專利名稱：基于青?；【鷔67的環(huán)境污染物長期微板毒性分析法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及環(huán)境污染物毒性檢測領域，具體地說，涉及一種檢測環(huán)境污染物對青 ?；【鶴67的長期毒性分析方法。
背景技術：
隨著現(xiàn)代工業(yè)的不斷發(fā)展，環(huán)境污染日趨嚴重，其中以化學品的污染尤為突出。水 體環(huán)境是各類污染物最終匯集地點，大量具有不良生態(tài)效應化學品的介入，影響水體的正 常功能，嚴重破壞了生態(tài)平衡，也直接或間接地威脅人類的健康。為了保護水資源和水生生 態(tài)系統(tǒng)，控制污染，必須對水環(huán)境中污染物進行監(jiān)督和評價，并由此建立基于化學分析和生 物檢測的水質評判標準。化學分析法可對水環(huán)境中污染物進行定性與定量分析，卻不能直接反映污染物對 環(huán)境禾口生物的景i口向(Lee，C. M.，Allen，H. E. The ecological risk assessment of copper differs from that ofhydrophobic organic chemicals. Hum Ecol Risk Assess[J]； 1998 ；4 605-617)。污染物對生物體的毒性，并非完全取決于其環(huán)境含量，一些變化的環(huán)境 因素如PH值、氧化還原狀態(tài)等在很大程度上影響污染物生物效應?；瘜W分析數(shù)據(jù)并不能從 整體上反映水質的優(yōu)劣，或反映污染物對生物體和生態(tài)系統(tǒng)的影響。生物毒性測試法可以彌補化學分析法在評價污染物毒性中的不足之處。生物評價 標準中規(guī)定利用敏感生物測試污染物的毒性效應，化學品急性毒性測試中常用的受試生物 有藻類、水蚤、魚類、小鼠等。這些評價體系的不足之處是實驗周期長、操作復雜，不宜用做 常規(guī)檢測。針對上述生物毒性評價體系的不足，以發(fā)光細菌為受試生物的毒性測試法，因快 速、簡便、靈敏、穩(wěn)定、經(jīng)濟而受到關注。大量實驗表明，發(fā)光細菌毒性實驗與魚類毒性實驗 對化合物毒性評價上有良好的相關性(黃正，王家玲.發(fā)光細菌的生理特性及其在環(huán)境監(jiān) 測中的應用·環(huán)境科學[J] ； 1995 ；16 87-90)。青海弧菌Q67 (vibrio qinghaiensis sp.-Q67)屬于淡水發(fā)光細菌，從青海湖 裸鯉體內(nèi)分離得到(馬梅，童中華，王子健，楊篤才，朱文杰.新型淡水發(fā)光菌(vibrio qinghaiensis sp. -Q67)應用于環(huán)境樣品毒性測試的初步研究.環(huán)境科學學報[J] ； 1998 ； 18 86-91)。它屬革蘭氏陰性、兼性厭氧菌，最適生長溫度20 30°C，最適生長pH為6. 0 9. 0。國內(nèi)許多研究采用青?；【鶴67作為污染物毒性測試的受試生物。如利用青?；?菌Q67測定天然水體中不同形態(tài)的銅的毒性作用(黃圣彪，王子健.天然水體中銅的形態(tài) 及其對Q67淡水發(fā)光菌的毒性作用.環(huán)境科學研究[J] ；2003；16 :43_46)，研究2-氯酚、2， 4_ 二氯酚和2，3，4-三氯酚及其混合物發(fā)光抑制毒性(劉征濤，李兆利，李政.氯酚類化合 物對淡水發(fā)光菌Q67的聯(lián)合毒性.環(huán)境科學研究[J] ；2008;21:115-119)，測試水中砷鉻鉛 鎘汞的急性毒性(周世明，趙清，舒為群.青?；【鶴67新鮮培養(yǎng)菌液測試水中砷鉻鉛鎘汞 的急性毒性·預防醫(yī)學情報雜志[J] ；2008 ；24 403-406)。此前發(fā)光細菌毒性測試多采用比色管法，測試儀器不能同時測定大量平行樣品，
4而且試液用量大，浪費昂貴的化學試劑，污染環(huán)境。因此，劉保奇等以多功能酶標儀為檢 測儀器，建立了基于96孔板的微板毒性分析法，暴露時間為15分鐘(劉保奇，葛會林，劉 樹深.測定環(huán)境污染物對青?；【l(fā)光強度抑制的微板發(fā)光法研究.生態(tài)毒理學報[J]； 2006;1:186-191)。微板毒性分析法能多次平行測定樣品毒性，使之具有統(tǒng)計有效性。利 用這一測試體系，研究了有大批化合物及其混合物的毒性，包括酚類化合物(莫凌云，劉海 玲，劉樹深，張?zhí)焐瑒⒈Ｆ?，葛會?5種取代酚化合物對淡水發(fā)光菌的聯(lián)合毒性.生態(tài)毒 理學報[J] ；2006 ；1 :259-264)、苯胺類化合物(葛會林，劉樹深，劉芳.多組分苯胺類混合 物對發(fā)光菌的抑制毒性.生態(tài)毒理學報[J] ；2006 ；1 :295-302)、水溶性有機溶劑(劉樹深， 劉芳，劉海玲.20種水溶性有機溶劑對發(fā)光菌的毒性效應.中國環(huán)境科學[J] ；2008 ；27 371-376)、苯酚與苯胺衍生物(莫凌云，劉樹深，劉海玲.苯酚與苯胺衍生物對發(fā)光菌的聯(lián) 合毒性.中國環(huán)境科學[J] ；2008;28:334-339)、硝基苯衍生物(肖菊，劉樹深，高音旋，張 亞雷.均勻設計用于研究硝基苯衍生物對青?；【鶴67的聯(lián)合毒性.環(huán)境科學研究[J]； 2008;21:120-124)等，獲得了大量化合物毒性的濃度-效應毒性信息。上述研究表明，微 板毒性分析測試法具有操作簡單、靈敏度高、重復性好及環(huán)境友好等優(yōu)點。1995年，國家環(huán)保部頒布的測定水質急性毒性的發(fā)光細菌法國家標準中，規(guī)定的 污染物暴露時間為15分鐘國家環(huán)保部(GB/T 15441-1995水質急性毒性的測定發(fā)光細菌法 [S] ；1995)。短期微板毒性分析法中設定了暴露時間也是15分鐘。然而，人類活動產(chǎn)生的 污染物持續(xù)不斷的進入環(huán)境，這些具有持久性及生物富集性的污染物，對生態(tài)環(huán)境和生物 體會產(chǎn)生長期持久的危害。因此，污染物毒性的檢測不僅要關注其短期效應，也應該著眼于 它們的長期效應。