專利名稱：構建dna文庫的方法和其上固定有dna文庫的支持物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的工業(yè)領域涉及基因技術、蛋白質(zhì)技術、細胞技術和免疫學技術等分子生物學技術和生物化學技術，具體地涉及通過利用微量DNA實驗材料構建其上固定有脫氧核糖核酸(以下稱“DNA”)的原始支持物的方法，構建其復制支持物的方法和固定有DNA片段的支持物。
而且，本發(fā)明的另一目的是提供其上固定有復制DNA片段的支持物。
在根據(jù)本發(fā)明構建cDNA文庫的方法中，mRNA與固定在支持物上的cDNA文庫解雜交(dehybridize)。該方法的特征在于通過利用該解雜交的mRNA固定相同的cDNA文庫。
在根據(jù)本發(fā)明構建gDNA(基因組DNA)文庫的方法中，該方法的特征在于將雙鏈gDNA與支持物上具有限制性酶位點的寡核苷酸連接在一起。
在根據(jù)本發(fā)明構建單鏈gDNA文庫的方法中，該方法的特征在于利用權利要求3所述的支持物上固定的gDNA的有義部分。
在根據(jù)本發(fā)明構建單鏈gDNA文庫的方法中，該方法的特征在于使權利要求3所述gDNA文庫的反義部分解雜交，并利用該反義部分通過合成在支持物上固定有義部分。
在權利要求1-5之一所述的根據(jù)本發(fā)明的任何方法中，其特征在于支持物預先經(jīng)核苷酸或寡核苷酸進行化學修飾。
根據(jù)本發(fā)明的支持物的特征在于通過權利要求1-6之一所述的任何方法固定有DNA文庫。
根據(jù)本發(fā)明的支持物的特征在于固定的是單鏈DNA文庫。


圖1顯示了自動構建和復制cDNA文庫支持物的裝置的示意圖。
圖1所示用于構建DNA文庫支持物的裝置A含有用于向容器中輸送反應溶液的送液器105、用于停止該反應溶液和輸送新反應溶液的送液開關器220、用于在平面的前后左右方向和上下方向驅(qū)動用于注入/排出實驗材料的噴管101的噴管驅(qū)動器100、用于加熱/冷卻前述容器中的反應溶液的溶液溫度控制器30、用于容納裝有用來構建相應固定化DNA文庫支持物的各實驗材料和/或溶液的容器的實驗材料容器支撐器20、和用于將該實驗材料容器支撐器控制在預定溫度的實驗材料容器溫度控制器40，等。優(yōu)選地，鑒于將來與PCR裝置和/或PCR產(chǎn)物分析裝置的連接，容器支撐器10能夠容納96個或更多個實驗材料容器。優(yōu)選地，為了構建復制支持物，實驗材料容器支撐器20含有至少4個實驗材料容器插入孔。優(yōu)選地，鑒于將來與PCR裝置和/或PCR產(chǎn)物分析裝置的連接，實驗材料容器支撐器20上提供的容器插入孔數(shù)目為10個孔或更多個孔。優(yōu)選地，鑒于溶液溫度控制器30和實驗材料容器溫度控制器40的溫度控制，容器支撐器10和實驗材料容器支撐器20為具有良好導熱性的鋁塊。
優(yōu)選地，對于原始支持物和復制支持物，用于構建DNA文庫支持物的支持物為平板形、球形、立方體形或粒狀。盡管沒有規(guī)定該支持物的材料，但優(yōu)選該材料不與反應溶液發(fā)生反應，或不析出對DNA固定化反應有害的物質(zhì)。例如，塑料、玻璃、硅氧烷和金屬均是優(yōu)選材料。優(yōu)選平板形、球形、立方體形等。尤其是，優(yōu)選由鉆石或包含碳原子的鉆石組成的支持物。(攜帶cDNA文庫的原始支持物和其復制支持物的制備)我們將參照
圖1和圖3闡述其上固定有cDNA文庫的原始支持物和其復制支持物的構建方法。首先，預備必要數(shù)量(T1～Tn)的經(jīng)oligo(dT)n(n為15-30)化學修飾的3mm×3mm×0.1mm支持物。這些支持物僅采用oligo(dT)n進行化學修飾，在該支持物上還未固定有DNA文庫。采用經(jīng)oligo(dT)n化學修飾的支持物的原因是此經(jīng)化學修飾的支持物容易與總RNA中的mRNA雜交。將這些支持物插入容器CB1-CBn中，然后將這些容器放置在容器支撐器10中。在此情況下，為了確保通過利用從小量實驗材料獲得的微量mRNA構建作為固定化cDNA文庫的原始支持物和其復制支持物，優(yōu)選將一個支持物插入第一容器中。關于其中插有化學修飾支持物的容器CB1-CBn在容器支撐器10中的放置順序，將放有化學修飾支持物T1用于原始支持物的容器CB1插入第一插入部分HT1中。其中放有相應編號數(shù)的化學修飾支持物(T2-Tn)、用于復制支持物的必要數(shù)量容器(CB2-CBn)分別被順序地插入第二插入孔HT2、...