專利名稱：一種以脂氧合酶作為煙草加工輔助的酶制劑及制備、使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于煙草復(fù)烤前添加的提高煙草品級(jí)的酶制劑。
背景技術(shù)：
脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX， EC 1. 13. 11. 12)，又名亞油酸氧化還原酶，俗稱 脂肪氧化酶、脂肪加氧酶、脂肪氧合酶、胡蘿卜素氧化酶或類胡蘿卜素氧化酶等，廣泛存在 于哺乳動(dòng)物、植物和微生物中。下列內(nèi)容中，將根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和習(xí)慣使用類胡蘿卜素氧化酶 或L0X作為脂氧合酶的稱謂，其含義都是一致的。 煙葉是光合作用的產(chǎn)物，其中的質(zhì)體色素等與煙草香味及吸味關(guān)聯(lián)，葉綠素和類 胡蘿卜素是主要的質(zhì)體色素。在煙葉調(diào)制、醇化過程中，類胡蘿卜素類物質(zhì)因雙鍵斷裂的部 位不同可產(chǎn)生很多致香物質(zhì)，如大馬酮、紫羅蘭酮、二氫彌猴桃內(nèi)酯等，降解產(chǎn)物的含量增 加，能增加煙葉香味?？緹煙熑~中的胡蘿卜素是由68%的|3-胡蘿卜素和32%的新_|3-胡 蘿卜素所組成的混合物，而葉黃素的構(gòu)成為60%的葉黃素，22%的新黃素和18%的紫黃 質(zhì)。對(duì)質(zhì)體色素及相關(guān)因素的研究一直是國(guó)內(nèi)外煙草業(yè)的熱點(diǎn)。周冀衡等分析比較不同烤 煙樣品質(zhì)體色素及中性揮發(fā)性香氣物質(zhì)發(fā)現(xiàn)云南、津巴布韋烤煙的質(zhì)體色素及其降解形 成的中性致香物質(zhì)明顯高于其它產(chǎn)區(qū)[周冀衡，等。產(chǎn)煙國(guó)部分煙區(qū)烤煙質(zhì)體色素及主要 揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量比較。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005， (2) :128 132]。楊立均等分析認(rèn) 為在煙葉調(diào)制中，葉綠素和類胡蘿卜素都減少，但葉綠素的降解速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于類胡蘿卜素 的降解速度，由此引起葉組織內(nèi)色素比例的變化，即類胡蘿卜素占色素總量的比例由烘烤 前的38%逐漸增加到烘烤后的76% [楊立均，等。烘烤過程中煙葉色素的降解及與化學(xué) 成分的相關(guān)分析。中國(guó)煙草科學(xué)，2002， (2) :5 7]。云南復(fù)烤片煙進(jìn)行自然陳化研究發(fā) 現(xiàn)，烤煙中多數(shù)香味成分的含量隨陳化時(shí)間的增加呈先升后降趨勢(shì)，比較突出的有P-大 馬酮、P-二氫大馬酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮(a、b、c、d異構(gòu)體)以及 3-羥基大馬酮等[胡有持，等。云南烤煙復(fù)烤片煙自然陳化時(shí)間與質(zhì)量關(guān)系的研究。中國(guó) 煙草學(xué)報(bào)，2004，10(4) :1 7]。類胡蘿卜素含量的增加會(huì)相應(yīng)地提高煙堿、全氯及鉀的含 量，降低鈣含量、全氮/煙堿和還原糖/煙堿比值。對(duì)評(píng)吸統(tǒng)計(jì)而言，煙葉中類胡蘿卜含量 的增加對(duì)于評(píng)吸結(jié)果較為有利。但煙葉的香味與類胡蘿卜素的存在成反比，添加P-胡蘿 卜素的降解產(chǎn)物能夠增濃煙香，改善醇和性，加入量越大，豐滿煙香的效果越明顯，但剌激 性也隨之增加，較為合適的用量為0. 01 % 0. 5%。添加葉黃素的降解產(chǎn)物在烤煙型巻煙 上的使用結(jié)果表明，吸味變得醇和，香味變得優(yōu)雅，并帶有清甜的果香。