大量研究報道，短期毒性測試會低估具有特定作用機制化合物的毒性 (Newman, Μ. C. , McCloskey, J. Τ. Time-to-event analyses of ecotoxicity data. Ecotoxicology [J] ； 1996 ；5 187-196)。1997 年，Backhaus 等研究了 化學品對海洋發(fā) 光菌費氏弧菌的24小時的毒性，與歐盟規(guī)定化學品毒性標準測試毒性法(測試時間為 30分鐘)相比，發(fā)現(xiàn)抗生素類化學品的毒性顯著性增加，其中氯霉素和四環(huán)素對費氏弧 菌的毒性分別增加 1135 倍和 825 倍(Backhaus，Τ.，F(xiàn)roehner, K.，Altenburger, R.， Grimme, L.H.Toxicity testing with Vibrio fischeri :A comparison between thelong term(24h)and the short term(30min)bioassay. Chemosphere[J] ； 1997 ;35 :2925_2938)。 此后，Backhaus進一步研究了抑制蛋白質合成、細胞壁合成、葉酸合成及DNA轉錄過程的 幾類抗生素的24小時長期毒性，發(fā)現(xiàn)費氏弧菌對抑制蛋白質合成、DNA轉錄過程的抗生 素的敏感性最強。如萘啶酸對費氏弧菌幾乎沒有短期毒性，而24h后的長期毒性的EC50 去口達到 0. 2lmg/L(Backhaus，Τ.，Grimme, L H. The toxicity of antibiotic agents to the luminescentbacterium Vibrio fischeri. Chemosphere[J] ； 1999 ；38 :3291_3301)o Froehner等人研究也表明，該長期毒性分析法更適合檢測對費氏弧菌具有特定作用位點 的化學品的毒性，例如抗生素(Froehner, K. ，Backhaus, T. ，Grimme, L. H. Bioassays with Vibrio fischeri for the assessment ofdelayed toxicity. Chemosphere[J] ；2000 ；40 821-828)。上述以海洋發(fā)光細菌費氏弧菌為受試生物的研究表明，發(fā)光細菌短期毒性測試法 會低估抗生素類物質的毒性，延長測試時間可以合理的評估具有特定作用機制的化合物的生態(tài)毒性。然而，對于淡水中水體污染物毒性測試尚無相對應的基于發(fā)光菌的長期毒性測 試方法。為此，本方法用青海弧菌Q67為測試菌株，在其短期毒性測試方法的基礎上建立長 期微板毒性分析方法。建立基于青?；【鶴67的環(huán)境污染物長期微板毒性分析法，能有助 于全面的了解污染物的毒性效應，能更深入的了解污染物的毒理作用機制與途徑，更能體 現(xiàn)實際環(huán)境中污染物暴露的現(xiàn)象和信息。文獻檢索結果表明在本發(fā)明之前，未發(fā)現(xiàn)以青?；【鶴67為受試生物檢測環(huán)境 污染物長期毒性方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是針對傳統(tǒng)污染物發(fā)光細菌毒性檢測方法的不足及環(huán) 境中新興污染物濃度低、作用時間長等特點，在傳統(tǒng)短期性毒性檢測方法基礎上強調(diào)時間 因素對毒性的影響，建立一種基于青?；【鶴67的環(huán)境污染物長期微板毒性分析法，該法 可以有效地檢測在環(huán)境中含量低、存在時間長且對受試生物有特定作用位點的污染物的毒 性。為解決上述技術問題，采用的技術方案如下一種基于青?；【鶴67的環(huán)境污染物長期微板毒性分析法，包括以下步驟(1)青海弧菌Q67普通培養(yǎng)基配制與培養(yǎng)分別稱取KH2PO4 27. 2mg, Na2HPO4 · 12H20 71. 6mg, MgSO4 · 7H20 0. 5g, MgCl2 · 6H20 1. 22g, CaCl2 66. Omg, NaHCO3 2. 68g, NaCl 3. 08g，酵母浸出膏 5. Og，胰蛋白胨 5. Og，甘油 3. 0g，加熱溶解于IOOOmL蒸餾水中，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8. 5士0. 5，按照常規(guī)滅菌 操作于121°C下高壓蒸汽滅菌20min，即得青海弧菌Q67普通培養(yǎng)基，冷卻后使用或放置于 4°C冰箱保存?zhèn)溆?。以上培養(yǎng)基中所有成分均可在市場(如上海國藥集團化學試劑有限公 司)購買得到。(2)青海弧菌Q67的固體平板培養(yǎng)基配制取步驟(1)所得普通培養(yǎng)基IOOmL,加入1.5 2. Og瓊脂，加熱使溶解至透明，按 照常規(guī)滅菌操作經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌20min，取出后在無菌操作條件下趁熱倒入平板中， 每塊平板含前述溶液9 11ml，冷卻后使用或保存于4°C冰箱備用，即得青海弧菌Q67固體
平板培養(yǎng)基。(3)青?；【鶴67菌種的配制與培養(yǎng)取出_20°C保存的青?；【湫途闝67冷凍干粉IOOmg (該菌株購自華東師范大 學，IOOmg/瓶)，用0. 2mL 0. 8% NaCl (質量百分比濃度)溶液溶解，轉接到一塊步驟(2)所 得固體平板培養(yǎng)基上，22士 1°C培養(yǎng)48小時長出菌落后，挑取小米粒大小菌落，接種到50mL 步驟(1)所得普通培養(yǎng)基中，將所得菌液置于振蕩培養(yǎng)箱，振蕩轉速為每分鐘120轉，溫度 保22 士 1°C，培養(yǎng)至100 μ L菌液的相對發(fā)光單位達到30萬以上，此時青?；【鶴67生長進 入對數(shù)生長期，即得青?；【鶴67菌種。根據(jù)此前實驗或參考論文中青?；【鶴67生長曲線(葛會林.預測部分有機污染 物對淡水發(fā)光菌的聯(lián)合毒性.材料與化學工程系[Τ] ；2006 ；碩士學位論文78)，100 μ L菌 液的相對發(fā)光單位首次達到30萬以上即可認為細菌生長進入對數(shù)生長期。因此，在上述菌 種培養(yǎng)過程中，通過在SpectraMax Μ5酶標儀中測定100 μ L菌液的相對發(fā)光單位，當相對
