專利名稱：一種可高效清除環(huán)境污染物的轉基因矮牽牛的培育方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可高效清除苯、甲苯等環(huán)境污染物的轉基因矮牽牛的培育方法。
(二)
背景技術：
苯和甲苯在油漆、染色劑、粘合劑、墻紙、地毯、合成纖維、清潔劑和一些有機溶劑 等化工原料中廣泛使用，是室內環(huán)境污染的主要危害氣體之一；此外，在圖文傳真機、電腦 終端機和打印機使用過程中也產生苯和甲苯的污染，煙草的煙霧和汽油的尾氣中也含有 苯和甲苯，而苯和甲苯具有極強的致癌性(王桂華，周中平，傅立新.《室內空氣中苯和甲 苯濃度分布特征調查》.上海環(huán)境科學，2003，22(12) :977-978,982 ;沈學優(yōu)，羅曉璐，朱 利中.《空氣中揮發(fā)性有機化合物的研究進展》.浙江大學學報(理學版)，2001,28(5): 547-556)。對于室內苯和甲苯等污染物造成的空氣污染，人們通常采取的方法是開窗通風 換氣，但由于裝修、辦公和起居生活產生的苯、甲苯等污染物都是緩慢長期釋放的(莊曉 虹，胡筱敏，孫承智.《室內空氣中揮發(fā)性有機物的釋放特征分析》.環(huán)境污染與防治，2008， 30(12) :102-105)，其對入住的戶主危害性極大。 利用植物凈化空氣化學污染是一種經(jīng)濟、有效、非破壞型的環(huán)境污染修復方式。 植物凈化化學性大氣污染的主要過程是持留和去除，持留過程涉及植物截獲、吸附和滯留 等，去除過程包括植物吸收、降解、轉化、同化和超同化等，而且這項技術更容易與環(huán)境融 為一體，種下的花草更能滿足綠化和審美的要求。(李長閣，于濤，傅樺，趙同科.《轉基 因植物修復重金屬污染土壤研究進展》.土壤，2007，39(2) :181-189 ;廖曉勇，陳同斌，閻 秀蘭，聶燦軍.提高植物修復效率的技術途徑與強化措施.環(huán)境科學學報，2007，27(6): 881-892)。但遺憾的是，只有部分自然存在的植物對空氣污染物具有一定的分解凈化功 能，并且其效率非常低。轉基因技術為提高植物的環(huán)境修復能力提供了基礎(胡光珍，王 幼芳，何玉科.轉基因植物對有機污染物的吸收、轉化和降解.植物生理與分子生物學 學報，2005，31 (4) :340-346。 Van Aken B. Transgenic plants for phytoremediation: helpingnature to clean 卯 environmental pollution. Trends Biotechnol，2008， 26(5) :225-227)。細胞色素P4502E1是哺乳動物肝臟中存在的一種分解酶，在動物體內 對有機環(huán)境污染物具有很強的特異性分解功能(Gonzalez FJ. The2006Bernard B. Brodie Award Lecture CYP2E 1. Drug Metab Dispos，2007，35(1) :1-8。 Lee SS， Buters JT， Pineau T， Femandez-SalgueroP， Gonzalez FJ. Role of CYP2E1 in the h印atotoxicity of acetaminophen. J Biol Chem，1996，271 (20) :12063-12067)。 另一方面，矮牽牛(Petunia hybrida)是多年生草本花卉，被譽為"花壇花卉之 王"。它既可以地栽布置花壇；又適宜盆植吊植、美化陽臺居室，深受人們喜愛，在世界各地 廣泛種植。
(三)

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種可高效清除苯、甲苯等環(huán)境污染物的轉基因矮牽牛的培育
3方法。 本發(fā)明采用的技術方案是 —種可高效清除環(huán)境污染物的轉基因矮牽牛的培育方法，所述方法包括 (1)將含有CYP2E1基因(GenBank登記號M15061)的質粒導入發(fā)根農桿菌
(Agrobacterium rhizogenes)，篩選得到抗性菌落；CYP2E1基因是P450酶基因家族中的成
