專利名稱：用樹狀細胞一腫瘤細胞或樹狀細胞一病毒細胞衍生的免疫原在體外誘導抗原特異性t ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體涉及抗原特異性T-細胞及其制備和使用方法。更特別地，本發(fā)明涉及抗原特異性T-細胞，這些抗原特異性T-細胞是通過與免疫原共培養(yǎng)而產生的，免疫原是從含有樹狀細胞和腫瘤細胞的雜交瘤或樹狀細胞和腫瘤細胞的共培養(yǎng)產物的制劑產生的?；蛘?，在這些雜交瘤和共培養(yǎng)物中，可以用病毒感染的細胞代替腫瘤細胞。用這些T-細胞作為對抗腫瘤和病毒感染的預防藥物和治療劑也是本發(fā)明的主題。
背景技術：
T-細胞，包括細胞毒性T-淋巴細胞(CTLs)，是人類對腫瘤和病毒感染產生有效的免疫應答的決定性的成分。T-細胞應答足以對抗腫瘤和病毒并能夠消除甚至在鼠腫瘤模型和人體已建立的惡性腫瘤。T-細胞通過識別在效應靶細胞表面的MHC I類分子上呈遞的抗原性肽，而破壞增生的細胞或病毒感染的細胞。這些抗原性肽是出現(xiàn)在效應細胞的胞質中的外來蛋白質的降解產物，其通過內源性MHC I類加工途徑而被加工并呈遞給T-細胞。CTLs通過識別由自身MHC I類分子和肽抗原構成的配體而靶向腫瘤。因此，依賴于CTL的抗腫瘤免疫方法的發(fā)展，一般取決于由CTLs進行的腫瘤抗原識別和有效的抗原傳遞方法的發(fā)展。
雖然CTLs對MHC I類分子范圍內的外源性的蛋白質的識別可能足以識別和破壞CTL效應靶細胞，從T-淋巴細胞前體誘導抗原-特異的CTLs需要另外的信號。專門的抗原-呈遞細胞(APCs)能提供在CTL介導免疫的誘導過程中所需的抗原MHC I類配體和輔助信號。APCs常規(guī)的性質包括MHC I類和II類表達，對APC-淋巴細胞相互作用具有重要性的各種粘附分子的表達，及共刺激分子如CD80和CD86的表達。APCs包括，例如，巨噬細胞，B-細胞，和樹狀細胞，樹狀細胞包括皮膚表皮朗格罕氏細胞，真皮樹狀細胞，和位于淋巴結和脾的樹狀細胞。認為樹狀細胞(DC)是最有效的APCs，并能誘導有效的CTL-依賴型抗腫瘤免疫。已經(jīng)有從骨髓或外周血衍生前體得到有效數(shù)量的樹狀細胞的方法。
可能腫瘤細胞表達一套可以被CTL識別的腫瘤-特異的肽MHC配合物。然而，進行性的腫瘤一般不具有致免疫性，至少部分不是致免疫的，因為它們不能提供共刺激。
Guo等，在Science 263518-520(1994)，公開了通過使肝細胞癌細胞與活化的B-細胞融合而產生的腫瘤疫苗?；罨腂-細胞和腫瘤細胞的融合產生能導致腫瘤-特異的保護性的腫瘤免疫力的免疫原。
Mayordomo等，在Nature Med.1(12)1297-1302(1995)，公開了肽脈沖刺激的(peptide-pulsed)樹狀細胞的體外培養(yǎng)物，它顯示對抗伴隨的腫瘤攻擊的保護作用。在GM-CSF+IL-4存在培養(yǎng)并用雞卵清蛋白(OVA)轉染的樹狀細胞能防止OVA+腫瘤的確立，但對未經(jīng)轉染的母體(parental)黑素瘤沒有這種作用。
Flamand等，在《歐洲免疫學雜志》24605-610(1994)，公開了用肽抗原BCL1脈沖刺激的樹狀細胞的體外培養(yǎng)，并隨后引入針對B-細胞腫瘤BCL1的T-細胞依賴型體液應答。Celluzzi等，在J.Exp.Med.，183203-287(1996)報道了一種相似的方法。其中，以MHC I-肽抗原對樹狀細胞進行脈沖刺激；已被免疫的宿主對抗原基因轉染的腫瘤產生的致命的攻擊顯示出保護性的免疫力。
Hsu等，在Nature Med.252-58(1996)調查了用腫瘤-特異的獨特型蛋白質脈沖刺激的樹狀細胞作為疫苗的應用。