脂氧合酶測(cè)定方法較多。生吉萍等總結(jié)了蔬菜中脂氧合酶活性的快速測(cè)定，有甲 基藍(lán)染色(MBB)、胡蘿卜染色(CB)和淀粉-碘化鉀(KI-S)法等。對(duì)新采收的甜玉米，在液氮 中用不銹鋼刀粉碎成粉末，通過玉米粉與-2(TC的冷丙酮以1 : 20的比例混合，用Whatman 過濾，殘?jiān)帽幚淼綉腋∫簾o色。最終的殘留物與5倍的冷丙酮混合，過濾，室溫下真 空干燥過夜后，在研缽中磨碎得丙酮粉，-2(TC保存。由丙酮粉按l : 10(W/V)與0.2mol/L的Tris-HCl (pH8，4。C )緩沖液混合、離心獲得L0X的提取液。L0X活性檢測(cè)以亞油酸鈉為 底物，用0. 3mL L0X提取液加到2. 7mL底物液，用雙光柱分光光度計(jì)和lcm徑長(zhǎng)的石英杯， 測(cè)定0D234nm值，以分析條件下lmin內(nèi)的0D234nm變化值表示酶活力單位。對(duì)于蔬菜L0X的提 取，10(TC水中漂燙0、60、180s。漂燙后切成碎塊，以W/V比加水2倍，用攪拌機(jī)破碎成漿液， 用4層紗布過濾，濾液用于L0X的視覺分析。煮10min的LOX的濾液為對(duì)照。結(jié)果顯示，不 管蔬菜中是否含有類胡蘿卜素，MBB法都是適用的[生吉萍，等。蔬菜中脂氧合酶活性的快 速測(cè)定。食品科學(xué)，2003，4(11) :146 149]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的首先是率先提出一種提取LOX而變廢為寶的方法，即以植物廢棄 物_煙草去頂預(yù)留下的3 5個(gè)上部葉為原料，提取LOX用于催化氧化煙葉中質(zhì)體色素，該 質(zhì)體色素主要指類胡蘿卜素，將其轉(zhuǎn)化為煙草品級(jí)提高和改善的重要前體物，對(duì)片煙復(fù)烤 后的醇化起到積極的輔助調(diào)制作用。 本發(fā)明另一目的是提出一種較為快速簡(jiǎn)易的LOX酶活力測(cè)定方法，并將該方法作
為原料抽樣及提取過程和煙草加工輔助添加的LOX酶制劑的檢測(cè)方法。 本發(fā)明的目的通過以下方式實(shí)現(xiàn)( — )作為煙草加工的輔助酶制劑產(chǎn)品的LOX 該制劑脂氧合酶酶活力為200 300U/mL。 所述制劑脂氧合酶的最佳酶活力為230U/mL。所述制劑中含有PMSF蛋白酶活性抑制劑和去除金屬離子EDTA絡(luò)合劑。 PMSF是抑制蛋白酶活性表現(xiàn)的常用生化試劑。 EDTA化學(xué)名為乙二胺四乙酸二鈉，是常用的金屬離子絡(luò)合劑。 ( 二 )本發(fā)明脂氧合酶酶活力測(cè)定方法 以脂氧合酶作為煙草加工輔助添加的酶制劑的脂氧合酶活力測(cè)定方法，包括以下 步驟 在8mL的比色杯中加入lmL待測(cè)酶液，加入5. OmL提取制備的脂氧合酶底物液，混 勻后在分光光度計(jì)，450nm波長(zhǎng)下即刻讀取起始A = 0D45Qnm值，讀取A值起準(zhǔn)確計(jì)時(shí)20min 時(shí)，讀取B = 0045。 值； 定義每分鐘反應(yīng)體系在450nm波長(zhǎng)下變化0. 0010045。 值為1個(gè)酶活力單位1U ;
樣品酶活力通過計(jì)算式LOX E(U) = N(A-B)/20得到，N為樣品稀釋倍數(shù)。
所述測(cè)定方法所用脂氧合酶底物液為 (1)取煙草收購(gòu)中分級(jí)確定的QF等級(jí)煙葉，去除煙葉中主脈和葉梗物于8(TC下 烘干，研成粉末密閉貯存于棕色瓶中備用； (2)在20mL無水乙醇中加入步驟(I)CIF等級(jí)煙葉的粉末l.Og，加蓋振蕩浸泡 60min，取上清液2. 5mL與2. 5mL蒸餾水混合為底物液。 酶活力測(cè)定時(shí)，將需檢樣品稀釋成適宜酶測(cè)定的稀釋倍數(shù)，所用緩沖液每100mL