6發(fā)光單位首次達到30萬以上時，即說明青海弧菌Q67進入對數(shù)生長期，達到對數(shù)生長期時 間一般需14小時。只有處于對數(shù)生長期的發(fā)光菌且相對發(fā)光單位達到30萬以上時，青?；?菌Q67方可用于污染物毒性測定實驗或為長期微板毒性分析法提供菌種。若青海弧菌Q67 生長超過對數(shù)生長期，則細菌會進入衰亡期，各種生理、生化代謝活動將不穩(wěn)定。此時，即使 100 μ L菌液的相對發(fā)光單位達到30萬以上也不使用。(4)青海弧菌Q67微板培養(yǎng)基的配制分別稱取KH2PO4 27. 2mg, Na2HPO4 · 12H20 71. 6mg, MgSO4 · 7H20 0. 5g, MgCl2 · 6H20 1. 22g, CaCl2 66. Omg，NaHCO3 2. 68g, NaCl 3. 08g，酵母浸出膏 8. 78g，胰蛋白胨 6. 63g，甘油 6.90g，加熱溶解于IOOOmL蒸餾水中，利用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8. 5士0. 5，按照常規(guī) 滅菌操作于121°C下高壓蒸汽滅菌20min，即得青?；【鶴67微板培養(yǎng)基，冷卻后使用或于 4°C冰箱保存?zhèn)溆?。長期微板毒性分析法首先要保證青?；【鶴67在微板中正常生長的營養(yǎng)條件，然 而普通培養(yǎng)基無法提供青?；【鶴67在微板上長期生長所需的營養(yǎng)濃度。因此，需專門對 普通培養(yǎng)基采用合適的方法進行優(yōu)化，使其能夠適應青海弧菌Q67在微板上生長的營養(yǎng)需 求。發(fā)明人利用均勻設計實驗方法及多元線性回歸對影響微板中青?；【L的三個因 素酵母浸出膏、胰蛋白胨、甘油進行優(yōu)化，得到上述青?；【鶴67微板培養(yǎng)基。經(jīng)測定，該 微板培養(yǎng)基可支持青海弧菌Q67在微板上至少12小時正常生長，青海弧菌Q67在微板上12 個小時內(nèi)生長發(fā)光曲線如圖1所示，圖中數(shù)據(jù)點及誤差棒分別表示微板上60個微孔中細菌 相對發(fā)光強度平均值及標準偏差。微板上Q67相對發(fā)光強度前30分鐘稍微增長，隨后不斷 降低，至第180分鐘達到最低點，隨后相對發(fā)光強度不斷增加，表明青海弧菌Q67進入對數(shù) 生長期。由圖1可知，微板上各微孔中的青?；【鶴67的相對發(fā)光強度在12小時培養(yǎng)時間 內(nèi)呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性與均勻性。因此，可以將污染物毒性測定時間設置在12小時以內(nèi)。 而將長期微板毒性分析法污染物毒性測定時間長度設定為12小時最佳。(5)微板加樣菌液的配制將步驟(3)所得的菌種與步驟(4)所得的微板培養(yǎng)基混合均勻，使100 μ L前述混 合液的相對發(fā)光強度達到0. 8 X IO5 1. 2 X IO5相對發(fā)光單位，即得微板加樣菌液。當混合 液(即微板加樣菌液)的相對發(fā)光強度達到1.0Χ105相對發(fā)光單位時效果更好。進一步，步驟(3)所得的菌種與步驟⑷所得的微板培養(yǎng)基之間的體積比是 1 5 1 3。當體積比為1 4時發(fā)明效果更好。以1 4比例混合方式為例，說明混合步驟取4°C冰箱中保存的微板培養(yǎng)基放置 于常溫下30分鐘或更長時間，使微板培養(yǎng)基恢復至常溫；利用ImL移液器吸取SmL步驟(4) 所得微板培養(yǎng)基于加樣槽中，然后再移入2mL步驟(3)所得菌種，利用移液器吹打混合液， 使其混合均勻；然后測定100 μ L混合液的相對發(fā)光單位，即可。(6)微板加樣受試樣品溶液濃度設計污染物的實驗濃度梯度設計方案、測試污染物濃度數(shù)量根據(jù)不同檢測的要求變 化。等比濃度稀釋方案可以檢測更大范圍內(nèi)污染物的毒性效應。因此，本發(fā)明以等比濃度 稀釋方案為例，說明微板中樣品濃度設計。本發(fā)明采用等比濃度稀釋方法設計12個微板加 樣受試樣品溶液濃度，具體采用下列公式Cn=CilX^i-1,n= 1，2，L 12.確定受試樣品溶液的 12個濃度梯度。
7 其中，Ctl為樣品儲備液濃度；cn為第η個梯度的受試樣品溶液濃度。根據(jù)下列 條件確定最高受試樣品溶液濃度和稀釋因子P:通過預實驗確定最高受試樣品溶液濃度下 的樣品溶液對微板上青?；【鶴67發(fā)光強度的長期抑制率須達到50%以上(即最高抑制 率)，最低受試樣品溶液濃度下的樣品溶液對微板上青?；【鶴67發(fā)光強度的長期抑制率 為-5% +5% (即最低抑制率)；此時，根據(jù)最高抑制率時的效應濃度(CH，)與最低抑制 率時的效應濃度(CJ以及需要測試的濃度梯度個數(shù)n，可以根據(jù)下面公式計算得到稀釋因 子ρ ^ = (CJCh)1^""0。例如，若 Cl = 2. 290X 10_5mol/L，CH = 4. 586 X l(T3mol/L，設計 12 個