Celluzzi和Falo在J.Immunol.3081-3085頁(1998)公開了含有融合到腫瘤細胞中或與腫瘤細胞共培養(yǎng)的樹狀細胞的制劑。
Gong等，在Nature Med.3558(1997)公開了樹狀細胞與MC38癌細胞的融合。
美國專利5,788,963公開了用于前列腺癌免疫治療的樹狀細胞的制劑；報告了樹狀細胞對抗原特異性T-細胞的刺激。該專利僅限于公開樹狀細胞暴露于特定的、確定的前列腺癌抗原之中，或暴露于作為這些抗原的潛在來源的裂解物或分級的裂解物(fractionated lysates)中。此專利方法未顯示包括樹狀細胞與全部腫瘤細胞或與病毒感染細胞的融合或共培養(yǎng)物，或不確定的抗原的應用。
美國專利5,846,827報告了用肽荷載抗原呈遞細胞活化CTL的方法。這些方法似乎依賴通過暴露于特定的已確定和分離的表位中而完成的抗原呈遞細胞的體內修飾。對于抗原特異性T-細胞或下述制備這些T-細胞的方法沒有任何教導。
上述文章或專利中沒有一篇教導或提示如本發(fā)明公開的獨特的抗原特異性T-細胞的生成。另外，沒有一篇文獻提供了本發(fā)明的顯著的進步，即無需分離和/或識別特異的抗原。
需要提供針對多種腫瘤類型的保護性和治療性免疫的癌免疫治療。也存在針對多種病毒感染的病毒免疫治療相似的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供抗原特異性T-細胞和及其制備和使用方法而滿足上述的需求。一般地，通過將T-細胞與含有樹狀細胞和腫瘤細胞或病毒感染細胞的制劑共培養(yǎng)而制備T-細胞。本發(fā)明的一個實施方案使用一種含有一或多種雜交瘤的制劑；每個雜交瘤還含有至少一個融合于至少一個腫瘤細胞或病毒感染細胞的樹狀細胞。本發(fā)明的另一個實施方案使用含有樹狀細胞與腫瘤細胞或病毒感染細胞共培養(yǎng)產物的制劑。這些制劑產生對制劑中所用種類的腫瘤或病毒具有特異性的免疫原。每種制劑與T-細胞共培養(yǎng)都產生抗原特異性T-細胞；產生的T-細胞將識別并攻擊表達特定的曾與T-細胞共培養(yǎng)的抗原的細胞。在腫瘤免疫治療的情況下，產生的T-細胞抵抗腫瘤的攻擊并使腫瘤生長產生退化。因此，本發(fā)明的T-細胞預防性地對抗制劑中所用腫瘤細胞代表的腫瘤，也能治療患有此腫瘤的病人。相似地，在病毒免疫治療中，產生的T-細胞抵抗此制劑中所用的病毒感染細胞引起的病毒感染，和/或治療遭受這些病毒感染的病人。
腫瘤細胞和病毒感染細胞表達可以被T-細胞作為目標的抗原，但腫瘤細胞和病毒感染細胞自身不刺激T-細胞免疫。這大概是由于腫瘤細胞和病毒細胞不能提供在共刺激過程的適當環(huán)節(jié)中的一或多種抗原。抗原呈遞細胞(APC)，其中認為樹狀細胞(DC)是最有效的，表達各種共刺激分子和細胞因子。本發(fā)明使用一種制劑，其中DC融合于腫瘤細胞或病毒感染細胞中，或DC與腫瘤細胞或病毒感染細胞在一共培養(yǎng)物中。DC與腫瘤細胞或病毒感染細胞融合或共培養(yǎng)使抗原由于與DC聯(lián)合而更具有致免疫性，這些是＂專門的＂抗原呈遞細胞。融合產物和共培養(yǎng)產物同時表達DC和腫瘤或病毒的性質。然后將融合細胞和/或共培養(yǎng)細胞與未激活的T-細胞共培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)過程中，T-細胞暴露于從腫瘤細胞或病毒感染細胞得到的完整系列抗原。產生的T-細胞是抗原-特異的，并將破壞表達相同或相似腫瘤抗原的腫瘤細胞，或破壞表達相同或相似病毒抗原的病毒感染細胞。