、第n個插入孔HTn中。(原始支持物的制備)將純化的總RNA溶液201、RT酶溶液202和含有核苷酸(dT、dA、dG、dC)的反應溶液203裝入控制在預定溫度(即4℃)的實驗材料容器支撐器20中。提供清洗/洗脫DNA用的Tris-乙二胺四乙酸(以下稱“TE”)溶液204(含有Tris-乙二胺四乙酸的緩沖溶液)和廢液缸210及其它物件。提供毛細管230作為液體輸送通道，通過與送液開關器220連接用于液相輸送相應溶液。優(yōu)選地，毛細管230是用于液相層析的抗腐蝕不銹管。優(yōu)選地，實驗材料注入噴管101經(jīng)送液器105和送液開關器220之間的連接途徑是硅氧烷管231。然后，將實驗材料注入噴管101移動至容器支撐器10中的HT1孔位置，以便在裝有第一支持物(T1)的容器CB1中插入噴管101。將送液開關器220打向所述反應溶液側，通過驅(qū)動送液器105向容器CB1中注入該反應溶液。將送液開關器220轉(zhuǎn)向總RNA溶液201，并通過送液器105注入預定量的溶液201。在等于或低于預定溫度(例如20℃)的溫度下經(jīng)過一段預定時間(例如20-30分鐘)后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向RT酶溶液(酶1)202，以便通過驅(qū)動送液器105注入預定量的溶液202。在將實驗材料注入噴管101從容器CB1中移出后，將容器支撐器10的溫度設定在預定溫度(例如42℃)，通過維持一段預定時間(例如30-60分鐘)進行RT酶反應，從mRNA構建cDNA。在將容器支撐器10的溫度設定在等于或低于預定溫度(例如20℃)的溫度后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向廢液缸210，以便通過驅(qū)動送液器105使容器CB1中的反應溶液排出至廢液缸210中。將送液開關器220轉(zhuǎn)向TE溶液204，以便通過驅(qū)動送液器105向容器CB1中注入預定量的TE溶液204。通過驅(qū)動溶液溫度控制器30，將容器支撐器10的溫度加熱至預定溫度(例如90℃)，以便使mRNA雜交。然后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向用于暫時保存mRNA的容器206，通過驅(qū)動送液器105將解雜交的mRNA溶液轉(zhuǎn)移至容器206中以暫時保存mRNA。(復制支持物的制備)接下來，將描述通過重新使用自上述方法制備的原始cDNA文庫支持物上解雜交的mRNA構建復制支持物的方法。首先，在將實驗材料注入/排出噴管101從容器101移出后，將噴管101移至容器CB2中，通過反向驅(qū)動送液器105在含有復制支持物(T2)的容器CB2中注入暫時保存的mRNA溶液206。然后，重復以上原始支持物的制備步驟。然而，可以省去稍后用于注入總RNA溶液201的步驟。將送液開關器220打向用于容器CB2的反應溶液203側。通過驅(qū)動送液器105在容器CB2中注入該反應溶液。在等于或低于預定溫度(例如20℃)的溫度下維持容器CB2一段預定時間(例如20-30分鐘)，之后將送液開關器220轉(zhuǎn)向RT酶溶液(酶1)202，以便通過驅(qū)動送液器105注入預定量的該溶液。在將實驗材料注入/排出噴管101移出容器CB2后，使容器支撐器10的溫度在預定溫度(例如約42℃)維持一段預定時間(例如30-60分鐘)。在將容器支撐器10的溫度控制在等于或低于室溫(20℃)的溫度后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向廢液缸210。將實驗材料注入/排出噴管101插入容器CB2中，通過驅(qū)動送液器105將容器CB2中的反應溶液排出至廢液缸210中。將送液開關器220轉(zhuǎn)換至TE溶液204，以便通過驅(qū)動送液器105在容器CB2中注入預定量的TE溶液204。然后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向廢液缸210，以便使容器CB2中的TE溶液排出至廢液缸中。通過重復以上操作幾次(優(yōu)選等于或大于5次)，產(chǎn)生從該原始cDNA文庫支持物復制的第一塊復制支持物。通過將構建該復制支持物的循環(huán)操作重復必要次數(shù)，產(chǎn)生必要數(shù)量的復制支持物。