的稀釋因子稀釋樣品溶液。一般要求最高濃度樣品溶液對微板上青?；【鶴67發(fā)光強度的長期抑制率須達 到50%以上。此外，污染物的實驗濃度梯度設計方案以及測試濃度數(shù)量η均可根據(jù)不同檢 測的要求而變化。(7)微板加樣與培養(yǎng)取96孔微板，在微板周邊的36個微孔中加入200 μ L蒸餾水。因為長期微板毒性 分析法要求青海弧菌Q67長期在微板中生長，因而需要充分考慮此生長過程中各因素的影 響，保證實驗數(shù)據(jù)的精密度與統(tǒng)計學顯著性。微板周邊孔水分蒸發(fā)速度快于微板上其它微 孔，若長時間放置會導致Q67發(fā)光強度異常，產(chǎn)生邊緣效應。因此，為避免邊緣效應，本發(fā)明 采取獨特的微板設計，將不使用96孔微板周邊的36個微孔，而是加入200 μ L蒸餾水，這樣 可平衡微板與板蓋間狹小空隙內(nèi)的濕度，延緩其它微孔中水分蒸發(fā)速度。在剩余的微孔中隨機選取36個微孔作為加樣孔，每3個微孔作為同一受試樣品溶 液濃度測定的3個平行組，則可以測定12組不同濃度的受試樣品(即污染物)毒性數(shù)據(jù)；剩 下的微孔則作為空白對照液孔。根據(jù)如上微孔位置設計，在加樣孔中先加入由步驟(6)所 制得的受試樣品溶液100 μ L，隨后在前述加樣孔中再加入由步驟(5)所制得的100 μ L微板 加樣菌液。每個濃度的受試樣品溶液平行加樣3次?？瞻讓φ湛诇y定沒有受試樣品(即污 染物)作用下細菌生長的狀況，因此加入100 μ L蒸餾水代替100 μ L受試樣品溶液，隨后再 加入100 μ L微板加樣菌液。加樣完成后，將微板在22士 1°C培養(yǎng)12小時后，在SpectraMax M5酶標儀(美國分子儀器公司)上測定相對發(fā)光強度。為使檢測結果具有統(tǒng)計意義，同一受試樣品的毒性測定要至少3塊微板的青?；?菌Q67發(fā)光抑制實驗。(8)數(shù)據(jù)處理根據(jù)公式(對照組_處理組)/處理組(即對照組相對發(fā)光強度的平均值減去處 理組相對發(fā)光強度的平均值之后與處理組相對發(fā)光強度的平均值的比值)計算濃度_效應 數(shù)據(jù)，其中處理組為每一受試樣品濃度的3個平行微孔測試所得相對發(fā)光強度的平均值， 對照組為所有空白對照液孔測試所得相對發(fā)光強度的平均值。從而得到12組受試樣品的 濃度_效應數(shù)據(jù)，對該濃度_效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬合，得到濃度_效應函數(shù)關 系，利用反函數(shù)可進而計算不同效應值對應的受試樣品濃度值即效應濃度，如半數(shù)效應濃 度(EC50)。進一步，參照函數(shù)擬合的確定系數(shù)，以擬合值與實驗值相關性最大，也就是擬合 值與實際測試值均方根誤差最小者為最優(yōu)函數(shù)關系。
例如，在SpectraMax M5酶標儀測定數(shù)據(jù)為青?；【南鄬Πl(fā)光單位。對于同一 塊微板數(shù)據(jù)可在excel中處理，將每一濃度梯度的3個平行測試值取平均值，得到平均后 的12個處理組相對發(fā)光強度。隨后，對所有24個空白對照液孔的發(fā)光強度取平均值得對 照組發(fā)光強度。按(對照組-處理組)/處理組方法計算其抑制效應，對應產(chǎn)生該抑制效應 的受試樣品濃度，可得到該受試樣品的濃度_效應數(shù)據(jù)，對于同一受試樣品3板重復，可以 得到3組原始實驗數(shù)據(jù)。將3板原始實驗數(shù)據(jù)在APTox軟件(軟著登字第062731，登記號 2006SR15065)中處理，可以得到濃度-效應數(shù)據(jù)，上述數(shù)據(jù)也可在Excel或其它數(shù)據(jù)處理軟 件中完成。通過以上方法得到受試樣品的濃度-效應數(shù)據(jù)后，采用APTox軟件中內(nèi)置回歸模 型(Weibull或Logit函數(shù))對濃度-效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬合，參照確定系數(shù)， 選擇擬合值與試驗觀測值均方根誤差最小者為最優(yōu)模型。濃度_效應數(shù)據(jù)的非線性最小二 乘擬合也可以在商業(yè)化軟件Origin或Matlab中進行。根據(jù)選定函數(shù)參數(shù)的擬合值，利用 反函數(shù)可進而計算不同濃度下的效應值，如半數(shù)效應濃度(EC50)。以上方法均在APTox軟 件(軟著登字第062731，登記號2006SR15065)中完成，也可在Excel或其它數(shù)據(jù)處理軟件 中進行。利用上述長期微板毒性分析法測定了部分殺蟲劑、除草劑及抗生素的長期毒性與 時間依賴性毒性。與常規(guī)15分鐘短期微板毒性分析法測定數(shù)據(jù)對比，發(fā)現(xiàn)抗生素如氯霉素 與鹽酸四環(huán)素的短、長期毒性EC50之比分別為9. 67與154. 38，硫酸鏈霉素與硫酸巴龍霉 素各自短、長期毒性EC50差異更大。由此可見，常規(guī)的短期微板毒性分析法在測定某些化 合物的毒性方面存在很多局限之處，如果將長期微板毒性分析法與短期微板毒性分析法結 合，則可以更為合理的評價污染物的毒性。


圖1為青?；【鶴67在微板上12小時內(nèi)的生長發(fā)光曲線。圖2為本發(fā)明用微板加樣設計圖。
具體實施例方式以下通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明。以下通過實施例和附圖進一步說明本發(fā)明。實施例1用本發(fā)明毒性分析法進行威爾伯長期毒性測定，包括以下步驟(1)青?；【鶴67普通培養(yǎng)基配制與培養(yǎng)分別稱取KH2PO4 27. 2mg, Na2HPO4 · 12H20 71. 6mg, MgSO4 · 7H20 0. 5g, MgCl2 · 6H20 1. 22g, CaCl2 66. Omg, NaHCO3 2. 68g, NaCl 3. 08g，酵母浸出膏 5. Og，胰蛋白胨 5. Og，甘油 3. Og，加熱溶解于IOOOmL蒸餾水中，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8. 5士0. 5，按照常規(guī)滅菌 操作于121°C下高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后使用。以上培養(yǎng)基中均通過上海國藥集團化學 試劑有限公司購買得到。(2)青?；【鶴67的固體平板培養(yǎng)基配制取步驟(1)所得普通培養(yǎng)基IOOmL,加入1.5 2. Og瓊脂，加熱使溶解至透明，按 照常規(guī)滅菌操作經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌20min，取出后在無菌操作條件下趁熱倒入平板中， 每塊平板含前述溶液9 11ml，冷卻后使用。
