一種高通量的環(huán)境污染物檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境領(lǐng)域中污染物的高通量測定，具體的說是一種高通量的環(huán)境污染物檢測方法。將帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球加入待測水樣中，使其通過流式細(xì)胞儀的流動室，形成單微球的液柱流通至激光測量區(qū)，測量區(qū)的微球被激光照射后，產(chǎn)生待測物的正向、側(cè)向散射光和微球熒光標(biāo)記物的激發(fā)熒光，激發(fā)熒光透過濾光片轉(zhuǎn)化為電信號，通過對微球的染色熒光和待測物散射光轉(zhuǎn)化電信號，對待測物進(jìn)行定性定量的測定。本發(fā)明是利用對水中待測物具有專一性識別能力的微球，在基于流式細(xì)胞技術(shù)原理的儀器，可實(shí)現(xiàn)多種污染物同時快速定性定量檢測。
【專利說明】一種高通量的環(huán)境污染物檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境領(lǐng)域中污染物的高通量測定，具體的說是一種高通量的環(huán)境污染物檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于水環(huán)境中的污染物存在種類多、含量低、樣品基質(zhì)干擾嚴(yán)重等問題，污染物的檢測方法建立及儀器研發(fā)是環(huán)境監(jiān)測和研究中的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。目前，水中污染的測定多經(jīng)過現(xiàn)場采樣、保鮮運(yùn)輸、實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行萃取-凈化-濃縮富集-儀器測定等一系列的環(huán)節(jié)。雖然，常用的萃取-凈化-富集濃縮處理方法能夠在實(shí)際應(yīng)用取得良好的效果，但均需一定量的有機(jī)溶劑，造成環(huán)境污染；液相色譜、氣相色譜、色質(zhì)譜聯(lián)用儀等大型儀器，雖然能夠獲得高靈敏度、準(zhǔn)確的測試結(jié)果，但難以解決水樣易污染、易降解、保存和運(yùn)輸條件嚴(yán)格等問題。近年來，市場上先后出現(xiàn)了一些水中污染物速測的小型儀器，利用常規(guī)有機(jī)物對紫外光的吸收原理，可在現(xiàn)場進(jìn)行水質(zhì)TOC、COD、BOD及部分重金屬離子的測定，但無法對水中各種微量污染物進(jìn)行定性定量，不能滿足水中不同種類污染檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種分子印跡結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)的高通量環(huán)境污染物的檢測方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為:
[0005]一種高通量的環(huán)境污染物檢測方法，將帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球加入待測水樣中，使其通過流式細(xì)胞儀的流動室，形成單微球的液柱通至激光測量區(qū)，測量區(qū)的微球被激光照射后，產(chǎn)生待測物的正向、側(cè)向散射光和微球熒光標(biāo)記物的激發(fā)熒光，激發(fā)熒光透過濾光片轉(zhuǎn)化為電信號，通過對微球的染色熒光和待測物散射光轉(zhuǎn)化電信號，對待測物進(jìn)行定性定量的測定。即，由光信號波長特性及在特征波長下的微球計數(shù)結(jié)果共同對微球定性。由光信號強(qiáng)度和流式細(xì)胞儀的微球計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果對待測物定量。
[0006]所述帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球的制備為:
[0007]I)均相體系制備1-10 μ m聚苯乙烯微球；
[0008]2)聚苯乙烯微球熒光染色；
[0009]3)將染色聚苯乙烯微球于微乳液中溶脹，而后于溶脹體系中加入待測物模板分子、功能單體、引發(fā)劑和分散液在微球表面進(jìn)行聚合，形成帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球。
[0010]所述步驟I)均相體系制備1-10 μ m聚苯乙烯微球:
[0011]無水乙醇與分散劑混合形成均相體系，而后在均相體系中加入引發(fā)劑和單體苯乙烯在40-80°C溫度的條件聚合反應(yīng)10-15小時；得1-10 μ m聚苯乙烯微球；所述按重量份數(shù)計反應(yīng)體系中，每100份苯乙烯單體，加入200-700份無水乙醇，5-15份分散劑和1_3份引發(fā)劑。[0012]所述分散劑為聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇；弓I發(fā)劑為偶氮類引發(fā)劑或過氧化弓I發(fā)劑。
[0013]所述偶氮類引發(fā)劑偶氮二異丁腈或偶氮二異庚腈，過氧化引發(fā)劑為過氧化苯甲酰。
[0014]所述步驟2)聚苯乙烯微球表面熒光染色，將所得聚苯乙烯微球與有機(jī)溶劑混合溶齊[J、吐溫20和染色劑混合超聲分散10min-20min，分散后室溫下靜止放置使有機(jī)混合溶劑揮發(fā)，揮發(fā)后采用小分子量的醇類溶劑洗滌微球后離心，棄去上清液，得到染色聚苯乙烯微球。
[0015]所述有機(jī)混合溶劑為氯仿和異丙醇；染色劑為羅丹明101和吖啶橙；小分子量的醇類為甲醇、乙醇或丙醇。
[0016]按重量份數(shù)計，I份聚苯乙烯微球添加30-60份有機(jī)混合溶劑、0.3-1份吐溫20和0.01-1份染色劑；其中有機(jī)混合溶劑為氯仿和異丙醇，二者的混合按重量份數(shù)計比例為99:1-50:50;染色劑為羅丹明101和吖啶橙，二者的混合按重量份數(shù)計比例為0:100-100:0。
[0017]將鄰苯二甲酸酯和十二烷基磺酸鈉以及蒸餾水通過超聲處理制成微乳液，將微乳液和上述染色聚苯乙烯微球分散液混合，于室溫下440-900rpm轉(zhuǎn)速攪拌溶脹10-17小時，再加入偶氮二異庚腈、甲苯、水和聚乙烯醇水溶液并在室溫下，以440-900rpm轉(zhuǎn)速攪拌溶脹反應(yīng)1-4小時；最后向溶脹體系中加入模板分子、功能單體、分散液水和聚乙烯醇水溶液在室溫下，以440-900rpm轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)1_4小時，在40_70°C下，向體系通氮?dú)庥谖⑶虮砻孢M(jìn)行聚合聚合反應(yīng)18-30小時，形成分子印跡鍵合染色的聚苯乙烯微球。
[0018]所述微乳液按重量份數(shù)計，由I份染色的聚苯乙烯微球分散水液、1-3份鄰苯二甲酸二丁基酯、0.1-0.17份十二烷基磺酸鈉和50-70份蒸餾水混合制成，其中染色的聚苯乙烯微球分散水液濃度為0.1-0.4g/ml ；
[0019]偶氮二異庚腈、甲苯、水和聚乙烯醇水溶液按重量份數(shù)計，0.1-0.4份偶氮二異庚腈、2-5份甲苯、10份聚乙烯醇水溶液和10-20份水混合；其中聚乙烯醇水溶液質(zhì)量濃度為
3.5% -6.8% ；
[0020]向溶脹體系中加入模板分子、功能單體和分散液。按重量份數(shù)計，具體為0.1-0.4份模板分子、0.15-0.4份功能單體、2-4份分散液、10-15份去尚子水和10質(zhì)量份聚乙烯醇水溶液；其中聚乙烯醇水溶液質(zhì)量濃度為3.5% -6.8%。
[0021]所述分散液為乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，功能單體為甲基丙烯酸；模板分子為測定的目標(biāo)化合物。
[0022]將帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球加入待測水樣中放置10-20分鐘使微球充分的吸附待測目標(biāo)物，吸附后微球分散于緩沖溶液中使微球濃度為0.5-2.5mg/mL,而后利用高純水載液將分散有微球的緩沖液加載入流式細(xì)胞儀流通室內(nèi)，使微球的液柱于流動室內(nèi)流通至激光測量區(qū)，測量區(qū)的微球被激光照射后，產(chǎn)生待測物的正向、側(cè)向散射光和微球熒光標(biāo)記物的激發(fā)熒光，激發(fā)熒光透過濾光片轉(zhuǎn)化為電信號，通過對微球的染色熒光和微球表面待測物熒光和紫外光轉(zhuǎn)化的電信號測定待測物進(jìn)行定性定量。所述液流系統(tǒng)包括流動室和光學(xué)系統(tǒng)，待測樣品在流動室與激光相交，流動室由石英玻璃鋼制成，中央開有430 X 180 μ m的長方形孔，供微球單個流過，液流系統(tǒng)在流動室中心，具有良好的光學(xué)特性。通過光學(xué)系統(tǒng)將不同波長的光信號送入到檢測系統(tǒng)中陣列式的檢測器的不同象元，實(shí)現(xiàn)多種污染物的同時檢測。所述激光測量區(qū)中激發(fā)光波長范圍為200-700nm。
[0023]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
[0024]本發(fā)明是利用分子印跡技術(shù)對具有一定粒徑的、特定熒光染色的微球表面進(jìn)行修飾，形成帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球，該微球?qū)λ写郎y物具有專一性識別能力；