因此本領域的技術人員將能認識到，本發(fā)明將通過提供產生或處理的T-細胞以識別與其共培養(yǎng)的抗原，而無需識別引發(fā)T-細胞應答的特異抗原。通過釋放和共培養(yǎng)由腫瘤細胞或病毒感染細胞與T-細胞產生的完整系列抗原，為用途廣泛的多價的免疫治療提供了一種機理。
因此本發(fā)明的一個目的是提供抗原特異性的T-細胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供由抗原特異性T-細胞構成的藥物組合物。
本發(fā)明還有一個目的是提供用抗原特異性T-細胞治療病人的方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供預防和/或治療腫瘤和病毒感染的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供抗原特異性T-細胞，它可以用于識別腫瘤或病毒抗原。
從以下對本發(fā)明的描述可以更全面理解本發(fā)明的這些和其它目的。


圖1說明了流動標記模式，顯示了例3所述的腫瘤細胞組分和樹狀細胞之間關聯(lián)的效力。
圖2顯示了如例4所述的肽荷載細胞的特異裂解的百分比。
圖3顯示了如例5所述的腫瘤細胞的裂解的百分比。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及產生腫瘤抗原特異性T-細胞的方法，通過將病人的—優(yōu)選從同一個病人得到的樹狀細胞與腫瘤細胞在體外合并；將病人的T-細胞加入DC和腫瘤細胞的合并物中；培養(yǎng)T-細胞/DC/腫瘤細胞的混合物；從共培養(yǎng)物中收獲T-細胞。本發(fā)明進一步涉及使用病毒感染細胞而非腫瘤細胞的相似的方法，它將產生病毒抗原特異性T-細胞。按這些方法之一制備的T-細胞也在本發(fā)明的范圍中。根據(jù)本發(fā)明制備的T細胞，在為有患腫瘤的危險或受到病毒感染的危險的病人或已患有腫瘤或已受到病毒感染的病人提供預防或治療性的方法方面是有效的。
本方法的第一步包括將病人的樹狀細胞與腫瘤細胞或病毒感染細胞合并。優(yōu)選地，腫瘤細胞或病毒感染細胞來源于同一病人?？梢园幢绢I域已知的任何方式使細胞合并。在本方法中優(yōu)選的是DC與病患細胞的融合及DC與病患細胞的共培養(yǎng)。術語“病患細胞”在此處一般指腫瘤細胞或病毒感染細胞；根據(jù)將產生的T-細胞的具體類型和所需免疫治療的類型而使用不同的病患細胞。
在一個實施方案中，將DC和病患細胞融合形成雜交瘤。本領域的技術人員將認識到，雜交瘤是至少兩種不同的細胞的物理結合。至少兩種不同的雜交瘤屬于本發(fā)明的范圍—即至少一種DC和一種腫瘤細胞之間的雜交瘤，和在至少一種DC和至少一種病毒感染細胞之間的雜交瘤。
對應于本發(fā)明的一個實施方案，在本發(fā)明方法的第一步驟中，一或多個樹狀細胞與一或多個腫瘤細胞融合形成雜交瘤或融合產物。所用樹狀細胞與腫瘤細胞的初始比例可以是任何值。例如，初始比例可以是1∶10-10∶1及1∶100-100∶1范圍中的任意一點，或更高。在一優(yōu)選實施方案中，用樹狀細胞對腫瘤細胞約為6∶1的初始比例制備了融合產物；發(fā)現(xiàn)此初始比例產生足夠數(shù)量的DC/腫瘤細胞雜交瘤。優(yōu)選地，DC腫瘤細胞的比例包括更高數(shù)量的DC，因為更高數(shù)量的DC會增加腫瘤細胞融合到至少一個DC中的概率。本領域的技術人員將能理解，一或多個DC可以融合到一或多個腫瘤細胞中。因此，本方法第一步制備的雜交瘤可以有一個DC腫瘤細胞的比例的范圍。例如，開始時用DC腫瘤細胞為6∶1的比例，產生的雜交瘤會有1∶1-10∶1或更高的DC腫瘤細胞的比例。