(3)青?；【鶴67菌種的配制與培養(yǎng) 取出_20°C保存的青海弧菌典型菌株Q67冷凍干粉IOOmg (該菌株購自華東師范大 學，IOOmg/瓶)，用0. 2mL 0. 8% NaCl溶液溶解，轉接到一塊步驟(2)所得固體平板培養(yǎng)基 上，22 士 1°C培養(yǎng)48小時長出菌落后，挑取小米粒大小菌落，接種到50mL步驟⑴所得普通 培養(yǎng)基中，將所得菌液置于振蕩培養(yǎng)箱，振蕩轉速為每分鐘120轉，溫度保持22士 1°C，培養(yǎng) 至100 μ L菌液的相對發(fā)光單位首次達到30萬以上，此時青?；【鶴67生長進入對數(shù)生長 期，即得青?；【鶴67菌種。(4)青?；【鶴67微板培養(yǎng)基的配制分別稱取KH2PO4 27. 2mg, Na2HPO4 · 12H20 71. 6mg, MgSO4 · 7H20 0. 5g, MgCl2 · 6H20
1.22g, CaCl2 66. Omg，NaHCO3 2. 68g, NaCl 3. 08g，酵母浸出膏 8. 78g，胰蛋白胨 6. 63g，甘油 6. 90g，加熱溶解于IOOOmL蒸餾水中，利用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至8. 5士0. 5，按照常規(guī)滅 菌操作于121°C下高壓蒸汽滅菌20min后，冷卻使用。(5)微板加樣菌液的配制將步驟(3)所得的菌種與步驟⑷所得的微板培養(yǎng)基按體積比為1 4混合均勻， 得到100 μ L前述混合液的相對發(fā)光強度為1. OXlO5相對發(fā)光單位，即得微板加樣菌液。(6)微板加樣受試樣品溶液濃度設計本實施例采用等比濃度稀釋方法設計12個微板加樣受試樣品溶液濃度，具體采 用下列公式Cb=CqX^A1,η = 1，2，L 12.確定受試樣品溶液的12個濃度梯度。其中，Ctl為樣品儲備液濃度，亦即最高受試樣品溶液濃度；cn為第η個梯度的受 試樣品溶液濃度。根據(jù)下列條件確定最高受試樣品溶液濃度和稀釋因子P 通過預實驗確 定最高受試樣品溶液濃度下的樣品溶液對微板上青?；【鶴67發(fā)光強度的長期抑制率須 達到50%以上(即最高抑制率)，最低受試樣品溶液濃度下的樣品溶液對微板上青?；【?Q67發(fā)光強度的長期抑制率為-5% +5% (即最低抑制率)；據(jù)此，得到樣品儲備液濃度為 5. 61Xl(T3mol/L，稀釋因子爐=0.65。(7)微板加樣與培養(yǎng)取96孔微板，在微板周邊的36個微孔中加入200 μ L蒸餾水。在剩余的微孔中隨 機選取36個微孔作為加樣孔，每3個微孔作為同一受試樣品溶液濃度測定的3個平行組， 共測定12組不同濃度的受試樣品毒性數(shù)據(jù)；剩下的微孔則作為空白對照液孔。微板具體設 計如圖2所示96孔微板周圍36孔(黑色)不用，只用60個孔進行長期毒性試驗。以第
2、3、7、11列共24個微孔(灰色)為空白對照液孔；剩余36個微孔(白色)為樣品組，Β4 至Β6為樣品最低濃度的3孔平行，濃度梯度按照由上而下、由左而右依次增大，即G8至GlO 的3孔平行為受試樣品最高濃度組，則可以測定12組不同濃度的受試樣品毒性數(shù)據(jù)。根據(jù)如上微孔位置設計，在加樣孔中先加入由步驟(6)所制得的受試樣品溶液 100 μ L，隨后在前述加樣孔中再加入由步驟(5)所制得的100 μ L微板加樣菌液。每個濃度 的受試樣品溶液平行加樣3次?？瞻讓φ湛诇y定沒有受試樣品作用下細菌生長的狀況，因 此加入100 μ L蒸餾水代替100 μ L受試樣品溶液，隨后再加入100 μ L微板加樣菌液。加樣 完成后，將微板在22士 1°C培養(yǎng)12小時后，在SpectraMax M5酶標儀(美國分子儀器公司) 上測定相對發(fā)光強度。同一受試樣品的毒性測定共進行3塊微板的青?；【鶴67發(fā)光抑制實驗。
10
(8)數(shù)據(jù)處理根據(jù)公式(對照組_處理組)/處理組(即對照組相對發(fā)光強度的平均值減去處 理組相對發(fā)光強度的平均值之后與處理組相對發(fā)光強度的平均值的比值)計算濃度_效應 數(shù)據(jù)，其中處理組為每一受試樣品濃度的3個平行微孔測試所得相對發(fā)光強度的平均值， 對照組為所有空白對照液孔測試所得相對發(fā)光強度的平均值。從而得到12組受試樣品的 濃度_效應數(shù)據(jù)，對該濃度_效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬合，得到濃度_效應函數(shù)關 系，利用反函數(shù)可進而計算不同效應值對應的受試樣品濃度值即效應濃度，如半數(shù)效應濃 度(EC50)。參照函數(shù)擬合的確定系數(shù)，以擬合值與實驗值相關性最大，也就是擬合值與實際 測試值均方根誤差最小者為最優(yōu)函數(shù)關系。根據(jù)上述方法步驟測定Q67發(fā)光強度原始數(shù)據(jù)并按照步驟(8)進行處理得到濃 度-效應數(shù)據(jù)見表1所示。選擇APTox軟件(軟著登字第062731，登記號2006SR15065)中 的Logit，函數(shù)對濃度-效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬合，得到擬合參數(shù)α =9.60，β = 2. 92，相關系數(shù)平方為0. 982，均方根誤差為0. 0433。上述擬合參數(shù)說明，實驗數(shù)據(jù)具有良 好的精密度，所選擬合方程能夠很好的描述威爾伯對青?；【鶴67的長期毒性的濃度_效 應關系。威爾伯長期毒性的EC50值為S.lSXK^mol·!/1。與實驗室此前測定威爾伯短期 毒性EC50值1.80 X IO-3Hiol .L—1相比短期毒性分析法參照(葛會林，劉樹深，劉芳.多組 分苯胺類混合物對發(fā)光菌的抑制毒性.生態(tài)毒理學報[J] ；2006 ；1 :295-302)，以下各實施 例均相同，其長期毒性具有明顯提升。表1.威爾伯長期毒性濃度-效應數(shù)據(jù) 附注X表示實驗中12個濃度梯度值(mol/L)，濃度采用科學計數(shù)法表示，
