專利名稱：中國(guó)對(duì)蝦es15微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中國(guó)對(duì)蝦DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，是一種中國(guó)對(duì)蝦在ES15位點(diǎn)遺傳多 態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明做出之前，國(guó)內(nèi)外有類似的研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)中國(guó)科學(xué)院海洋研究所徐鵬等 (水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001a ；海洋與湖沼，2001b ；水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2003)發(fā)表的《用PCR法快速篩選中國(guó)對(duì) 蝦含微衛(wèi)星的重組陽(yáng)性克隆》、《中國(guó)對(duì)蝦微衛(wèi)星DNA的篩選》和《從中國(guó)對(duì)蝦ESTs中篩選 微衛(wèi)星標(biāo)記的研究》等論文，曾報(bào)道了中國(guó)對(duì)蝦部分基因組文庫(kù)的構(gòu)建、含微衛(wèi)星序列的篩 選等內(nèi)容，并依據(jù)Weber (美國(guó)，馬什菲爾德醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，1990)提出的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)微衛(wèi)星核 心序列進(jìn)行了評(píng)價(jià)，但他的這些研究結(jié)果僅限于研究微衛(wèi)星序列的獲得，沒有進(jìn)一步應(yīng)用 開發(fā)。劉萍等(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，海洋與湖沼，2004)開發(fā)了 8個(gè)SSR 位點(diǎn)，并完成了中國(guó)對(duì)蝦3個(gè)自然群體的遺傳多樣性分析。孫昭寧等(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究 院黃海水產(chǎn)研究所，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2005)用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)中國(guó)對(duì)蝦5個(gè)家系進(jìn)行了系 譜鑒別和遺傳多樣性研究。董世瑞等(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，海洋學(xué)報(bào)， 2006)用2對(duì)微衛(wèi)星鑒定了中國(guó)對(duì)蝦混合養(yǎng)殖的2個(gè)家系的個(gè)體交配所繁殖的6個(gè)家系的 親緣關(guān)系。孟憲紅等(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，海洋水產(chǎn)研究，2006)從33對(duì) 微衛(wèi)星引物中篩選到11對(duì)引物具有多態(tài)性。法國(guó)海洋開發(fā)研究院(IFREMER) 1999年已經(jīng) 從藍(lán)對(duì)蝦種群中找到10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，從斑節(jié)對(duì)蝦中找到3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，這些標(biāo)記在識(shí) 別混養(yǎng)的不同家系時(shí)發(fā)揮了作用。目前，在國(guó)內(nèi)外尚未見有中國(guó)對(duì)蝦微衛(wèi)星多態(tài)性圖譜的 構(gòu)建、特異性遺傳標(biāo)記等方面應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明其目的是提出一種中國(guó)對(duì)蝦DNA分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)方法，主要利用建立的 中國(guó)對(duì)蝦cDNA文庫(kù)中的含有微衛(wèi)星核心序列，在其兩端設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，從 而快速地檢測(cè)中國(guó)對(duì)蝦每個(gè)個(gè)體在此微衛(wèi)星區(qū)的遺傳變異，獲得該引物對(duì)中國(guó)對(duì)蝦多態(tài)性 圖譜，通過圖譜直觀地檢測(cè)出每個(gè)個(gè)體的基因型。本發(fā)明是按照以下操作技術(shù)方案完成的首先提取中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用中國(guó)對(duì)蝦cDNA文庫(kù)中的含有微 衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)中國(guó)對(duì)蝦不同地理群或 中國(guó)對(duì)蝦群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶 進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得中國(guó)對(duì)蝦的遺傳多態(tài)性圖譜。提取中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA，將其稀釋為50ng/l·! 1，每個(gè)PCR反應(yīng)中加入2μ 1，反應(yīng) 總體積為20 μ 1。ES15微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為正鏈5’-GTT TAT GCT ACT TTG GGA CT-3，，負(fù)鏈5，-CTC CTC CTC CTT CTC CTC-3，，使用該引物時(shí)的退火溫度為 50 "C。