可以使用任何種類的DC?？梢岳斫猓珼C是一類抗原呈遞細胞(＂APC＂)，這是能呈遞抗原的細胞。發(fā)現(xiàn)DC遍及全身，包括皮膚表皮朗格罕氏細胞、真皮樹狀細胞、分布于淋巴結和脾臟的樹狀細胞、前體體外培養(yǎng)得到的樹狀細胞?？梢杂帽绢I域已知的任何方法從宿主得到樹狀細胞。例如可以按Celluzzi等在J.Exp.Med.183283-287(1996)記載的方法從骨髓得到樹狀細胞。也可以從外周血和皮膚得到DC。血衍生DC是本發(fā)明優(yōu)選使用的DC。
可以使用任何種類的腫瘤細胞，包括但不局限于，從病人得到的腫瘤細胞，包括黑素瘤細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、乳腺癌細胞、結腸癌細胞和宮頸癌細胞。優(yōu)選能得到自身腫瘤的單細胞懸浮液的腫瘤細胞。另外，優(yōu)選自體的腫瘤細胞，也可以使用同種異體的腫瘤細胞系作為腫瘤抗原的來源。本領域已知，可以發(fā)現(xiàn)某些腫瘤抗原存在于從多個病人得到的腫瘤細胞中。這些通常稱為＂共有＂腫瘤抗原。在本發(fā)明中，可以使用同種異體的腫瘤細胞作為抗原的來源，因為這些細胞可以含有也存在于病人的腫瘤中的＂共有＂腫瘤抗原。為用于本發(fā)明，可以在加入本制劑之前或之后通過例如輻射或類似的處理方法處理腫瘤細胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，一或多個DC融合到一或多個病毒感染細胞中。對于DC/腫瘤細胞融合，所用DC與病毒感染細胞的初始比例可以是任何值。優(yōu)選地，此比例足以使所有病毒感染細胞融合到一或多個DC中。可以使用任何病毒感染細胞，包括但不局限于，被流感病毒、人免疫缺損病毒(HIV)、巨細胞病毒(CMV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)和單純皰疹病毒(HSV)感染的細胞。
可以用本領域已知的任何方法形成本發(fā)明的雜交瘤或融合產物。在一個優(yōu)選實施方案中，通過將此兩類細胞與聚乙二醇(PEG)一起融合形成DC-腫瘤細胞或DC-病毒感染細胞的雜交瘤。通常，此方法包括將DC和病患細胞加入同一容器中，將細胞的懸浮液離心形成沉淀。將約1ml加熱到約37℃的50％PEG溶液緩慢加到沉淀中。用PBS將沉淀/PEG逐漸稀釋，同時加以緩慢攪拌。然后用離心法洗滌融合的細胞，傾去上清夜，得到融合產物。
也可以通過在體外將DC和病患細胞合并，并將混合物共培養(yǎng)，而不是將兩種細胞類型融合在一起，從而完成本發(fā)明的第一步。此處使用＂共培養(yǎng)＂指將至少兩種不同類型的細胞共同培養(yǎng)，此處是單獨的DC和病患細胞或它們進一步與未受刺激的T-細胞合并。可以將DC與腫瘤或病毒感染細胞簡單地培養(yǎng)而制備DC和腫瘤細胞或病毒感染細胞的共培養(yǎng)物；即，可以將兩種類型的細胞簡單地混合并共同孵育。雖然可以使用本領域已知的任何共培養(yǎng)細胞的方法，在一個優(yōu)選的方法中，將兩種細胞類型合并并離心以形成沉淀。然后將沉淀用培養(yǎng)基稀釋，優(yōu)選RPMI或AIM5，并在約37℃在5％CO2孵化箱中孵育過夜。對于雜交瘤的制劑，可以使用任何DC對病患細胞的比例；優(yōu)選1∶100-100∶1的比例，更優(yōu)選1∶10-10∶1的比例，尤其優(yōu)選約6∶1的比例。本領域的技術人員將會理解共培養(yǎng)產物可以用于本發(fā)明的方法中而不經(jīng)過選擇步驟。