2. 81E-03等同于2. 81X 10_3，y表示相應濃度梯度產(chǎn)生的效應值(百分率表示)，三組數(shù)為 三板重復的濃度-效應數(shù)據(jù)。以下各表相同。實施例2用本發(fā)明毒性分析法進行撲滅通長期毒性測定方法其余步驟與實施例1相同，不同之處在于步驟(5)中所述體積比為1 5，所 述100 μ L微板加樣菌液相對發(fā)光強度為0.8 X IO5相對發(fā)光單位；步驟(6)中最高抑制率 達到80%以上，樣品儲備液濃度為2. 22 X 10_3mol/L，稀釋因子P = 0.65 ；根據(jù)上述方法步驟 測定Q67發(fā)光強度原始數(shù)據(jù)并按照步驟(8)進入預處理得到濃度_效應數(shù)據(jù)如表2所示。 選擇APTox軟件(軟著登字第062731，登記號2006SR15065)中的Weibull函數(shù)對濃度-效 應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬合，得到擬合參數(shù)α =7.47，β = 2. 56，相關系數(shù)平方為 0. 960，均方根誤差為0. 0391。上述擬合參數(shù)說明，實驗數(shù)據(jù)具有良好的精密度，所選擬合方 程能夠很好的描述撲滅通對青?；【鶴67的長期毒性的濃度_效應關系。撲滅通長期毒性 的EC50值為8. 65 X lO—Vol/L。與實驗室此前測定撲滅通短期毒性EC50值1. 97 X 10_3mOl/ L相比，其長期毒性具有明顯提升。表2.撲滅通長期毒性濃度-效應數(shù)據(jù)
1實施例3用本發(fā)明毒性分析法進行嗪草酮長期毒性測定方法其余步驟與實施例1相同，不同之處在于步驟(5)中所述體積比為1 3， 所述100 μ L微板加樣菌液相對發(fā)光強度為1.2Χ IO5相對發(fā)光單位；步驟(6)中樣品儲備 液濃度為3. 56 Xl(T3mo 1/L，稀釋因子識=0.65;根據(jù)上述方法步驟測定Q67發(fā)光強度原始數(shù)據(jù)并按照步驟(8)進入預處理得到濃 度-效應數(shù)據(jù)見表3所示。選擇APTox軟件(軟著登字第062731，登記號2006SR15065)中 的Logit函數(shù)對濃度-效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬合，得到擬合參數(shù)α =9.09，β = 2. 92，相關系數(shù)平方為0. 968，均方根誤差為0. 0464。上述擬合參數(shù)說明，實驗數(shù)據(jù)具有良 好的精密度，所選擬合方程能夠很好的描述嗪草酮對青?；【鶴67的長期毒性的濃度_效 應關系。嗪草酮長期毒性的EC50值為7.77X10_4mol/L。與實驗室此前測定嗪草酮短期毒 性EC50值3. 21 X 10_3mol/L相比，其長期毒性具有明顯提升。表3.嗪草酮長期毒性濃度-效應數(shù)據(jù)實施例4用本發(fā)明毒性分析法進行殺草強長期毒性測定方法其余步驟與實施例1相同，不同之處在于步驟(5)中所述體積比為1 4，所 述100 μ L微板加樣菌液相對發(fā)光強度為1. O X IO5相對發(fā)光單位；步驟(6)中樣品儲備液濃 度為lJlXliTmol/L，稀釋因子爐=0.65;根據(jù)上述方法步驟測定Q67發(fā)光強度原始數(shù)據(jù) 并按照步驟(8)進入預處理得到濃度_效應數(shù)據(jù)見表4所示。選擇APTox軟件(軟著登字 第062731，登記號2006SR15065)中的Weibull函數(shù)對濃度-效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘 擬合，得到擬合參數(shù)α = 4. 27，β = 2. 15，相關系數(shù)平方為0. 968，均方根誤差為0. 0664。 上述擬合參數(shù)說明，實驗數(shù)據(jù)具有良好的精密度，所選擬合方程能夠很好的描述殺草強對 青?；【鶴67的長期毒性的濃度_效應關系。殺草強長期毒性的EC50值為6. 70 X 10_3mol/ L。與實驗室此前測定殺草強對青?；【鶴67沒有短期毒性，其長期毒性具有明顯提升。表4.殺草強長期毒性濃度-效應數(shù)據(jù)實施例5用本發(fā)明毒性分析法進行敵百蟲長期毒性測定方法其余步驟與實施例1相同，不同之處在于步驟(6)中樣品儲備液濃度為 3. 37X 10_2mol/L，稀釋因子P = 0.65;根據(jù)上述方法步驟測定Q67發(fā)光強度原始數(shù)據(jù)并按 照步驟(8)進入預處理得到濃度-效應數(shù)據(jù)見表5所示。選擇APTox軟件(軟著登字第 062731，登記號2006SR15065)中的Weibull函數(shù)對濃度-效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬 合，得到擬合參數(shù)α =6. 53, β =2. 26，相關系數(shù)平方為0.996，均方根誤差為0.0243。上 述擬合參數(shù)說明，實驗數(shù)據(jù)具有良好的精密度，所選擬合方程能夠很好的描述敵百蟲對青 ?；【鶴67的長期毒性的濃度-效應關系。敵百蟲長期毒性的EC50值為9. OOX 10_4mol/ L0與實驗室此前測定敵百蟲短期毒性EC50值1.06X10_2mol/L相比，其長期毒性具有明顯 提升。表5.敵百蟲長期毒性濃度_效應數(shù)據(jù)實施例6用本發(fā)明毒性分析法進行氯霉素長期毒性測定方法其余步驟與實施例1相同，不同之處在于步驟(6)中樣品儲備液濃度為 1. 04X10-3mol/L,稀釋因子P = 0.65;根據(jù)上述方法步驟測定Q67發(fā)光強度原始數(shù)據(jù)并按 照步驟(8)進入預處理得到濃度-效應數(shù)據(jù)見表6所示。選擇APTox軟件(軟著登字第 062731，登記號2006SR15065)中的Weibull函數(shù)對濃度-效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬 合，得到擬合參數(shù)α =7. 00，β =2. 