中補(bǔ)加有0. 3g Ca(N03)2、0. 3g MgS04和0. lg ZnS04作為基本的酶穩(wěn)定與激活劑，以釋放酶
活性而檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果計(jì)算為產(chǎn)品濃縮液酶活。(三)制備以脂氧合酶作為煙草加工的輔助酶制劑的方法
將煙草后期植株上部去頂、保留3 5個(gè)頂杈葉，其后3 7天內(nèi)割取，抽樣檢測(cè) 脂氧合酶酶活力，合并酶活力相近的頂杈葉作為原料； (2)用pH5. 6緩沖液溶解PMSF蛋白酶抑制劑，使其濃度為0. 01mol/L后加入頂杈 葉，原料質(zhì)量與含有PMSF的緩沖液體積比為lg : 4mL，打碎勻漿，過濾，收集濾液，靜置lh ;
(3)靜置液以3500r/min離心20min，取上清液，加入(NH4) 2S04，使硫酸銨終濃度為 25%，緩慢攪拌溶解，靜置2h后補(bǔ)加(NH》2S04使終濃度為80%，靜置過夜，再41: 15000r/ min離心30min，取上清液，補(bǔ)加濃度(W/V)為10%的(NH4)2S04過夜，再4°C 15000r/min離 心30min，收集沉淀、合并； (4)沉淀用初始緩沖液總量的一半充分溶解后，加入0. 1 % EDTA溶液補(bǔ)體積至原 緩沖液體積，靜置2h，離心，檢測(cè)、兌配多批次上清液酶活力，使制劑酶活力為200 300U/ mL。 所述在步驟(4)獲得的上清液中加入濃度0. 01%的蔗糖低聚物，上清液與蔗糖低
聚物體積比為ioo : i，經(jīng)-81:冷凍干燥濃縮8 io倍得濃縮酶原液制劑。 所述步驟(2)進(jìn)一步為在濾渣中加入緩沖液，以起始原料重量與含有PMSF的緩沖
液體積比為lg : 5mL，攪拌2h，過濾擠渣，濾液與前次濾液合并，靜置lh。 按照本發(fā)明提供的酶活力測(cè)定方法，上述濃縮酶液經(jīng)恢復(fù)活性后在濃縮原液中的
脂氧合酶酶活力為200 300U/mL之間，最佳為230U/mL。(四)本發(fā)明酶制劑的使用方法 將脂氧合酶制劑稀釋250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤(rùn)葉用水，其使用的LOX酶 活力范圍為0. 8 1. 2U/mL。 所述的使用方法進(jìn)一步是將230U/mL的濃縮脂氧合酶制劑稀釋250倍作為片煙復(fù) 烤前的第二次潤(rùn)葉用水，其使用的脂氧合酶最佳酶活力為0. 92U/mL。 以上所用的緩沖液可選擇pH5. 6Britton-Robinsion緩沖液，詳見[印永嘉。大學(xué) 化學(xué)手冊(cè)。濟(jì)南山東科學(xué)出版社，1985]配制方法。改進(jìn)和調(diào)制成pH8. 0的方法參照[劉 士清，等。農(nóng)業(yè)生物環(huán)境中基礎(chǔ)酶技術(shù)研究法修建探討。農(nóng)機(jī)化研究，2008， (10) :162 166,175]使用。 本發(fā)明具有下述積極效果 1.上部煙葉包括上二棚葉和頂葉約占單株產(chǎn)量的40%，是煙葉原料重要資源。但 一般在烘烤后外觀質(zhì)量不夠疏松，葉片僵硬，雜色煙和掛灰煙多，油分少其內(nèi)在質(zhì)量表現(xiàn)為 煙堿含量偏高剌激性大，雜氣較重，香氣量不足，在巻煙配方中不便利用，甚至無法利用，因 而封頂打杈下來的部分多作為廢棄物扔掉[許自成，等。不同采收方式對(duì)烤煙上部葉內(nèi)在 品質(zhì)的影響。西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，33(11) :13 17]。本發(fā)明注 意到LOX是植物普遍存在的生理性酶，對(duì)植物生長(zhǎng)、衰老及損傷具有修復(fù)和保護(hù)作用。封 頂打杈造成的植株損傷，使得植株上部LOX酶活力在3 7d內(nèi)表現(xiàn)較高。本發(fā)明率先利用 在此期間采收的頂杈葉作為制備LOX的提取原料，變廢為寶，提高了煙草的生物質(zhì)利用率。