圖2是自動構建和復制gDNA文庫支持物的裝置的示意圖。圖2所示用于構建DNA文庫支持物的裝置含有用于將反應溶液等液相輸送至容器中的送液器105、用于對該反應溶液的液相輸送進行轉(zhuǎn)換的送液開關器220、用于在平面內(nèi)的前后左右方向和上下方向驅(qū)動實驗材料注入/排出噴管101的噴管驅(qū)動器100、用于容納放有支持物的容器的容器支撐器10、用于加熱/冷卻該容器中的反應液體的容器溶液溫度控制器30、用于容納其中分別地放置有復制固定化DNA文庫支持物用的實驗材料和實驗溶液的容器的實驗材料容器支撐器20、和用于將該實驗材料容器支撐器控制在預定溫度的實驗材料容器溫度控制器40。優(yōu)選地，鑒于將來與PCR裝置和/或PCR產(chǎn)物分析裝置的連接，容器支撐器10中可以插有96個或更多個實驗材料容器。優(yōu)選地，為了制備復制支持物，實驗材料容器支撐器20含有至少4個用于實驗材料容器的孔。優(yōu)選地，鑒于將來與PCR裝置和/或PCR產(chǎn)物分析裝置的連接，實驗材料容器支撐器20上提供的實驗材料孔的數(shù)量等于或大于10。優(yōu)選地，鑒于采用具有Peltier元件的容器溶液溫度控制器30進行溫度控制，容器支撐器10和實驗材料容器支撐器20由具有良好熱傳導性的鋁制成。(gDNA文庫的原始支持物和其復制支持物的制備)我們將參考圖2和圖5闡述固定有gDNA文庫的原始支持物和其復制支持物的制備。預備必要數(shù)量(T1～Tn)采用具有限制性酶位點的寡核苷酸(有義部分)化學修飾的支持物(例如3mm×3mm×0.1mm)。對于該原始支持物(T1)，與寡核苷酸(反義部分)進行雜交并用限制性酶進行處理，以便產(chǎn)生完全的限制性酶位點。將該原始支持物T1放入容器CB1中，并將采用具有限制性酶位點的寡核苷酸(有義部分)化學修飾的支持物T2～Tn(復制支持物)放入容器CB2～CBn中。將這些容器放入溶液支撐器10中。關于放置順序，將放有原始支持物T1的容器CB1首先插入第一插入孔HT1中，其中均放有復制支持物的第二容器和相繼的容器CB2～CBn則按順序插放。將經(jīng)限制性酶處理的純化gDNA文庫溶液306、DNA連接酶溶液(酶1)305、DNA聚合酶溶液(酶2)302和含有核苷酸(dT、dA、dG、dC)的反應溶液303裝在溫度固定在預定溫度(24℃)的實驗材料溶液支撐器20中。提供用于清洗/洗脫DNA的TE溶液304和廢液缸310。將用于相應溶液的毛細管330與送液開關器220連接。優(yōu)選地，毛細管230是液相層析用抗腐蝕性不銹管。送液開關器220與實驗材料注入/排出噴管101及其它裝置通過送液器105和毛細管230的前端相連。優(yōu)選硅氧烷管231用于該連接。將實驗材料注入/排出噴管101移至容器支撐器10的HT1孔位置，以便使噴管101插入裝有第一支持物(T1)的容器CB1中。將送液開關器220轉(zhuǎn)換至反應溶液303，以便通過驅(qū)動送液器105注入預定量(例如17μl)的反應溶液303。將送液開關器220轉(zhuǎn)換至經(jīng)限制性酶處理的gDNA文庫溶液306，以便通過驅(qū)動送液器105注入預定量(例如2μl)的溶液306。在使容器CB1在等于或低于預定溫度(例如20℃)的溫度維持一段預定時間(例如20-30分鐘)后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向DNA連接酶溶液(酶1)305，以便通過驅(qū)動送液器105在容器CB1中注入預定量(例如1μl)溶液305。在將實驗材料注入/排出噴管101移出容器CB1后，將容器支撐器10的溫度控制在預定溫度(例如37℃)。使容器CB1維持一段預定時間(例如30-60分鐘)后，在支持物T1上產(chǎn)生經(jīng)DNA連接酶固定的gDNA文庫。在將容器支撐器10的溫度控制在預定溫度(例如等于或小于20℃)后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向廢液缸310，以便在容器CB1中插入實驗材料注入/排出噴管101并通過驅(qū)動送液器105排出容器CB1中的反應溶液。將送液開關器220轉(zhuǎn)向TE溶液304，通過驅(qū)動送液器105在容器CB1中注入預定量(例如500μl)的該TE溶液。