此處使用術語＂共培養(yǎng)產物＂，指病患細胞和DC共培養(yǎng)產生的物質，可以包括，例如，已融合在一起的腫瘤細胞和樹狀細胞，已被內化或已與抗原的腫瘤組分或腫瘤細胞的其他組分結合的樹狀細胞，已經(jīng)內化或與樹狀細胞與抗原-表達功能有關的組分結合的腫瘤細胞，或來源于任何上述細胞的亞細胞組分。因此能被理解的是，這些術語反映在共培養(yǎng)過程中，產生了刺激細胞復合物，它含有腫瘤抗原和抗原呈遞給T-細胞所必需的分子。這些同樣適用于病毒感染細胞的使用。
制備DC和病患細胞的融合產物或共培養(yǎng)物之后，從病人得到的T-細胞應加入到樹狀細胞/病患細胞的合并物中。T-細胞，如同DC(在一個優(yōu)選實施方案中為病患細胞)應來源于同一個病人。因此，DC、病患細胞和T-細胞均優(yōu)選為自體的，并應從最終接受本發(fā)明的方法產生的T-細胞治療的病人獲得。使用自體的細胞會消除對于確定和鑒定對各種腫瘤細胞和病毒感染細胞獨特的特異抗原的需要，不同病人和不同疾病的抗原都是不同的。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的T-細胞能靶向由每個宿主產生的特定的抗原，因為其自身已經(jīng)與這些抗原進行了共培養(yǎng)。另外，如果用同種異體的腫瘤細胞，＂共有＂抗原將出現(xiàn)在共培養(yǎng)物中。
此處使用術語＂T-細胞＂將能夠被本領域的技術人員理解。此術語包括但不局限于能裂解靶細胞或提供效應或輔助功能-如細胞因子分泌-的CD4+或CD8+T-細胞，它可以導致靶細胞死亡，或使對抗靶的效應物活性產生或增強。本發(fā)明不局限于這些例子，而是可以按本發(fā)明使用本領域已知的任何T-細胞。優(yōu)選地，T-細胞是未受刺激的T-細胞前體。
可以從任何適宜的來源得到T-細胞，包括但不局限于脾組織、淋巴結、外周血、腫瘤、腹水液體、皮膚的活組織和CNS液體。可以使用任何從宿主收獲T-細胞的方法。例如，可以使用Ficoll-Paque(商業(yè)上可以從Pharmacia得到)離心的外周血單核細胞(PBMC)?？蛇x地，可以使用免疫親和法分離的純化CD4+或CD8+T-細胞，如通過使用MAC或dyna珠而獲得的T-細胞。例如Tuting等在J.Immunol.16011391147(1998)等文獻中介紹了適宜的獲得T-細胞的方法。
然后應把收獲的T-細胞加入含有樹狀細胞和病患細胞的融合產物或共培養(yǎng)產物的培養(yǎng)基中。雖然任何其它適宜的比例也在本發(fā)明的范圍內，優(yōu)選T-細胞樹狀細胞的比例為10∶1-100∶1。
然后應把T-細胞、樹狀細胞和腫瘤細胞或病毒感染細胞的混合物進行培養(yǎng)?？梢詫⒓毎谂囵B(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天，以7-10天的時間間隔用同樣制備的DC/病患細胞刺激物進行再刺激?？梢杂么朔桨笩o期限地進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基優(yōu)選補充以FC或HABS(0-10％)和白介素-2(5-100IU/ml)的RPMI或AIM-V培養(yǎng)基。最后一次刺激后約5-10天，測定T-細胞的細胞毒性和細胞因子的釋放，或最后一次刺激后3-5天進行基于增殖的測定。
可以用本領域已知的任何方法完成從共培養(yǎng)物中收獲T-細胞。例如，用吸管將培養(yǎng)的細胞從燒瓶或平皿中轉移到離心管中從而簡單地完成收獲過程。離心后，從沉淀回收細胞并用于讀出測定(如，細胞毒性，細胞因子的釋放和增殖測定)。更特別地，可以用以上討論的免疫親和法選擇性地回收CD4+和CD8+T-細胞。一般，2-3輪體外刺激后，僅有T-細胞存在于培養(yǎng)物中?？梢杂萌魏巫兓姆绞绞褂肨-細胞，包括用于治療病人的方法中，作為針對特異的抗原的探針，和用于建立在免疫學領域的研究中有用的動物模型的方法中。