2.本發(fā)明率先提出了以LOX作為煙葉烘烤后，在復(fù)烤前的加工過程中輔助添加的 酶制劑，進(jìn)一步催化氧化促進(jìn)殘留于煙葉中的質(zhì)體色素-類胡蘿卜素等轉(zhuǎn)化，成為煙草品 級(jí)提高和改善所需的香氣香韻物質(zhì)產(chǎn)生的反應(yīng)重要前體物。 3.以簡(jiǎn)便的方法來提取LOX底物及測(cè)量LOX酶活力。為了保證在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)制劑產(chǎn)品的檢測(cè)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性和可靠性，提出了專門測(cè)定制劑產(chǎn)品的檢測(cè)方法。 4.提取制備的LOX需純化LOX的工藝，提取酶可作為本發(fā)明的申請(qǐng)人"一種煙草
品質(zhì)改善與提高的煙草加工活性復(fù)合酶制劑"的調(diào)配復(fù)合酶制劑基礎(chǔ)或酶組分之一。 5.所去除最頂杈部分用作葉綠素酶提取原料(見申請(qǐng)人"以葉綠素酶作為煙草加
工的輔助酶制劑及制備和使用方法")。 6.本發(fā)明不僅適用于煙草加工，也可用于生物質(zhì)等領(lǐng)域的研發(fā)與應(yīng)用。 本發(fā)明也可以與其它煙草加工活性酶制劑配合使用，或成為申請(qǐng)人"一種煙草品
質(zhì)改善與提高的煙草加工活性復(fù)合酶制劑"的酶組分或調(diào)制復(fù)合酶制劑的基礎(chǔ)物。


圖1是本發(fā)明酶制劑的制備工藝流程圖.
以下結(jié)合具體實(shí)施方式
做進(jìn)一步說明。
本發(fā)明保護(hù)范圍包括但不限于具體實(shí)施方式
列舉的內(nèi)容，還應(yīng)當(dāng)包括與本發(fā)明相 關(guān)的酶的臨時(shí)混合液體或固體制劑，以及臨時(shí)配比調(diào)整。
具體實(shí)施例方式( — )制備本發(fā)明LOX制劑及測(cè)定LOX酶活力方法 將煙草種植最后期的上部去頂，留3 5個(gè)上部葉，在3 7d內(nèi)割取帶葉部分，按 田塊分別收集后分散存放于陰涼處，抽樣檢測(cè)LOX酶活力，或以相近酶活力的合并作為提 取LOX起始原料；或以LOX酶活力檢測(cè)較高的原料作為起始原料，用pH5. 6緩沖液溶解PMSF 蛋白酶抑制劑濃度為0. Olmol/L后，將其加入起始原料中，原料質(zhì)量與含有PMSF的緩沖液 的比為lg : 4mL，充分打碎勻漿，過濾，收集濾液。在濾渣中加入緩沖液，以起始頂杈葉質(zhì)量 與PMSF的緩沖液體積比為lg : 5mL，攪拌2h，過濾擠渣，濾液與前次濾液合并，靜置lh后， 以3500r/min離心20min，取上清液，加入(NH4) 2S04，使硫酸銨終濃度為25%，緩慢攪拌溶 解，靜置2h，然后再補(bǔ)加(NH4) 2S04使終濃度為80 % ，靜置過夜，4°C 15000r/min離心30min， 取上清液，補(bǔ)加濃度(W/V)為10%的(朋4)2504過夜，再4" 15000r/min離心30min，收集沉 淀、合并；用初始緩沖液總量的一半充分溶解沉淀，用0. 1% EDTA溶液補(bǔ)體積至原緩沖液體 積，靜置2h，離心，得到去除金屬離子酶上清液，檢測(cè)酶活力調(diào)制后相互兌配調(diào)整酶活力為 200 300U/mL。進(jìn)一步是在上清液中加入濃度0. 01 %的蔗糖低聚物，使上清液與蔗糖低 聚物體積比為IOO : 1，經(jīng)-『C冷凍干燥濃縮8 10倍得濃縮酶液制劑。
以上LOX酶活力測(cè)定方法是
制備脂氧合酶底物液 (1)取煙草收購(gòu)中分級(jí)確定的QF等級(jí)煙葉，去除煙葉中主脈和葉梗物于8(TC下 烘干，研成粉末密閉貯存于棕色瓶中備用； (2)在20mL無水乙醇中加入步驟(1)QF等級(jí)煙葉的粉末l.Og，加蓋振蕩浸泡 60min，取上清液2. 5mL與2. 5mL蒸餾水混合為底物液。