然后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向廢液缸310，以便排出容器CB1中的該TE溶液。通過重復該步驟幾次(例如等于或大于5次)，清洗該固定化支持物T1。清洗該固定化支持物T1后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向反應溶液303，以便通過驅(qū)動送液器105在容器CB1中注入預定量(例如19μl)的反應溶液303。通過將容器支撐器10的溫度加熱至預定溫度(例如90℃)并使容器CB1維持一段預定時間(例如10-20分鐘)，使反義部分從該固定化gDNA文庫上解雜交。然后，將送液開關器220轉(zhuǎn)向用于暫時保存gDNA文庫(反義部分)的容器306，以便從容器CB1中排出該gDNA文庫(反義部分)溶液。在此階段，完成了第一塊gDNA文庫(有義部分)支持物(原始支持物)的制備。(復制支持物的制備)在將實驗材料注入/排出噴管101移出容器CB1后，將噴管101移至放置有復制支持物(T2)的下一容器CB2中，以便在容器CB2中注入暫時保存的該gDNA文庫(反義部分)溶液306。為了制備復制支持物，重復上述循環(huán)操作必要次數(shù)，以便制備必要數(shù)量的復制支持物。然而，在下述第二個實施方案中，應注意在復制物構建程序中選擇DNA聚合酶溶液(酶2)302，以便通過驅(qū)動送液器105在容器CB2中注入預定量(例如1μl)的溶液302。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性在根據(jù)本發(fā)明的裝置中，可以容易地從mRNA制成固定有cDNA文庫的支持物和從經(jīng)限制性酶處理的gDNA制成固定有gDNA文庫的支持物。盡管在傳統(tǒng)技術中不能從DNA文庫溶液復制產(chǎn)生復制支持物，但可以容易地在短時間內(nèi)以固定化DNA支持物的形式制成必要數(shù)量的復制支持物(至到mRNA和gDNA被化學或物理方式破壞)。通過一度從重要檢測對象的培養(yǎng)細胞或組織中收集微量基因材料，可以制成固定化DNA文庫支持物和其復制支持物。對于這同一種實驗材料，可以進行各種基因研究和檢測。這有許多的好處。通過利用該固定化DNA文庫支持物和其復制支持物，將來可以顯著地節(jié)約用于開發(fā)新基因診斷技術的預算和人工。如果一度收集了患者的血液，或在手術中收集了組織用于基因診斷，則就預防醫(yī)學研究而言，可以容易地實現(xiàn)對此收集的血液/組織的重新利用。這些事實通過使患者的精神和經(jīng)濟損害降低至盡可能少，可以帶來很大的益處。
權利要求
1.構建互補DNA被固定化的cDNA文庫的方法，包括步驟在mRNA與支持物上的oligo(dT)雜交后應用RT酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)進行作用。
2.構建cDNA文庫的方法，包括步驟使mRNA從固定在支持物上的cDNA文庫上解雜交，通過利用所述mRNA在另一支持物上固定相同的cDNA文庫。
3.構建gDNA文庫的方法，包括步驟在使雙鏈gDNA與支持物上具有限制性酶位點的寡核苷酸連接在一起后，固定gDNA文庫。
4.利用權利要求3中制備的所述支持物上所述gDNA文庫的固定化有義部分構建gDNA文庫的方法。
5.構建單鏈gDNA文庫的方法，包括步驟在使權利要求3中制備的所述gDNA文庫的所述反義部分解雜交后，利用反義部分通過合成在支持物上固定有義部分。
6.權利要求1-5之一所要求保護的方法，其中所述支持物預先采用核苷酸或寡核苷酸進行化學修飾。
7.根據(jù)權利要求1-6之一所要求保護的方法制備的固定有DNA文庫的支持物。
8.固定有單鏈DNA文庫的支持物。
全文摘要
本發(fā)明涉及構建cDNA文庫的方法,包括用支持物上的oligo(dT)n與mRNA雜交,并用逆轉(zhuǎn)錄酶處理以固定互補DNA;或構建gDNA文庫的方法,包括將雙鏈染色體DNA文庫與支持物上具有限制性酶切位點的寡核苷酸連接起來,然后固定該gDNA文庫;用于制備它們的復制物的方法;和其上攜帶有由此復制產(chǎn)生的DNA片段的支持物。
文檔編號C12N15/10GK1353752SQ00808415
公開日2002年6月12日 申請日期2000年5月10日 優(yōu)先權日1999年5月10日
發(fā)明者高橋浩二郎, 高井修, 丹花通文 申請人:東洋鋼板株式會社, 日本帕克里津廣島株式會社