本發(fā)明因此也涉及一種方法，它使對于宿主的免疫治療發(fā)揮作用，它包括將從病人得到的樹狀細胞與病患細胞在體外合并；將從病人得到的未受刺激的T-細胞前體加入樹狀細胞/病患細胞的合并物中；將混合物共培養(yǎng)；從混合物中收獲T-細胞；使哺乳動物宿主服用有效量的獲得的T-細胞。此處使用術語＂宿主＂、＂哺乳動物宿主＂和＂病人＂指提取有關細胞和/或接受本方法治療的有機體，包括但不局限于人。將被理解的是＂免疫治療＂包括對于易患腫瘤的病人的預防性治療，如屬于對某一類癌的高危人群的病人；＂免疫治療＂也包括對已患腫瘤的病人的治療性處理?？梢允褂靡陨嫌涊d的DC和腫瘤細胞。能進一步理解的將根據(jù)正對其進行給藥治療的癌的種類而確定所用腫瘤細胞的種類。例如，如果對病人進行處理使其產生對黑素瘤的預防性的抵抗力，應使用黑素瘤細胞。應使用病人自身的黑素瘤細胞，或含有共有抗原的同種異體的黑素瘤細胞。＂免疫治療＂也包括預防性地治療病毒感染之前的病人，和治療性地處理已受到病毒感染的病人?？梢允褂蒙鲜鋈魏蜠C和病毒感染細胞。再有，所用病毒感染細胞的種類將根據(jù)正對其進行治療的病毒感染而變化。
應給正接受治療的宿主服用按照本方法產生的有效量的T-細胞。此處使用術語＂有效量＂指達到所需的免疫治療的T-細胞的數(shù)量，例如能給病人帶來所需水平的預防性抵抗力或治療性的疾病解除的T-細胞數(shù)量。
如本領域的技術人員能理解的是，每個病人的有效量都是不同的，它根據(jù)這些變化因素而改變，例如，治療性用途還是預防性用途，腫瘤的體積和/或嚴重程度，病毒感染的種類和/或嚴重程度，病人的體重和身高等。即使抗原特異性T-細胞的最小劑量也能為病人提供效力。為每個病人確定有效量屬于本領域的從業(yè)人員的一項技能；每次治療的典型的最大劑量將是約為1011T-細胞?？梢愿鶕?jù)接受治療的病人的情況而使用更高或更低的劑量。也根據(jù)所治療的病人、所治疾病、病人對治療的反應等因素決定治療次數(shù)。再有，決定合適的治療次數(shù)屬于從業(yè)人員的技能。
可以用本領域已知的任何方法將T-細胞引入宿主體內，包括但不局限于使用用T-細胞制備的藥物組合物。例如，可以將T-細胞與適宜的藥物載體結合。只要不出現(xiàn)相容性問題，可以使用任何適宜的藥物載體。優(yōu)選的載體是鹽水、磷酸緩沖鹽水(PBS)和含有T-細胞生長因子的培養(yǎng)基。T-細胞組合物可按照以下途徑給藥，例如，靜脈內、肌內、淋巴內、真皮內、皮下和腫瘤內給藥。
也可以用本發(fā)明的T-細胞鑒別腫瘤或病毒抗原。能被理解的是，當用腫瘤細胞刺激T-細胞時，T-細胞將用于識別腫瘤抗原，當用病毒感染細胞刺激T-細胞時，T-細胞將用于識別病毒抗原。例如，可以用T-細胞作為鑒別試劑以識別特異的腫瘤肽或腫瘤基因產物，如Storkus等，在J.Immunol.1513719-3727(1993)和van der Bruggen等，在Science 2541643-1647(1991)所教導的。可以用從腫瘤細胞提取得到的已分級的肽荷載抗原呈遞細胞(如樹狀細胞或轉化的細胞系)(Storkus等，1993)，然后用按本發(fā)明制備的T-細胞分析反應性(細胞毒性、增殖性、細胞因子釋放，等)。然后用質譜法或Edman降解測序法分析T-細胞識別的肽庫，以確定其中單個肽的序列。然后可以制備與這些序列一致的合成的肽，并測定T-細胞的反應性，明確識別的肽構成了潛在的疫苗組分?；蛘?，可以將腫瘤衍生DNA或cDNA轉染到DC或轉化細胞系中(vander Bruggen，1991)并對產生的轉染物按照被本發(fā)明的方法獲得的T-細胞識別的能力進行篩選。然后可以對從被T-細胞識別的靶提取的轉染DNA測序，所產生的腫瘤-相關基因/基因產物構成了潛在的基因疫苗組分。另外，從基因產物得到的肽也可以作為以肽為基礎的疫苗和療法的組分。