測(cè)定LOX酶活力 在8mL的比色杯中加入lmL待測(cè)酶液，加入5. OmL提取制備的脂氧合酶底物液，混 勻后在分光光度計(jì)450nm波長(zhǎng)下即刻讀取起始A = 0D45Qnm值，讀取A值起準(zhǔn)確計(jì)時(shí)20min時(shí)，讀取B = 0D45Qnm值；定義每分鐘反應(yīng)體系在450nm波長(zhǎng)下變化0. 0010D45Qnm值為1個(gè)酶 活力單位1U ;樣品酶活力通過計(jì)算式L0X E(U) = N(A-B)/20得到，N為樣品稀釋倍數(shù)。
按照以上制備方法得到的濃縮液酶制劑相當(dāng)于230U/mL的L0X酶活力。該濃縮液 酶制劑以LOX為主，同時(shí)，存在有葉綠素酶、中性蛋白酶、葡萄糖氧化酶和煙堿脫氫酶。
( 二 )本發(fā)明的使用及效果 處理方式以四川涼山B3L等級(jí)為處理對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬煙葉片煙復(fù)烤 醇化過程，考察濃縮酶制劑對(duì)醇化(自然發(fā)酵)前期的影響。將230U/mL的濃縮脂氧合酶制 劑用自來水稀釋250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤(rùn)葉用水，脂氧合酶最佳酶活力為0. 92U/ mL。對(duì)照用相同量的自來水作為潤(rùn)葉水。打葉、復(fù)烤后，各個(gè)包裝500g煙葉，處理平行重復(fù) 不少于3次，在相對(duì)濕度65 %的室溫下自然醇化60天，分別制成煙絲混勻，取樣分析和巻成 巻煙評(píng)吸。各處理煙葉常規(guī)分析為 經(jīng)云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司技術(shù)中心的"煙草致香成份分析檢測(cè)報(bào)告 表明①處理樣與對(duì)照樣所測(cè)的致香成份，在定性方面無明顯差別；②處理樣物質(zhì)致香基 團(tuán)的醛、酮、醇、酸、氮雜環(huán)、酯類和內(nèi)脂類物質(zhì)呈增加趨勢(shì)；③處理樣物質(zhì)致香基團(tuán)的呋喃、 酚、烯烴類呈減少趨勢(shì)；④累計(jì)總量較對(duì)照增加2. 2%相比。 常規(guī)分析中，各成份的量均有不同程度的下降。在專業(yè)評(píng)吸中，與對(duì)照相比，香氣 較對(duì)照透發(fā)，生雜葉有一定改善，煙草基本香未受影響，煙氣顯得較為圓熟，余味較干凈，總 體吃味改善。
權(quán)利要求
一種以脂氧合酶作為煙草加工輔助的酶制劑，其特征是該制劑脂氧合酶酶活力為200～300U/mL。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脂氧合酶作為煙草加工的輔助酶制劑，其特征是該制劑脂 氧合酶的最佳酶活力為230U/mL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的以脂氧合酶作為煙草加工輔助添加的酶制劑，其特征是該 制劑中含有PMSF蛋白酶活性抑制劑和去除金屬離子EDTA絡(luò)合劑。
4. 一種脂氧合酶酶活力的測(cè)定方法，其特征是在8mL的比色杯中加入lmL待測(cè)酶液，加入5. OmL提取制備的脂氧合酶底物液，混勻后 在450nm波長(zhǎng)下即刻讀取起始A = 0045。 值，讀取A值起準(zhǔn)確計(jì)時(shí)20min時(shí)，讀取B = 0D45Qnm 值；定義每分鐘反應(yīng)體系在450nm波長(zhǎng)下變化0. 0010D45。 值為1個(gè)酶活力單位1U ; 樣品酶活力通過計(jì)算式LOX E(U) = N(A-B)/20得到，N為樣品稀釋倍數(shù)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂氧合酶酶活力的測(cè)定方法，其特征是該測(cè)定方法所用脂氧 合酶底物液是(1) 取煙草收購(gòu)中分級(jí)確定的QF等級(jí)煙葉，去除煙葉中主脈和葉梗物于8(TC下烘干， 研成粉末密閉貯存于棕色瓶中備用；(2) 在20mL無水乙醇中加入步驟(l)QF等級(jí)煙葉的粉末1. Og，加蓋振蕩浸泡60min， 過濾取清液2. 5mL與2. 5mL蒸餾水混合為底物液。