07，相關系數(shù)平方為0.979，均方根誤差為0.0415。上 述擬合參數(shù)說明，實驗數(shù)據(jù)具有良好的精密度，所選擬合方程能夠很好的描述氯霉素對青 ?；【鶴67的長期毒性的濃度-效應關系。氯霉素長期毒性的EC50值為2. 72Χ 10_4mol/ L0與實驗室此前測定氯霉素短期毒性EC50值2.63X10_3mol/L相比，其長期毒性具有明顯 提升。表6.氯霉素長期毒性濃度_效應數(shù)據(jù)實施例7用本發(fā)明毒性分析法進行鹽酸四環(huán)素長期毒性測定方法其余步驟與實施例1相同，不同之處在于步驟(6)中樣品儲備液濃度為 1. 43X10-5mol/L,稀釋因子爐=0.72;根據(jù)上述方法步驟測定Q67發(fā)光強度原始數(shù)據(jù)并按 照步驟(8)進入預處理得到濃度-效應數(shù)據(jù)見表7所示。選擇APTox軟件(軟著登字第 062731，登記號2006SR15065)中的Weibull函數(shù)對濃度-效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬
13合，得到擬合參數(shù)α =14.39，β =2. 55，相關系數(shù)平方為0.979，均方根誤差為0.0575。 上述擬合參數(shù)說明，實驗數(shù)據(jù)具有良好的精密度，所選擬合方程能夠很好的描述鹽酸四 環(huán)素對青?；【鶴67的長期毒性的濃度-效應關系。鹽酸四環(huán)素長期毒性的EC50值為 1. 60Χ 10_6mOl/L。與實驗室此前測定鹽酸四環(huán)素短期毒性EC50值2. 47X 10_4mOl/L相比， 其長期毒性具有明顯提升。表7.鹽酸四環(huán)素長期毒性濃度_效應數(shù)據(jù)實施例8用本發(fā)明毒性分析法進行鹽酸二氟沙星長期毒性測定方法其余步驟與實施例1相同，不同之處在于步驟(6)中樣品儲備液濃度為 1. 15X10_6mOl/L，稀釋因子識=0.84;根據(jù)上述方法步驟測定Q67發(fā)光強度原始數(shù)據(jù)并按 照步驟(8)進入預處理得到濃度_效應數(shù)據(jù)見表8所示。選擇APTox軟件(軟著登字第 062731，登記號2006SR15065)中的Weibull函數(shù)對濃度-效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬 合，得到擬合參數(shù)α = 44.97，β =7. 14，相關系數(shù)平方為0.986，均方根誤差為0.0316。 上述擬合參數(shù)說明，實驗數(shù)據(jù)具有良好的精密度，所選擬合方程能夠很好的描述鹽酸二氟 沙星對青?；【鶴67的長期毒性的濃度_效應關系。鹽酸二氟沙星長期毒性的EC50值為 4. 44Χ liTmol/L。與實驗室此前測定鹽酸二氟沙星短期毒性EC50值3. 86X 10_4mOl/L相 比，其長期毒性具有明顯提升。表8.鹽酸二氟沙星長期毒性濃度_效應數(shù)據(jù) 上述對實施例的描述是為了便于該技術領域的普通技術人員能理解和應用本發(fā) 明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的
一般原理應用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于這里的實施 例，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應該在
本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
一種基于青?；【鶴67的環(huán)境污染物長期微板毒性分析法，包括以下步驟(1)青?；【鶴67普通培養(yǎng)基配制與培養(yǎng)(2)青海弧菌Q67的固體平板培養(yǎng)基配制(3)青?；【鶴67菌種的配制與培養(yǎng)(4)青?；【鶴67微板培養(yǎng)基的配制(5)微板加樣菌液的配制(6)微板加樣受試樣品溶液濃度設計(7)微板加樣與培養(yǎng)(8)數(shù)據(jù)處理，計算不同濃度下的效應值。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于青海弧菌Q67的環(huán)境污染物長期微板毒性分析法，其特 征在于(1)青?；【鶴67普通培養(yǎng)基配制與培養(yǎng)分別稱取 KH2PO4 27. 2mg, Na2HPO4 · 12H20 71. 6mg, MgSO4 · 7H20 0. 5g, MgCl2 · 6H20 1. 22g, CaCl2 66. Omg, NaHCO3 2. 68g, NaCl 3. 08g，酵母浸出膏 5. Og，胰蛋白胨 5. Og，甘油 3. 0g，加熱溶解于IOOOmL蒸餾水中，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8. 5士0. 5，按照常規(guī)滅菌 操作于121°C下高壓蒸汽滅菌20min，即得青?；【鶴67普通培養(yǎng)基，冷卻后使用或放置于 4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?2)青?；【鶴67的固體平板培養(yǎng)基配制取步驟(1)所得普通培養(yǎng)基IOOmL,加入1.5 2. Og瓊脂，加熱使溶解至透明，按照常 規(guī)滅菌操作經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌20min，取出后在無菌操作條件下趁熱倒入平板中，每塊 平板含前述溶液9 11ml，冷卻后使用或保存于4°C冰箱備用，即得青?；【鶴67固體平板培養(yǎng)基；(3)青?；【鶴67菌種的配制與培養(yǎng)取出-20°C保存的青?；【湫途闝67冷凍干粉lOOmg，用0. 2mL 0.8% NaCl溶液溶 解，轉接到一塊步驟(2)所得固體平板培養(yǎng)基上，22 士 1°C培養(yǎng)48小時長出菌落后，挑取小 米粒大小菌落，接種到50mL步驟(1)所得普通培養(yǎng)基中，將所得菌液置于振蕩培養(yǎng)箱，振蕩 轉速為每分鐘120轉，溫度保持22 士 1°C，培養(yǎng)至100 μ L菌液的相對發(fā)光單位達到30萬以 上，此時青海弧菌Q67生長進入對數(shù)生長期，即得青海弧菌Q67菌種；(4)青?