也可以按本方法產生T-細胞，用于制備動物模型。這些模型將是有用的，例如，用于研究各種免疫治療對接受治療的宿主的各種作用。例如，T-細胞可以如Celluzzi和Falo，在J.Immunol.3081-3085(1998)所述引入小鼠體內，用于腫瘤疫苗接種和腫瘤治療?；蛘?，使用本發(fā)明，可以在進入體內之前產生抗原特異性T-細胞，將增殖的細胞轉移到荷瘤小鼠或病人體內，或病毒感染的病人體內。因為能用鼠動物模型評價預防性和治療性體系，它趨向于作為評價各種治療方法的潛在臨床功效的替代系統(tǒng)。
當使用本發(fā)明的T-細胞時，本發(fā)明的免疫治療在已接受免疫的哺乳動物宿主體內導致腫瘤特異的裂解活性。即預防性或治療性的處理對于用于DC-腫瘤細胞雜交瘤或共培養(yǎng)物中的腫瘤種類將是特異的。這些免疫措施保護病人免受腫瘤的攻擊和/或導致已生成的腫瘤的退化。類似地，預防性或治療性處理對于所用病毒的種類將是特異的，將保護病人免受病毒攻擊和/或導致病毒感染的減少。因此，本免疫治療不需要分離和鑒定各種抗原。本發(fā)明因此提供一種快速、價廉而有效的在體外生成抗原特異性T-細胞的技術?？梢酝ㄟ^將患腫瘤或病毒感染的病人的自體的抗原特異性T-細胞進行過繼性移植，使這些T-細胞用于免疫治療。
實施例以下各實施例用于說明本發(fā)明，在任何方面不能認為是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明所用的小鼠是雌性C57BL/6小鼠，5-8周齡，得自于緬因州Bar Harbor的杰克遜試驗室(Jackson Laboratory)。B16是一種得自于ATCC，Rockville，Maryland的C57BL/6黑素瘤(H-2b)，而3LL是一種肺癌，也可以從ATCC得到。將細胞系保存在含有10％FCS和抗生素的DME中。從得自于W.Chambers，匹茲堡醫(yī)科大學(University ofPittsburgh School of Medicine)的雜交瘤GK 1.5(抗-CD4，ATCC T1B207)，2.43(抗-CD8，ATCC TIB 210)，30-H12(抗-Thy 1.2，ATCCT1B107)，B220(抗-B細胞表面葡萄糖蛋白質，ATCC T1B 146)，和NK1.1制備用于排除細胞子集的單克隆抗體。
實施例1-DC和腫瘤細胞的融合按通常記載在Celluzzi等，J.Exp.Med.183283-287(1996)的方法，其中在參考文獻中使用GM-CSF，從骨髓制備樹狀細胞。簡要地說，除去骨髓細胞中的淋巴細胞，在得自于Irvine Scientific，Santa Ana，加利福尼亞的含有RPMI 1640的10％FCS中培養(yǎng)，細胞密度為5×105細胞/ml，使用得自于密蘇里州St.Louis，Sigma化學公司的粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，濃度為103U/ml。在第6天收集松散附著的細胞進行融合。用流式細胞術測得，DC表達的CD86(B7.2)和II類MHC(I-A+)抗原的濃度為50-75％。
第6天以DC與腫瘤細胞為6∶1的比例將DC與B16或3LL細胞融合，使用37℃的聚乙二醇。離心洗滌后，將融合細胞在37℃的RPMI1640(10％FCS)中培養(yǎng)過夜。