員之一，在哺乳動物肝臟組織中特異性表達，其編碼蛋白在代謝小分子有機污染物中起重
要作用。 (2)步驟(1)抗性菌落的單克隆菌液侵染帶有傷口的野生型矮牽牛(Petunia hybrida)葉片，培養(yǎng)獲得轉基因毛狀不定根； (3)步驟(2)轉基因毛狀不定根在含芐氨基嘌呤1.0mg/L的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得 愈傷組織，愈傷組織在含芐氨基嘌呤1. Omg/L+ a -萘乙酸0. 4mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得叢 生芽，叢生芽在含a-萘乙酸O. lmg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得轉基因矮牽牛的再生植株。
所述含有CYP2E1基因的質粒可自行構建，采用現(xiàn)有已知質粒，本發(fā)明中，所述質 粒為質粒pSLD50-6，由美國華盛頓大學Doty教授惠贈。 本發(fā)明中，所述發(fā)根農桿菌為發(fā)根農桿菌K599 。發(fā)根農桿菌是一種革蘭氏陰性菌， 能侵染大多數(shù)的雙子葉植物、少數(shù)單子葉植物及個別的裸子植物，誘發(fā)被感染植物的受傷 部位長出毛狀根。 所述環(huán)境污染物是指苯或其衍生物，優(yōu)選的，所述環(huán)境污染物為苯或甲苯。
具體的，所述步驟(1)為在發(fā)根農桿菌K599感受態(tài)細胞中加入pSLD50-6的純化 質粒DNA，混勻后冰上放置10min，置于液氮速凍5min， 28。C水浴熱激5min，加入LB液體培 養(yǎng)基于28t:振蕩培養(yǎng)2h后，取菌液涂布于含卡那霉素50mg/L+鏈霉素50mg/L的LB固體培 養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)48h后，篩選得到抗性菌落。 具體的，所述步驟(2)為抗性菌落經(jīng)活化培養(yǎng)后，在含卡那霉素50mg/L+鏈霉素 50mg/L的MS液體培養(yǎng)基中28t:下振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 4 0. 6，離心，收集的菌體細胞 經(jīng)清洗后進行浸染操作；將帶有傷口的野生型矮牽牛的葉片預培養(yǎng)于含乙酰丁香酮20mg/ L的MS液體培養(yǎng)基3d后，用收集的抗性菌落的菌體細胞侵染8min，再轉入含乙酰丁香酮 20mg/L的MS液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)3d，經(jīng)含頭孢霉素500mg/L的MS液體培養(yǎng)基清洗后轉入含 芐氨基嘌呤1. 0mg/L+卡那霉素50mg/L+頭孢霉素500mg/L的MS液體培養(yǎng)基中，長出不定根 后，將不定根轉入含頭孢霉素500mg/L+卡那霉素50mg/L的MS液體培養(yǎng)基中除菌和繁殖， 獲得轉基因毛狀不定根。 本發(fā)明首先將含有CYP2E1基因的載體pSLD50-6和含有對照GUS基因的載體 pKH200分別轉入發(fā)根農桿菌K599，利用農桿菌轉基因法獲得轉CYP2E1和對照GUS基因的 轉基因毛狀不定根，毛狀不定根在MS+BA 1. Omg/L的培養(yǎng)基上誘導出愈傷組織，愈傷組織 在MS+BA l.Omg/L+NAA 0. 4mg/L培養(yǎng)基上獲得叢生芽，叢生芽在MS+NAA 0. lmg/L培養(yǎng)基上 再生植株。經(jīng)過PCR分析，再生植株含有目的基因和rolB基因。隨機選取3株轉CYP2E1基 因的再生植株、1株轉GUS基因的對照植株和l株野生型(非轉基因)植株分別提取植株總 RNA，用GAPDH基因做內參進行熒光定量PCR分析，結果顯示轉CYP2E1基因的再生植株中， 外源CYP2E1基因均高效表達，含GUS基因的對照植株和野生型植株則沒有檢測到CYP2E1 的表達信號。