PCR擴(kuò)增的加樣參數(shù)為每個(gè)PCR反應(yīng)總體積為20 μ 1，包括IOOng中國(guó)對(duì)蝦基因 組 DNA ；IOX PCR Buffer, 2. 0 μ 1 ；Mg++2. Ommo 1/L ；Tag 酶 IU ；dNTP 各 0. lmmol/L ；本發(fā)明的 引物各0.2 μ mol/L;加ddH20至20 μ 1。使用該引物時(shí)設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為94°C變性 5min ；94°C 40sec，64°C 40sec，72°C 40sec，，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10min，4°C保存。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將PCR產(chǎn)物在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠，12W恒功率電泳1_1. 5 小時(shí)進(jìn)行分離。將膠板通過10%的冰醋酸溶液20min —蒸餾水6min — 0. 的硝酸銀溶 液20min — 3%的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即可得到中國(guó)對(duì)蝦在ES15基因座位的 多態(tài)性圖譜。本發(fā)明技術(shù)具有以下特點(diǎn)(1)本發(fā)明可快捷的獲得中國(guó)對(duì)蝦的ES15遺傳標(biāo)記基因座位的遺傳變異圖譜，方 法簡(jiǎn)便，所得結(jié)果可直觀地檢測(cè)出中國(guó)對(duì)蝦每個(gè)個(gè)體的基因型，從而區(qū)分純合子和雜合子 個(gè)體；(2)本發(fā)明主要應(yīng)用于中國(guó)對(duì)蝦群體間遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證和遺傳圖譜的構(gòu)建等。 PCR引物是本發(fā)明的核心，在中國(guó)對(duì)蝦總?cè)簷z測(cè)中呈現(xiàn)多態(tài)性。


圖1 本發(fā)明的ES15引物對(duì)中國(guó)對(duì)蝦20個(gè)個(gè)體的檢測(cè)圖譜，編號(hào)1_20是中國(guó)對(duì) 蝦的20個(gè)個(gè)體，M是DL 100標(biāo)準(zhǔn)分子量。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明在中國(guó)對(duì)蝦ES 15微衛(wèi)星核心序列DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)方法。首先提取中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用中國(guó)對(duì)蝦cDNA文庫(kù)中的含有微 衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)中國(guó)對(duì)蝦不同地理群或 中國(guó)對(duì)蝦群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶 進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得中國(guó)對(duì)蝦的遺傳多態(tài)性圖譜。1、中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA的提取取對(duì)蝦肌肉組織lOOmg，剪碎后放入1. 5ml離心管 中，加入 pH8. 0 的 TE 溶液(10mmol/L Tris-Cl，l(kimol/L EDTA)475 μ 1，用研磨棒研磨。加 入10%SD S溶液25μ1，混勻。加入20mg/ml蛋白酶K 4 μ 1，混勻，55°C消化2. 5 3h。 重蒸酚抽提兩次，每次lOmin，12000轉(zhuǎn)/min離心5min，取上清；酚氯仿(1 1)抽提一 次，IOmin, 12000轉(zhuǎn)/min離心5min,取上清；氯仿抽提一次5min, 5000g離心5min,取上清。 加入1/25體積的5mol/L NaCl溶液，混勻后再加入兩倍體積的_20°C的無水乙醇沉淀DNA 15min ；挑出的DNA，用70%的乙醇洗滌數(shù)十分鐘，使DNA干燥，用滅菌水500 μ 1充分溶解 后，定量將其稀釋成50ng/y 1的濃度備用。2、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)在中國(guó)對(duì)蝦cDNA文庫(kù)中含有微衛(wèi)星核心序列的基礎(chǔ)上，利 用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列在同一物種相對(duì)于核心序列的高度保守性，據(jù)此在其兩端設(shè)計(jì)特 異性引物，用其擴(kuò)增出該位點(diǎn)的微衛(wèi)星片段。由于微衛(wèi)星核心序列突變率相對(duì)較高，造成微 衛(wèi)星DNA核心序列重復(fù)次數(shù)的增加或減少，即微衛(wèi)星DNA序列長(zhǎng)度的變化，這是檢測(cè)微衛(wèi)星 多態(tài)性的根源。本發(fā)明的微衛(wèi)星區(qū)核心序列兩端的特異性引物序列為正鏈5’-GTT TATGCT ACT TTG GGACT-3，，負(fù)鏈 5，-CTC CTC CTC CTT CTC CTC-3，，使用該引物時(shí)的退火溫度 為 50 0C ο 3、PCR擴(kuò)增首先加樣，加樣量如下中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA(50ng/y 1)，2μ 1 ； IOX PCR Buffer, 2. 