[0025]加入微球的待測水樣，在基于流式細(xì)胞技術(shù)原理的儀器中，形成單微球液柱通過激光測量區(qū)，測量區(qū)的微球被激光照射后，產(chǎn)生待測物的正向、側(cè)向散射光和微球突光標(biāo)記物的激發(fā)熒光，通過濾光片組的過濾后被光電倍增管或光電二極管接收并轉(zhuǎn)化為電信號，通過對微球的染色熒光和微球表面待測物熒光或紫外光的測定對待測物進(jìn)行定性定量，可實(shí)現(xiàn)多種污染物同時快速定性定量檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測方法所采用的儀器裝置示意圖。
[0027]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的MIPs熒光微球掃描電鏡照片。
[0028]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的MIPs熒光標(biāo)記微球熒光顯微鏡照片，
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)水質(zhì)中農(nóng)藥阿特拉津、毒死蜱、汞離子和有機(jī)汞等有機(jī)污染的同時測定。
[0030]上述檢測所用的儀器裝置為利用流式細(xì)胞儀原理設(shè)計制造的儀器，儀器的波長范圍200-700nm，分別設(shè)計由流動室和液流系統(tǒng)、激光源和光學(xué)系統(tǒng)、光電管和檢測系統(tǒng)、計算機(jī)和分析系統(tǒng)四部分組成(參見圖1)。
[0031]流動室由石英玻璃鋼制成，中央開有長方形孔，供微球單個流過，激光檢測區(qū)在流動室中心，具有良好的光學(xué)特性，微球熒光信號光通量大，輔以廣角收集透鏡，能夠提高檢測靈敏度和測量精度；液流的驅(qū)動利用真空泵產(chǎn)生壓縮空氣，采用正壓的方法驅(qū)動單微球液流。
[0032]進(jìn)一步，通過對現(xiàn)有的流式細(xì)胞儀光學(xué)系統(tǒng)的激發(fā)光源、透鏡、濾光片、小孔等改造，增加200nm-300nm波長的激光束，實(shí)現(xiàn)儀器裝置的波長范圍:200_700nm，可將不同波長的光信號送入到陣列探測器的不同象元，實(shí)現(xiàn)多種污染物的同時檢測。
[0033]再進(jìn)一步，檢測系統(tǒng):由多通道高信噪比的弱信號放大系統(tǒng)、信號采集與處理系統(tǒng)組成，結(jié)合陣列探測器，對分子印跡熒光標(biāo)記微球通過檢測區(qū)產(chǎn)生的散射光信號和熒光信號進(jìn)行采集。測試過程中微球的標(biāo)記熒光與待測物的散射光互不干擾。
[0034]再進(jìn)一步，分析系統(tǒng):主要用于信號的統(tǒng)計分析與數(shù)據(jù)處理。
[0035]具體為:
[0036]將鍵合有待測物(如阿特拉津)分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球加入待測水樣中放置10-20分鐘，微球充分的吸附待測目標(biāo)物，吸附后微球分散于緩沖溶液中使微球濃度為
0.5-2.5mg/mL,而后利用高純水載液將分散的微球緩沖液加載入流式細(xì)胞儀流動室內(nèi)，使微球形成單微球液柱于流動室內(nèi)流通至激光測量區(qū)，并設(shè)置激發(fā)光波長為熒光素的波長(488nm)和待測目標(biāo)物的紫外吸收或熒光激發(fā)波長200_350nm，測量區(qū)的微球被激光照射后，產(chǎn)生待測物的正向、側(cè)向散射光和微球熒光標(biāo)記物的激發(fā)熒光(FL1，F(xiàn)L2和FL3信號)，激發(fā)熒光透過濾光片轉(zhuǎn)化為電信號，通過對微球的染色熒光和微球表面待測物熒光或紫外光轉(zhuǎn)化的電信號測定待測物進(jìn)行定性定量。
[0037]定性方法:由FL1、FL2、FL3的光信號波長特性及在特征波長下的微球計數(shù)結(jié)果共同對微球定性。
[0038]定量方法:
[0039]由FL1、FL2、FL3的光信號強(qiáng)度和流式細(xì)胞儀的微球計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果對待測物定量。
[0040]測定結(jié)束。
[0041]所述分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球具體制備為:
[0042]聚苯乙烯微球制備:將50ml乙醇和1.0g分散劑聚乙烯吡咯烷酮加入到IOOml圓底燒瓶中，攪拌成均相體系；0.2g引發(fā)劑偶氮二異丁腈和單體苯乙烯16.0g混合并超聲振蕩溶解，通氮?dú)?0ml/min條件下加入到圓底燒瓶中，保持75°C條件聚合反應(yīng)15h。反應(yīng)后的乳液樣品離心沉降，棄去上清液，用無水乙醇洗滌下層微球，再離心沉降，如此反復(fù)3次，除去未反應(yīng)完全的單體和引發(fā)劑，置于真空干燥箱干燥，除去殘留的溶劑，得到聚苯乙烯微球 12.2g，粒徑 1-5 μ m。
[0043]微球染色:6ml氯仿和異丙醇的混合溶劑,0.03g吐溫-20，0.1g上述所得聚苯乙烯微球，3mg吖啶橙和7mg羅丹明101加入到25ml燒杯中，超聲分散IOmin ;然后將混合液室溫放置5小時以上使所有溶劑都揮發(fā)掉，用甲醇洗滌微球后離心，重復(fù)三次以除去未反應(yīng)的熒光素，保留發(fā)生染色反應(yīng)的熒光素，得到染色聚苯乙烯微球。
[0044]分子印跡鍵合:0.2ml鄰苯二甲酸二丁基酯和0.03g十二燒基磺酸鈉和IOml蒸懼水通過超聲處理制成微乳液，在加入0.15ml聚苯乙烯種球的水分散液(0.21g/ml)在室溫下，以350rpm轉(zhuǎn)速攪拌溶脹15小時。反應(yīng)后，向溶脹的顆粒中加入0.15g偶氮二異庚腈，3ml甲苯，14ml水和IOml的5.8%的聚乙烯醇水溶液,在室溫下，以320r pm轉(zhuǎn)速攪拌溶脹2.5小時；反應(yīng)后向溶脹的顆粒中加入0.2g阿特拉津，0.3g甲基丙烯酸，3ml乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)分散液，14ml水和10ml4.0 %的聚乙烯醇溶液，在室溫下，以500rpm轉(zhuǎn)速攪拌溶脹2小時,溶脹后在60°C下通氮?dú)?0ml/min聚合反應(yīng)28小時,聚合后顆粒加入到200ml的甲醇中，待顆粒沉淀后去除上清液，重復(fù)以上步驟2-4次，最后加入蒸餾水200ml代替甲醇重復(fù)一次，再用四氫呋喃處理代替蒸餾水同樣處理兩次，過濾收集聚合顆粒，將聚合物用研缽磨碎，再用四氫呋喃洗滌2-3次，得到經(jīng)過染色的分子印跡鍵合的聚苯乙烯微球(參見圖2和3)。上述所得微球可用于水質(zhì)中阿特拉津的含量測定(參見表I)。
[0045]按本發(fā)明的檢測方法，以阿特拉津印跡微球?yàn)槔瑢ζ渌芤哼M(jìn)行了測試分析，結(jié)果如表1:
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:將帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球加入待測水樣中，使其通過流式細(xì)胞儀的流動室，形成單微球的液柱流通至激光測量區(qū)，測量區(qū)的微球被激光照射后，產(chǎn)生待測物的正向、側(cè)向散射光和微球突光標(biāo)記物的激發(fā)熒光，激發(fā)熒光透過濾光片轉(zhuǎn)化為電信號，通過對微球的染色熒光和待測物散射光轉(zhuǎn)化電信號，對待測物進(jìn)行定性定量的測定。
2.按權(quán)利要求1所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:所述帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球的制備為: 1)均相體系制備1-1Oym聚苯乙烯微球； 2)聚苯乙烯微球熒光染色； 3)將染色聚苯乙烯微球于微乳液中溶脹，而后于溶脹體系中加入待測物模板分子、功能單體、引發(fā)劑和分散液在微球表面進(jìn)行聚合，形成帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球。
3.按權(quán)利要求2所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:所述步驟I)均相體系制備1-10 μ m聚苯乙烯微球:無水乙醇與分散劑混合形成均相體系,而后在均相體系中加入引發(fā)劑和單體苯乙烯在40-80°C溫度的條件聚合反應(yīng)10-15小時；得1-1Oym聚苯乙烯微球；所述按重量份數(shù)計反應(yīng)體系中，每100份苯乙烯單體，加入200-700份無水乙醇，5-15份分散劑和1-3份引發(fā)劑。
4.按權(quán)利要求3所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:所述分散劑為聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇；引發(fā)劑為偶氮類引發(fā)劑或過氧化引發(fā)劑。
5.按權(quán)利要求3所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:所述偶氮類引發(fā)劑偶氮二異丁腈或偶氮二異庚腈，過氧化引發(fā)劑為過氧化苯甲酰。