利用氣相色譜定量分析轉基因再生株系對苯和甲苯的吸收情況，結果(r2>0. 99，p < 0. 05)顯示在含有5mL MS液體基本培養(yǎng)基的20mL的有機物分析瓶中，同時加入 42. 5 ii g苯和15 ii g甲苯，6天后0. 75g鮮重的轉CYP2E1基因的再生植株材料，對苯的吸收 率達59. 03%、對甲苯的吸收率達75. 74%，轉CYP2E1基因的再生植株在清除環(huán)境中的苯、 甲苯的能力極顯著地提高；而對照轉GUS基因的植株和野生型植株對苯和甲苯的吸收無明 顯變化。 本發(fā)明的有益效果主要提現(xiàn)在本發(fā)明獲得的矮牽?？捎糜谇宄覂缺胶图妆降?空氣污染物，十分有利于人民的身心健康，有利于提高人民的生活品質，有利于生態(tài)環(huán)境建 設。
(四)


圖1為質粒pSLD50-6圖譜； 圖2矮牽牛轉CYP2E1基因的不定根和再生植株；A :誘導出的不定根；B :不定根誘 導的愈傷組織；C :再生植株；D :自然生長的再生植株； 圖3矮牽牛轉CYP2E1基因再生植株的PCR鑒定；A :CYP2E1基因擴增結果(1 :野生 型發(fā)根農桿菌K599自身攜帶的Ri質粒；2 :組織培養(yǎng)再生的植株；3 9 :轉CYP2E1基因植 株)；B :rolB基因擴增結果(1 :質粒pSLD50_6 ;2 :組織培養(yǎng)再生的植株；3 9 :轉CYP2E1 基因植株)；圖4為熒光定量RT-PCR分析CYP2E1基因在轉CYP2E1基因、轉GUS基因和野 生型(非轉基因)植株中表達情況； 圖5為氣相色譜分析轉CYP2E1基因、轉GUS基因、野生型(非轉基因)矮牽牛植 株對苯的分解吸收情況； 圖6為氣相色譜分析轉CYP2E1基因、轉GUS基因、野生型(非轉基因)矮牽牛植 株對甲苯的分解吸收情況；
(五)
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此 實施例1 :
1.材料與方法
1. 1材料 矮牽牛(Petunia hybrida)品種為QLOl，利用離體葉片組織培養(yǎng)獲得無菌苗。 野生型發(fā)根農桿菌K599由杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院植物學重點實驗室保存，含 CYP2El基因的質粒pSLD50-6(質粒圖譜見圖1)以及對照含GUS基因的質粒pKH200均由美 國華盛頓大學Doty教授惠贈。 1. 2質粒pSLD50-6和pKH200導入野生型發(fā)根農桿菌K599 利用凍融法將質粒pSLD50-6和pKH200分別轉入發(fā)根農桿菌K599，即在 100ii LK599感受態(tài)細胞中加入約0. 1 ii g純化質粒DNA，混勻后在冰上放置10min，置于液氮 速凍5min，立即用28。C水浴熱激5min，加入500 y L LB液體培養(yǎng)基，在28。C緩慢振蕩培養(yǎng) 2h。取100 ii L菌液分別涂布于LB+Km(卡那霉素)50mg/L+Str (鏈霉素)50mg/L固體培養(yǎng) 基上，2『C培養(yǎng)約48h篩選抗性菌落。
1. 3矮牽牛轉基因不定根的誘導和植株再生 參考王琳和向太和的方法(王琳，向太和.《矮牽牛F3' ，5' H全長cDNA的克隆及 花特異啟動子介導表達載體的構建》.熱帶亞熱帶植物學報，2009，17(4) :358-364)，利用改 良的葉盤法對矮牽牛葉片外植體進行遺傳轉化，即發(fā)根農桿菌K599/pSLD50-6或pKH200 于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L平板中劃線28。C活化后，挑取單克隆于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L液體培養(yǎng)基中28 。C ， 200r/min過夜培養(yǎng)。取lmL菌液移入50mL的MS+Km 50mg/ L+Str 50mg/L液體培養(yǎng)基中28°C ， 200r/min培養(yǎng)至0D6。。為0. 