6. —種制備如權(quán)利要求1 3所述的以脂氧合酶作為煙草加工的輔助酶制劑的方法， 其特征是(1) 將煙草后期植株上部去頂、保留3 5個(gè)頂杈葉，其后3 7天內(nèi)割取，抽樣檢測(cè)脂 氧合酶酶活力，合并酶活力相近的頂杈葉作為原料；(2) 用pH5. 6緩沖液溶解PMSF蛋白酶抑制劑，使其濃度為0. Olmol/L后加入頂杈葉，原 料質(zhì)量與含有PMSF的緩沖液體積比為lg : 4mL，打碎勻漿，過濾，收集濾液，靜置lh;(3) 靜置液以3500r/min離心20min，取上清液，加入(NH4)2S04，使硫酸銨終濃度為 25%，緩慢攪拌溶解，靜置2h后補(bǔ)加(NH4)2S04使終濃度為80%，過夜，再4°C 15000r/min 離心30min，取上清液，補(bǔ)加濃度(W/V)為10%的(NH4)2S04過夜，在4°C 15000r/min離心 30min，收集沉淀、合并；(4) 沉淀用初始緩沖液總量的一半充分溶解后，加入O. 1% EDTA溶液補(bǔ)體積至原緩沖 液體積，靜置2h，離心，檢測(cè)、兌配多批次上清液酶活力，使制劑酶活力為200 300U/mL。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備以脂氧合酶作為煙草加工的輔助酶制劑的方法，其特征 是在步驟(4)獲得的上清液中加入濃度0.01%的蔗糖低聚物，上清液與蔗糖低聚物體積比 為100 : 1，經(jīng)-8t:冷凍干燥濃縮8 10倍得濃縮酶原液制劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備以脂氧合酶作為煙草加工的輔助酶制劑的方法，其 特征是步驟(2)進(jìn)一步在濾渣中加入緩沖液，原料質(zhì)量與含有PMSF的緩沖液體積比為 lg : 5mL，攪拌2h，過濾擠渣，濾液與前次濾液合并，靜置lh。
9. 應(yīng)用如權(quán)利要求1 3所述的脂氧合酶作為煙草加工輔助的酶制劑的方法，其特征 是將脂氧合酶制劑稀釋250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤(rùn)葉用水，其酶活力范圍為0. 8 1. 2U/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備以脂氧合酶作為煙草加工的輔助酶制劑的方法，其 特征是將濃縮煙堿脫氫酶制劑稀釋作為片煙復(fù)烤前的第二次潤(rùn)葉用水，其最佳酶活力為 0.92U/mL。
全文摘要
一種以脂氧合酶作為煙草加工輔助的酶制劑及制備、使用方法，屬于煙草復(fù)烤前添加的酶制劑。本發(fā)明以煙草種植的后期打頂廢棄物預(yù)留3～5葉上部為L(zhǎng)OX提取原料，多批次提取調(diào)制LOX酶活力為200～300U/mL的濃縮酶原液，提取過程中使用含有PMSF蛋白酶抑制劑的緩沖液，并用EDTA絡(luò)合劑去除金屬離子，本發(fā)明還給出一種簡(jiǎn)便的LOX酶活力測(cè)定方法。用本發(fā)明LOX稀釋液代替片煙復(fù)烤第二次濕葉用水，能轉(zhuǎn)化烤煙煙葉中的質(zhì)體色素類胡蘿卜素，提高煙香和品質(zhì)。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101781638SQ201010039168
公開日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日
發(fā)明者何寶玉, 陳應(yīng)昆, 韓偉 申請(qǐng)人:云南萬芳生物技術(shù)有限公司