一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，具體是指一種利用聚陰離子多糖回收大豆乳清中的大豆凝集素的新方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品加工及副產(chǎn)品綜合利用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆乳清蛋白是殘存于大豆乳清中不能為酸所沉淀的蛋白質(zhì)，在大豆乳清蛋白中2S組分所占的比重較大；乳清蛋白質(zhì)中除含有球蛋白、白蛋白之外，還主要含有:①Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI，ρΗ3.0-10.0，20kDa)；②Bowman-Brik胰蛋白酶抑制劑(BBI，pH3.0-10.0,20KDa) ；(3) β -淀粉酶(61.7KDa) 凝集素(pH 2.2~10.8，120KDa);⑤脂氧合酶(L0X，102KDa)等多種生理活性物質(zhì)，約占大豆蛋白的9%_15.3%。
[0003]大豆凝集素做為大豆中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，在成熟種子中的含量高達(dá)蛋白質(zhì)總量的10%左右，1909年由Wienhaus首次發(fā)現(xiàn)，1952年由Liener和Pallansh等分離得到，1958年制備得到純品。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研宄人們發(fā)現(xiàn)大豆凝集素是大豆中能夠特異性結(jié)合半乳糖、半乳糖胺、N-乙?；?D-半乳糖胺的四聚體糖蛋白。雖然它的生物學(xué)活性可通過(guò)適當(dāng)方法去除，但仍會(huì)有一定量的殘留。大豆凝集素可以抵抗體外和胃腸道內(nèi)蛋白酶的降解，因此，被動(dòng)物采食后可結(jié)合到胃腸道上皮細(xì)胞表面，影響胃腸道黏膜的分泌、吸收、增生等，這是大豆凝集素引發(fā)抗?fàn)I養(yǎng)作用的前提和必要條件。然而，現(xiàn)有研宄表明大豆凝集素在適宜的濃度下可以表現(xiàn)出多種功能特性。例如，凝集素對(duì)于大鼠腸是很有效的外源生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)完全可逆的多胺依賴性小腸增生；低劑量的凝集素可減少身體的脂肪含量，可用于治療肥胖和非醫(yī)療性的減肥；此外，凝集素還能夠促進(jìn)F-actin向G-actin的轉(zhuǎn)變，影響細(xì)胞形態(tài)。
[0004]由于大豆凝集素具有上述的特性，大豆凝集素的應(yīng)用范圍十分廣泛，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)用純品凝集素研宄其對(duì)動(dòng)物的抗?fàn)I養(yǎng)作用；大豆凝集素作為識(shí)別含有半乳糖，半乳糖胺，N-乙酰氨基-D-半乳糖糖鏈的探針，用于細(xì)胞表面的糖基化模式的研宄；以及對(duì)于標(biāo)記癌癥的分化程度有重要作用等多個(gè)領(lǐng)域。目前市場(chǎng)對(duì)純化的大豆凝集素需求日益增加，大多依賴進(jìn)口，價(jià)格也比較昂貴。大豆凝集素傳統(tǒng)的純化方法包括離子交換和磷酸鈣層析。Liener和Pallansch(1952)采用等電點(diǎn)沉淀、硫酸錢分級(jí)沉淀法分離得到了純化的大豆凝集素。Wade等(1958)、張洪淵等(1991)采用離子交換纖維素、羥基磷灰石(HA)柱層析等方法成功進(jìn)行了大豆凝集素的分離純化。親和層析也被應(yīng)用于大豆凝集素的純化過(guò)程，并且純化工藝在不斷更新。由于傳統(tǒng)的大豆凝集素純化方法的純化效率較低，因而人們利用大豆凝集素能與N-乙?；?D-半乳糖胺、半乳糖等配基或配體發(fā)生特異性結(jié)合的能力制備了大豆凝集素親和純化體系。根據(jù)所采用親和介質(zhì)的不同，主要分為半乳糖胺-CH-Sepharose 4B、N_乙?；?D-半乳糖胺-Sepharose 6B和瓜爾膠親和層析體系。例如CN102212112A公開(kāi)了利用親和層析填料D-GalN-FF-s印harose 4B純化得到大豆凝集素的方法。以上體系均存在一定的限制，瓜爾膠純化效率和純度較低，N-乙?；?D-半乳糖胺-Sepharose 6B由于配基N-乙酰基-D-半乳糖胺成本較高限制了其大規(guī)模使用，半乳糖胺-CH-Sephar0Se4B流速有一定限制，以上的分離純化流程都具有比較繁瑣復(fù)雜的程序，條件控制相對(duì)嚴(yán)格。本發(fā)明采用了天然可食性的聚陰離子多糖作為回收材料，充分利用蛋白與多糖的復(fù)凝聚原理，操作簡(jiǎn)單，其形成的復(fù)凝聚物既可以作為食品材料直接利用，也可以完整實(shí)現(xiàn)蛋白與多糖的分離。從資源回收利用的角度來(lái)看，本發(fā)明不僅可以有效降低大豆乳清的抗?fàn)I養(yǎng)組分，還可以制備具有高純度的大豆凝集素組分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，該發(fā)明制備的大豆凝集素純度約90%-93%，仍然保持天然的生理活性。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，步驟如下:
(1)大豆乳清的預(yù)處理:將大豆乳清調(diào)至pH4.5-4.8，9500rpm離心30min，除沉淀；再次調(diào)至pH 8.0-10.0，9500rpm離心30min，收集上清液，即得大豆乳清液；
用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH ；
(2)大豆乳清蛋白的初級(jí)分離:取步驟(I)所得大豆乳清液，調(diào)節(jié)pH至4.5，在4-30°C下加入硫酸錢至終飽和度為50%，9500rpm離心30min，收集沉淀，繼續(xù)向上清中添加硫酸錢至飽和度60%-80%，9500rpm離心30min，收集沉淀；合并兩次沉淀，加入去離子水溶解，使沉淀的質(zhì)量濃度為1%_10%，截留分子量3500透析脫鹽36-72h，截留液用真空冷凍干燥儀進(jìn)行干燥，獲得含有大豆凝集素和β -淀粉酶的P-7S蛋白；
(3)大豆乳清蛋白與聚陰離子多糖復(fù)凝聚:將步驟(2)制備的P-7S蛋白，用去離子水配制終濃度為0.1%-0.4%的P-7S大豆乳清蛋白液，調(diào)節(jié)pH至7.0，待用；配制0.1%_0.4%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)PH至7.0 ;向P-7S大豆乳清蛋白液中緩慢加入按P-7S大豆乳清蛋白液體積計(jì)2.5%-8%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至5.0-4.5，4000rpm離心20min，收集沉淀；對(duì)上清液再次重復(fù)沉淀I次，合并沉淀物，即得大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物；
(4)回收大豆凝集素:將步驟(3)所得大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0-9.0，過(guò)超濾膜除糖，收集濾過(guò)液；截留分子量3000-4000超濾脫鹽，截留液用真空冷凍干燥儀進(jìn)行干燥，即得純化的大豆凝集素。
[0007]步驟(I)大豆乳清的來(lái)源包括:收集常規(guī)的大豆分離蛋白生產(chǎn)形成的副產(chǎn)物，以及實(shí)驗(yàn)室利用脫脂豆柏經(jīng)醇洗后，提取分離蛋白后的乳清液，進(jìn)行預(yù)處理。大豆乳清的預(yù)處理步驟為:首先將大豆蛋白乳清液調(diào)整PH至4.5-4.8，靜止l-2d，離心，除雜蛋白完全，再調(diào)節(jié)至pH8.0-10.0，9500rpm離心30min，收集上清液，即得大豆乳清液。
[0008]步驟(2)大豆乳清蛋白的初級(jí)分離，其條件為:在進(jìn)行鹽析處理前，優(yōu)先將大豆乳清液重新調(diào)整PH至酸性4.5-4.8范圍內(nèi)；溫度范圍以低溫最為適宜，包括但不限于4-30°C ;，其硫酸銨飽和度需達(dá)到50%，除去雜蛋白，然后再上調(diào)其硫酸銨飽和度為60%-80%，其相應(yīng)硫酸飽和度需按照硫酸銨飽和度表，根據(jù)實(shí)際溫度，控制操作；沉淀溶解需加入約2-4倍體積的蒸餾水，溶解完全；脫鹽處理包括但不限于透析，超濾，納濾，需保證脫鹽完全。
[0009]步驟(4)回收大豆凝集素，其條件為:超濾膜除糖截留分子量范圍為100_300kD，收集濾過(guò)液。脫鹽處理包括但不限于透析，超濾，納濾，需保證脫鹽完全。純化的大豆凝集素經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及高效液相色譜SEC-HPLC檢測(cè)樣品純度，經(jīng)過(guò)雙縮脲法測(cè)定蛋白含量，經(jīng)過(guò)苯酚硫酸法(GB/T 15672-2009)測(cè)定含糖量，經(jīng)過(guò)干燥法(GB/T5497-1985)測(cè)定水分，經(jīng)過(guò)灼燒重量法測(cè)定灰分。
[0010]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明對(duì)大豆乳清綜合利用，設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，無(wú)環(huán)境污染。本發(fā)明大豆凝集素回收率高，純度高，蛋白活性高；制備的大豆凝集素純度約90%-93%，仍然保持天然的生理活性。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1大豆凝集素的回收工藝流程圖。
[0012]圖2實(shí)例2所制得大豆凝集素的純度的SEC-HPLC檢測(cè)圖譜。
[0013]圖3實(shí)例2所制得大豆凝集素的純度SDS-PAGE檢測(cè)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1
將大豆乳清調(diào)至pH 4.5,9500rpm離心30min，除沉淀；再次調(diào)至pH 8.0,9500rpm離心30min，棄沉淀，收集上清液。將上述上清液調(diào)節(jié)pH至4.5，量取IL溶液，在4_30°C下按照硫酸錢飽和度表加入固體硫酸錢至50%飽和度，9500rpm離心30min，收集沉淀，上清液繼續(xù)添加硫酸銨至60%飽和度，再次9500rpm離心30min，收集沉淀，合并兩次沉淀，得到含有的大豆凝集素蛋白粗品約0.65g，加入1mL去離子水溶解，截留分子量3500透析脫鹽36小時(shí)，截留液真空冷凍干燥，制得含有大豆凝集素和β -淀粉酶的P-7S蛋白樣品。
[0015]分別精確稱取0.1g上述初級(jí)分離的P-7S蛋白樣品及0.1g聚陰離子多糖粉末，分別溶解于10m