥基扁桃酸或催化丙酮酸苯酯轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜岬拿傅木幋a基因；b)催化對(duì)羥基扁桃酸轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)羥基苯乙醛酸或催化扁桃酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸揭胰┧岬拿傅木幋a基因；c)催化對(duì)羥基苯乙醛酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-HPG或催化苯乙醛酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-PG的立體轉(zhuǎn)化D-轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因。
8.一種重組質(zhì)粒，它包含至少一種下述基因，所述基因的序列對(duì)應(yīng)于本申請(qǐng)公開的[SEQ IDNo.9]和/或[SEQ IDNo.15]和/或[SEQIDNo.21]中的任一種或者與這些序列中的任一種至少80％同源、優(yōu)選至少90％同源、最優(yōu)選至少95％同源的同源物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的制備對(duì)映體純形式D－對(duì)羥基苯基甘氨酸(D－HPG)或D－苯甘氨酸(D－PG)的發(fā)酵方法。形成D－HPG和D－PG的前體取自普通的芳香族氨基酸途徑，這些前體轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)羥基苯乙醛酸或苯乙醛酸，最后通過立體轉(zhuǎn)化D－轉(zhuǎn)氨酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)镈－HPG或D－PG。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1483080SQ01821216
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2001年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月27日
發(fā)明者C·A·湯森, M·岡斯奧, U·米勒, F·B·J·阿塞馬范, T·?？? C A 湯森, J 阿塞馬范, 拱 申請(qǐng)人:Dsm有限公司, Dsm生物技術(shù)股份有限公司, 約翰斯霍普金斯大學(xué)