5左右，離心管收集菌液并用 MS液體培養(yǎng)基懸浮清洗3次。在無菌條件下侵染事先預培養(yǎng)于MS+As (乙酰丁香酮)20mg/ L3d帶有傷口的葉片8min，轉入MS+As 20mg/L固體培養(yǎng)基共培養(yǎng)3d后，經(jīng)MS+Cef (頭孢霉 素)500mg/L液體培養(yǎng)基清洗3次后轉入MS+6-BA 1. Omg/L+Km 50mg/L+Cef500mg/L的篩選 培養(yǎng)基中。待長出不定根后，將不定根轉入MS+Cef500mg/L+Km 50mg/L培養(yǎng)基中除菌和繁 殖。 根據(jù)CYP2E1基因(GenBank登記號M15061)禾P GUS基因(GenBank登記號 AF354045)設計引物CYP2E1-P1:5' -TGAAGGGTGTGCAGCCGATGACAA-3'
CYP2E1-P2:5' -CATCGGGAATCTTCTCCAGTTGG-3'，
GUS-P1:5' -CTGCGACGCTCACACCGAT-3'，
GUS-P2:5' -TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3'; 同時，參考王琳和向太和的方法(王琳，向太和.《矮牽牛F3' ，5' H全 長cDNA的克隆及花特異啟動子介導表達載體的構建》.熱帶亞熱帶植物學報，2009， 17(4) :358-364)，禾U用弓|物rolB—Pl :5 ' -GCCAGCATTTTTGGTGAACT—3 '禾P rolB—P2 : 5' -CTGGCCCATCGTTCTAAAAAA-3'對獲得的CYP2E1基因和GUS基因的不定根的基因組DNA 進行PCR擴增鑒定。 除菌繁殖后的不定根在MS+BA 1. Omg/L的培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，愈傷組織在 MS+BA 1. Omg/L+NAA 0. 4mg/L培養(yǎng)基獲得叢生芽，叢生芽在MS+NAA 0. lmg/L培養(yǎng)基上再生 根獲得完整植株。此外，同不定根的方法對再生植株進行PCR擴增鑒定。
1. 4矮牽牛轉基因植株CYP2E1基因的熒光定量RT-PCR分析 提取植株總RNA，用Fermentas公司試劑盒RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit進行RT-PCR擴增，熒光定量PCR擴增試劑為TaKaRa公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix。 根據(jù)矮牽牛GAPDH基因序列(GenBank登記 號GQ122207)設計弓|物，GAPDH-F:5 ' -AGCAAGGCAGTTAGTGGTGCA-3 ' 和GAPDH-R : 5 ' -TTGTGATCTCCGCTCCTAGCA-3 '，擴增結果作為內參。根據(jù)CYP2E1基因 序歹lj 設計弓l 物，CYP2E l-F:5 ' -ATTCCCAAGTCCTTTGGCAGG-3 ' ;CYP2E 1-R : 5' -TGTGGTTCAACAGCATCTCCC-3'，進行CYP2E1基因的定量分析。用Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀型進行擴增，熒光定量PCR條件是起始95 °C 2min，隨后95 °C 30s、 59°C 30s、72。C 20s進行40循環(huán)，結束后在4。C保存。參考schmittgen和Livak的方法計算 相對表達量=2-(cT處理-CT內參)(Schmittgen TD，Livak KJ. Analyzing real-timePCR data by the comparative C(T)method. Nat Protoc，2008，3 (6) :1101-1108)。
1. 5矮牽牛轉基因植株對苯和甲苯吸收能力的氣相色譜分析