6.按權(quán)利要求2所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:所述步驟2)聚苯乙烯微球表面熒光染色，將所得聚苯乙烯微球與有機(jī)溶劑混合溶劑、吐溫20和染色劑混合超聲分散10min-20min，分散后室溫下靜止放置使有機(jī)混合溶劑揮發(fā)，揮發(fā)后采用小分子量的醇類溶劑洗滌微球后離心，棄去上清液，得到染色聚苯乙烯微球。
7.按權(quán)利要求6所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:所述有機(jī)混合溶劑為氯仿和異丙醇；染色劑為羅丹明101和吖啶橙；小分子量的醇類為甲醇、乙醇或丙醇。
8.按權(quán)利要求6或7所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:按重量份數(shù)計，1份聚苯乙烯微球添加30-60份有機(jī)混合溶劑、0.3-1份吐溫20和0.01-1份染色劑；其中有機(jī)混合溶劑為氯仿和異丙醇，二者的混合按重量份數(shù)計比例為99:1-50:50 ;染色劑為羅丹明101和吖啶橙，二者的混合按重量份數(shù)計比例為0:100-100:0。
9.按權(quán)利要求3所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:將鄰苯二甲酸酯和十二烷基磺酸鈉以及蒸餾水通過超聲處理制成微乳液，將微乳液和上述染色聚苯乙烯微球分散液混合，于室溫下440-900rpm轉(zhuǎn)速攪拌溶脹10-17小時，再加入偶氮二異庚腈、甲苯、水和聚乙烯醇水溶液并在室溫下，以440-900rpm轉(zhuǎn)速攪拌溶脹反應(yīng)1_4小時；最后向溶脹體系中加入模板分子、功能單體、分散液水和聚乙烯醇水溶液在室溫下，以440-900rpm轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)1-4小時，在40-70°C下，向體系通氮?dú)庥谖⑶虮砻孢M(jìn)行聚合聚合反應(yīng)18-30小時，形成分子印跡鍵合染色的聚苯乙烯微球。
10.按權(quán)利要求9所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:所述微乳液按重量份數(shù)計，由1份染色的聚苯乙烯微球分散水液、1-3份鄰苯二甲酸二丁基酯、0.1-0.17份十二烷基磺酸鈉和50-70份蒸餾水混合制成，其中染色的聚苯乙烯微球分散水液濃度0.1-0.4g/ml ； 偶氮二異庚腈、甲苯、水和聚乙烯醇水溶液按重量份數(shù)計，0.1-0.4份偶氮二異庚腈、2-5份甲苯、10份聚乙烯醇水溶液和10-20份水混合；向溶脹體系中加入模板分子、功能單體和分散液。按重量份數(shù)計，具體為0.1-0.4份模板分子、0.15-0.4份功能單體、2-4份分散液、10-15份去離子水和10質(zhì)量份聚乙烯醇水溶液。
11.按權(quán)利要求10所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:所述分散液為乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，功能單體為甲基丙烯酸；模板分子為測定的目標(biāo)化合物。
12.按權(quán)利要求1所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:將帶有待測物分子印跡孔穴的熒光標(biāo)記微球加入待測水樣中放置10-20分鐘使微球充分的吸附待測目標(biāo)物，吸附后微球分散于緩沖溶液中使微球濃度為0.5-2.5mg/mL，而后利用高純水載液將分散有微球的緩沖液加載入流式細(xì)胞儀流通室內(nèi)，使微球的液柱于流動室內(nèi)流通至激光測量區(qū)，測量區(qū)的微球被激光照射后，產(chǎn)生待測物的正向、側(cè)向散射光和微球熒光標(biāo)記物的激發(fā)熒光，激發(fā)熒光透過濾光片轉(zhuǎn)化為電信號，通過對微球的染色熒光和微球表面待測物熒光和紫外光轉(zhuǎn)化的電信號測定待測物進(jìn)行定性定量。
13.按權(quán)利要求12所述的高通量的環(huán)境污染物檢測方法，其特征在于:所述激光測量區(qū)中激發(fā)光波長范圍為200-700nm。
【文檔編號】G01N21/64GK103575709SQ201210261853
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月26日
【發(fā)明者】王顏紅, 張紅, 王世成 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所