；【鶴67微板培養(yǎng)基的配制分別稱取 KH2PO4 27. 2mg, Na2HPO4 · 12H20 71. 6mg, MgSO4 · 7H20 0. 5g, MgCl2 · 6H20 1. 22g, CaCl2 66. Omg, NaHCO3 2. 68g, NaCl 3. 08g，酵母浸出膏 8. 78g，胰蛋白胨 6. 63g，甘油 6.90g，加熱溶解于IOOOmL蒸餾水中，利用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8. 5士0. 5，按照常規(guī) 滅菌操作于121°C下高壓蒸汽滅菌20min，即得青?；【鶴67微板培養(yǎng)基，冷卻后使用或于 4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?5)微板加樣菌液的配制將步驟(3)所得的菌種與步驟(4)所得的微板培養(yǎng)基混合均勻，使100 μ L前述混合液 的相對發(fā)光強度達到0. 8 X IO5 1. 2 X IO5相對發(fā)光單位，即得微板加樣菌液；(6)微板加樣受試樣品溶液濃度設計污染物的實驗濃度梯度設計方案、測試濃度數(shù)量根據(jù)不同檢測的要求變化，等比濃度稀釋方案可以檢測更大范圍內(nèi)污染物的毒性效應，因此，本發(fā)明以等比濃度稀釋方案為例， 說明微板中樣品濃度設計；采用下列公式 ,η= 1,2, L 12.確定12個受試樣品 溶液等比濃度梯度；其中，Ctl為樣品儲備液濃度，亦即最高受試樣品溶液濃度C1 ;cn為第η 個梯度的受試樣品溶液濃度；根據(jù)下列條件確定最高受試樣品溶液濃度和稀釋因子識預 實驗確定最高受試樣品溶液濃度下的樣品溶液對微板上青?；【鶴67發(fā)光強度的長期抑 制率(即最高抑制率)須達到50%以上，最低受試樣品溶液濃度下的樣品溶液對微板上青 ?；【鶴67發(fā)光強度的長期抑制率(即最低抑制率)為-5% +5% ；此時，根據(jù)最高抑制 率時的效應濃度(Ch)與最低抑制率時的效應濃度(CJ以及需要測試的濃度梯度個數(shù)，可以 根據(jù)下面公式計算得到稀釋因子 污染物的實驗濃度梯度設計方案以 及測試濃度數(shù)量η均可根據(jù)不同檢測的要求而變化；(7)微板加樣與培養(yǎng)取96孔微板，在微板周邊的36個微孔中加入200 μ L蒸餾水，在剩余的微孔中隨機選 取36個微孔作為加樣孔，每3個微孔作為同一受試樣品溶液濃度測定的3個平行組，則可 以測定12組不同濃度的受試樣品毒性數(shù)據(jù)；剩下的微孔則作為空白對照液孔；在加樣孔中先加入由步驟(6)所制得的受試樣品溶液100 μ L，隨后在前述加樣孔中再 加入由步驟(5)所制得的100 μ L微板加樣菌液，每個濃度的受試樣品溶液平行加樣3次； 在空白對照液孔中先加入100 μ L蒸餾水，隨后再加入100 μ L微板加樣菌液；加樣完成后， 將微板在22士 1°C培養(yǎng)，培養(yǎng)時間< 12小時，培養(yǎng)完成后測定相對發(fā)光強度；同一受試樣品的毒性測定要至少3塊微板的青?；【鶴67發(fā)光抑制實驗；(8)數(shù)據(jù)處理根據(jù)公式(對照組-處理組)/處理組計算抑制效應，其中處理組為每一受試樣品濃 度的3個平行微孔測試所得相對發(fā)光強度的平均值，對照組為所有空白對照液孔測試所得 相對發(fā)光強度的平均值；從而得到受試樣品的濃度_效應數(shù)據(jù)，對該濃度_效應數(shù)據(jù)進行非 線性最小二乘擬合，得到濃度-效應函數(shù)關系，利用反函數(shù)進而計算不同濃度下的效應值。
3.根據(jù)權利要求2所述的毒性分析法，其特征在于步驟(5)所述100μ L微板加樣菌 液相對發(fā)光強度為1. OX IO5相對發(fā)光單位。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的毒性分析法，其特征在于步驟(5)所述微板加樣菌液是 由步驟(3)所得的菌種與步驟(4)所得的微板培養(yǎng)基按體積比1 5 1 3混合而成。
5.根據(jù)權利要求4所述的毒性分析法，其特征在于所述體積比為1 4。
6.根據(jù)權利要求2或3或4或5所述的毒性分析法，其特征在于步驟(6)中最高受 試樣品濃度下的樣品溶液對青?；【鶴67發(fā)光強度的抑制率達到80%以上。
7.根據(jù)權利要求2或3或4或5或6所述的毒性分析法，其特征在于步驟(7)中所 述培養(yǎng)時間為12小時。
8.根據(jù)權利要求2或3或4或5或6或7所述的毒性分析法，其特征在于步驟(8)中 參照確定系數(shù)，選擇擬合值與實際測試值均方根誤差最小者為最優(yōu)函數(shù)關系。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于青?；【鶴67的環(huán)境污染物長期微板毒性分析法，本發(fā)明在微板毒性分析法基礎上，以青?；【鶴67為受試生物，在傳統(tǒng)化合物毒性濃度-效應關系中引入時間因素，建立了長期微板毒性分析法，該方法特點在于采用特殊的微板設計與加樣方案、適宜青?；【L的微板培養(yǎng)基，測定環(huán)境污染物對青海弧菌的長期毒性效應，并且多板重復測定同一污染物的毒性，確保實驗結果的統(tǒng)計學顯著性。經(jīng)測定部分環(huán)境污染物對青海弧菌的長期毒性，與短期毒性對比，發(fā)現(xiàn)測試污染物的長期毒性顯著性高于其短期毒性，其中以抗生素的短、長期毒性差異最為顯著，能實際反映對化合物有特異性作用位點化合物的毒性，可以更為合理的評價污染物的毒性。
文檔編號C12Q1/02GK101915759SQ20101023071
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權日2010年7月20日
發(fā)明者劉樹深, 張麗芬, 朱祥偉, 葛會林 申請人:同濟大學