在20mL的揮發(fā)性有機物分析瓶(VOA(volatile organic analysis)vial)內盛放 5mL MS液體基本培養(yǎng)基，滅菌。在超凈工作臺上無菌切取稱量相同質量(0.75g)的轉基因 無菌苗植株、對照無菌植株的葉莖放入VOAvial中，并設置空白對照瓶(僅有培養(yǎng)基而無 植物材料)，用塑料膜封口 ，放入組織培養(yǎng)室的搖床上，100r/min， 22 24°C ，光照16h/d。 ld后，用微量加樣器向VOA vial中加入42. 5iig苯、15iig甲苯，用帶放氣閥的瓶蓋封口， 繼續(xù)在上述的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。平衡培養(yǎng)2h后，用氣密性氣體取樣器進行第1次取樣，用 Aglient型號為6890N的氣相色譜儀，色譜柱型號為DB-624(30mX0. 53mmX3. Oum)進行檢 測。檢測條件為進樣口溫度為20(TC，檢測組溫度25(TC，分流比為5 : l，用N2以4. OmL/ min恒流洗脫，柱溫60。C，5min，并以20°C /min升到200。C并保持5min，頂空80。C，30min。 隨后2d(48h) 、4d(96h)和6d(146h)分別取樣進行氣相色譜分析。
2.結果與分析 2. 1矮牽牛轉基因不定根和再生植株的獲得 矮牽牛無菌苗離體葉片在發(fā)根農桿菌侵染后10d左右，切口邊緣長出白色小突 起；15d左右，切口邊緣長出明顯可見的白色不定根(圖2A);而未經(jīng)發(fā)根農桿菌侵染的外 植體未見根的生成。待不定根長到5cm左右，切成兩段，培養(yǎng)在無任何植物激素的MS+Cef 500mg/L+Km 50mg/L上除菌。在該培養(yǎng)基上不定根生長旺盛，15 20d即可形成大量毛狀分 枝的不定根。除菌后的轉基因不定根在MS+BA 1.0mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，15d左右不定根出現(xiàn) 綠色愈傷組織(圖2B)。愈傷組織在MS+BA 1. Omg/L+NAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上45d左右，綠色 愈傷組織分化出叢生芽，叢生芽在MS+NAA 0. lmg/L培養(yǎng)基上再生出根而形成完整植株(圖 2C)，且植株在形態(tài)上表現(xiàn)出矮生和叢生分枝狀。 根據(jù)CYP2E1基因序列設計的引物CYP2E1-P1和CYP2E1-P2對轉CYP2E1基因植株 和質粒pSLD50-6均擴增出410bp的條帶；而組織培養(yǎng)再生的植株未能擴增出任何條帶。根 據(jù)rolB基因序列設計的引物rolB-Pl和rolB-P2對隨機選取的7個轉CYP2E1基因和野生 型發(fā)根農桿菌K599自身攜帶的Ri質粒均擴增出約500bp大小的條帶，而組織培養(yǎng)再生的 植株未能擴增出條帶。圖3)。 2. 2轉CYP2E1基因矮牽牛植株熒光定量RT-PCR 在隨機選取的3株轉CYP2E1基因的再生植株、1株轉GUS基因的對照植株和1株野 生型(非轉基因)植株中，用GAPDH基因做內參進行熒光定量PCR分析，結果顯示轉CYP2E1 基因的再生植株中，外源CYP2E1基因均高效表達，含GUS基因的對照植株和野生型植株則 沒有檢測到CYP2E1的表達信號(圖4)。 2. 3轉CYP2E1基因矮牽牛植株對苯和甲苯的分解吸收能力 利用氣相色譜定量分析轉基因再生株系對苯和甲苯的吸收情況，結果(r2 > 0. 99，p < 0. 05)顯示在含有5mL MS液體基本培養(yǎng)基的20mL的有機物分析瓶中，同時加入 42. 5 ii g苯和15 ii g甲苯，6d后0. 75g鮮重的轉CYP2E1基因的再生植株材料對苯的吸收率 達59. 03%、對甲苯的吸收率達75. 74%，分析瓶中苯和甲苯的含量顯著地下降；而對照轉 GUS基因的植株和野生型植株對苯和甲苯的吸收無明顯變化(圖5和6)。