0 μ 1 ；Mg++(25mmo 1/L), 2 μ 1 ； Tag 酶(5U/μ 1)，0·2μ 1 ；dNTP (各 2· 5mmol/ L), 2 μ 1 ；本發(fā)明的引物(各lOmmol/μ 1)，2μ 1 ；加滅菌水至20μ 1。其次，進(jìn)行PCR反應(yīng)， 其 PCR 擴(kuò)增儀程序參數(shù)為:94°C變性 5min ；94°C 40sec，64°C 40sec，72°C 40sec，35 個(gè)循環(huán)； 72°C延伸10min，4°C保存。4、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物在8%的變性聚丙烯 酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，電泳儀的功率為12瓦，電泳時(shí)間在1-1. 5小時(shí)左右，即可終止。將膠 板通過10 %的冰醋酸溶液20min —蒸餾水6min - 0. 1%的硝酸銀溶液20min — 3 %的碳酸 鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即得到如圖1所示的多態(tài)性圖譜。
權(quán)利要求
一種中國(guó)對(duì)蝦ES15微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于方法是首先提取中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用中國(guó)對(duì)蝦cDNA文庫(kù)中的含有微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)中國(guó)對(duì)蝦不同地理群或中國(guó)對(duì)蝦群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得中國(guó)對(duì)蝦的遺傳多態(tài)性圖譜；提取中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA，將其稀釋為50ng/μl，每個(gè)PCR反應(yīng)中加入2μl，反應(yīng)總體積為20μl；ES15微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為正鏈5’-GTT TAT GCT ACT TTG GGA CT-3’，負(fù)鏈5’-CTC CTC CTC CTT CTC CTC-3’，使用該引物時(shí)的退火溫度為50℃；PCR擴(kuò)增的加樣參數(shù)為每個(gè)PCR反應(yīng)總體積為20μl，包括100ng中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA；10X PCR Buffer，2.0μl；Mg++2.0mmol/L；Tag酶1U；dNTP各0.1mmol/L；本發(fā)明的引物各0.2μmol/L；加ddH2O至20μl。使用該引物時(shí)設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為94℃變性5min；94℃40sec，64℃40sec，72℃40sec，，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將PCR產(chǎn)物在8％的變性聚丙烯酰胺凝膠，12W恒功率電泳1-1.5小時(shí)進(jìn)行分離；將膠板通過10％的冰醋酸溶液20min→蒸餾水6min→0.1％的硝酸銀溶液20min→3％的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即可得到中國(guó)對(duì)蝦在ES15基因座位的多態(tài)性圖譜。
全文摘要
一種中國(guó)對(duì)蝦ES15微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測(cè)方法，首先提取中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA；再利用中國(guó)對(duì)蝦cDNA文庫(kù)中的含有微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；并對(duì)中國(guó)對(duì)蝦不同地理群或中國(guó)對(duì)蝦群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物在變性聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，獲得中國(guó)對(duì)蝦在ES15核心序列區(qū)呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜；對(duì)圖譜的條帶進(jìn)行分析，可得到中國(guó)對(duì)蝦每個(gè)個(gè)體在ES15位點(diǎn)的基因型。本發(fā)明可快捷的獲得中國(guó)對(duì)蝦ES15基因座位的遺傳變異圖譜，方法簡(jiǎn)便，可直觀地檢測(cè)出中國(guó)對(duì)蝦每個(gè)個(gè)體的基因型；本發(fā)明主要應(yīng)用于中國(guó)對(duì)蝦群體遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證和遺傳圖譜的構(gòu)建等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101880721SQ20101023093
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者劉萍, 宋春妮, 李健, 李吉濤, 王清印, 陳萍 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所