3.結論 植物在近地表大氣污染物的清除中起著重要作用，利用植物凈化空氣污染是一種 經(jīng)濟、有效、非破壞型的環(huán)境污染修復方式；而且這項技術更容易與環(huán)境融為一體，種下的花草更能滿足綠化和審美的要求。但遺憾的是只有部分自然存在的植物對空氣污染物具有 一定的分解凈化功能，并且其效率非常低。轉基因技術為提高植物的環(huán)境修復能力提供了 g石出。 CYP2E1基因是P450酶基因家族中的成員之一，在哺乳動物肝臟組織中特異性表 達，其編碼蛋白在代謝小分子有機污染物中起重要作用。 本發(fā)明成功地通過發(fā)根農桿菌轉基因技術，將細胞色素P4502E1酶基因(CYP2E1) 轉入矮牽牛中，獲得CYP2E1基因高效表達的轉基因植株，具有高效清除苯和甲苯的能力。 本發(fā)明獲得的轉CYP2E1基因花卉矮牽牛，在生產上具有實用性，這為利用花卉園藝植物降 低室內空氣中苯和甲苯的污染提供了一條新途徑。此外，本發(fā)明使用的是發(fā)根農桿菌轉基 因法，獲得的轉基因植株在形態(tài)上表現(xiàn)出矮生和叢生分枝狀，因此也有利于選育出新異形 態(tài)的矮牽牛育種材料。
SEQUENCE LISTING
〈110〉杭州師范大學 〈120〉 一種可高效清除環(huán)境污染物的轉基因矮牽牛的培育方法
〈130〉
〈160>10 〈170>PatentIn version 3. 4 〈210>1 〈211>24 〈212>DNA 〈213>Unknown 〈220〉 〈223〉人工序列 〈400〉 1 tgaagggtgt gcagccgatg acaa 24 〈210>2 〈211>23 〈212>DNA 〈213〉Unknown 〈220〉 〈223〉人工序列 〈400>2 catcgggaat cttctccagt tgg 23 〈210>3 〈211>19 〈212>DNA 〈213>Unknown 〈220〉 〈223〉人工序列
〈400>3 ctgcgacgct cacaccgat 19 〈210>4 <211>24 〈212>DNA 〈213〉Unknown 〈220> <223>人工序列 〈400>4 tcaccgaagt tcatgccagt ccag 24 〈210>5 <211>20 〈212>DNA 〈213〉Unk麗n 〈220〉 <223>人工序列 〈400>5 gccagcattt ttggtgaact 20 〈210>6 〈211>21 〈212>DNA 〈213>Unknown 〈220> 〈223>人工序列 〈400>6 ctggcccatc gttctaaaaa a 21 〈210>7 〈211>20〈212>DNA 〈213>Unknown 〈220> 〈223>人工序列 〈400>7 agcaaggcag ttagtggtgc 20 〈210>8 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉Unknown 〈220>:0122] :0123]
〈223〉人工序列
<400>8
:0124]
ttgtgatctc cgctcctagc a
:0125] 〈210>9
:0126] <211>21
:0127] 〈212>DNA
:0128] 〈213>Unknown
:0129] 〈220〉
:0130] 〈223>人工序列
:0131] 〈400〉9
:0132] attcccaagt cctttggcag g 21
:0133] 〈210>10
:0134] 〈211〉21
:0135] 〈212>DNA
:0136] 〈213>Unknown
:0137] 〈220〉
:0138] 〈223>人工序列
:0139] 〈400〉 10
:0140] tgtggttcaa cagcatctcc c 21
10
權利要求
一種可高效清除環(huán)境污染物的轉基因矮牽牛的培育方法，所述方法包括(1)將含有CYP2E1基因的質粒導入發(fā)根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)，篩選得到抗性菌落；(2)步驟(1)抗性菌落的單克隆菌液侵染帶有傷口的野生型矮牽牛(Petuniahybrida)葉片，培養(yǎng)獲得轉基因毛狀不定根；(3)步驟(2)轉基因毛狀不定根在含芐氨基嘌呤1.0mg/L的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得愈傷組織，愈傷組織在含芐氨基嘌呤1.0mg/L+α-萘乙酸0.4mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得叢生芽，叢生芽在含α-萘乙酸0.1mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得轉基因矮牽牛的再生植株。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述含有CYP2E1基因的質粒為質粒 pSLD50-6。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)根農桿菌為發(fā)根農桿菌K599。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述環(huán)境污染物為苯或甲苯。
5. 如權利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(1)為在發(fā)根農桿菌K599感受態(tài) 細胞中加入pSLD50-6的純化質粒DNA，混勻后冰上放置10min，置于液氮速凍5min， 28。C水 浴熱激5min，加入LB液體培養(yǎng)基于28。C振蕩培養(yǎng)2h后，取菌液涂布于含卡那霉素50mg/L+ 鏈霉素50mg/L的LB固體培養(yǎng)基，2『C培養(yǎng)48h后，篩選得到抗性菌落。
6. 如權利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為抗性菌落經(jīng)活化培養(yǎng)后，在 含卡那霉素50mg/L+鏈霉素50mg/L的MS液體培養(yǎng)基中28。C下振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 4 0. 6，離心，收集的菌體細胞經(jīng)清洗后進行浸染操作；將帶有傷口的野生型矮牽牛的葉片預 培養(yǎng)于含乙酰丁香酮20mg/L的MS液體培養(yǎng)基3d后，用收集的抗性菌落的菌體細胞侵染 8min，再轉入含乙酰丁香酮20mg/L的MS液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)3d，經(jīng)含頭孢霉素500mg/L的 MS液體培養(yǎng)基清洗后轉入含芐氨基嘌呤1. 0mg/L+卡那霉素50mg/L+頭孢霉素500mg/L的 MS液體培養(yǎng)基中，長出不定根后，將不定根轉入含頭孢霉素500mg/L+卡那霉素50mg/L的 MS液體培養(yǎng)基中除菌和繁殖，獲得轉基因毛狀不定根。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可高效清除環(huán)境污染物的轉基因矮牽牛的培育方法，所述方法包括將含有CYP2E1基因的載體pSLD50-6轉入發(fā)根農桿菌K599，利用農桿菌轉基因法獲得轉CYP2E1基因的轉基因毛狀不定根，毛狀不定根在MS+BA 1.0mg/L的培養(yǎng)基上誘導出愈傷組織，愈傷組織在MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L培養(yǎng)基上獲得叢生芽，叢生芽在MS+NAA 0.1mg/L培養(yǎng)基上再生植株，獲得轉基因矮牽牛。本發(fā)明獲得的矮牽牛可用于清除室內苯和甲苯等空氣污染物，十分有利于人民的身心健康，有利于提高人民的生活品質，有利于生態(tài)環(huán)境建設。
文檔編號C12N15/82GK101768603SQ201010039820
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月21日 優(yōu)先權日2010年1月21日
發(fā)明者向太和, 龐基良, 張道祥, 王利琳, 胡江琴 申請人:杭州師范大學