實施例2-制備樹狀細胞和腫瘤細胞的共培養(yǎng)物按實施例1的方法制備樹狀細胞。第6天，用樹狀細胞與B16細胞或3LL細胞形成共培養(yǎng)物。將各種DC與腫瘤細胞置于試管中制備各種DC/腫瘤細胞共培養(yǎng)物。離心形成細胞沉淀。然后將細胞沉淀用RPMI(10％FCS)稀釋并在37C的5％CO2孵化箱中孵育過夜。DC腫瘤細胞的比例約為6∶1。制備共培養(yǎng)的產物，以進一步評估腫瘤抗原是否與DC密切關聯(lián)，及評估是否有從腫瘤釋放的可溶因子出現(xiàn)在DC上。
實施例3-融合與共培養(yǎng)的效果為確定融合與共培養(yǎng)的效果，在融合之前用不同的親脂性熒光染料將各種細胞類型-DC、B16和3LL-染色，并用流式細胞術進行分析。腫瘤細胞用DiO染色，DC用DiI染色，它們均得自于俄勒岡Eugene的分子探針公司(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon)。充分洗滌后，將細胞融合或共培養(yǎng)，并在37℃溫育過夜。然后將獲得的細胞在2％低聚甲醛中固定，然后用Argon/HeNe duellaser在Becton DickinsonFacstar Plus上測定前散射和側散射特征，可以由加利福尼亞San Jose的Becton Dickinson Immunocytometry Systems得到。
各種細胞類型的散射特征見圖1。細胞個體的染色顯示兩種不同方式，與未染色的對照品比較(未顯示)，DC(DiI)向上移動(圖1A的左上四分之一)或B16腫瘤細胞(DiO)向右移動(圖1B的右下四分之一)。當細胞共培養(yǎng)(圖1C)或融合時(圖1D)，移動方式是向右和向上，顯示出這些細胞被雙重染色。用右上四分之一指示腫瘤抗原與樹狀細胞聯(lián)合的效果。在左上或右下四分之一發(fā)現(xiàn)的細胞認為是單染色的細胞，不在測量的范圍內。用這些標準評價，細胞聯(lián)合的效果非常高，約占總計數(shù)細胞(gated cell)中共培養(yǎng)細胞群的70％，約占總計數(shù)細胞中融合細胞群的53％。
實施例4-制備抗原特異性T-細胞從人類的HLA-A2+病人切除黑素瘤，將其消化制成單細胞懸浮液，并冷凍保留。在通常由Tüting，等在J.Immunol.，1601139-1147(1998)提出的過程之后，將外周血在含有rhIL-4和rhGmCSF的AIM V培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到樹狀細胞。在第7天，使腫瘤細胞凍融，對其照射(15,000rad)，加入7天DC培養(yǎng)物中。使腫瘤細胞和DC在37℃＂共孵育＂24小時。DC腫瘤細胞的比例約為10∶1。用移液管收集共培養(yǎng)的細胞并在3,000rads照射。每周一次將收獲的細胞加入T-細胞培養(yǎng)物中作為刺激物，比例約為10∶1-100∶l(T-細胞DC)。45天后評價T-細胞裂解被腫瘤肽脈沖刺激的T2細胞(圖2)或作為腫瘤細胞系靶(圖3)的能力。在細胞毒測定中用標準步驟進行了裂解過程。靶細胞是HLA-A2匹配的同種異體的黑素瘤靶細胞(即Mel526)。圖2證明未正常識別的T-細胞系當荷載有來源于黑素瘤細胞表達的蛋白質的肽(如MART-1、gapl00、酪氨酸酶等)時，可以成為能被識別的。圖2說明的結果證明，可以用本發(fā)明的DC-腫瘤刺激物驅動T-細胞的擴張，以識別大批腫瘤關聯(lián)的抗原。同樣的概念適用于對抗病毒相關的抗原的DC-病毒感染細胞刺激物。因此，本發(fā)明的T-細胞有一個廣的反應性范圍；這在臨床中是特別適用的，因為腫瘤細胞或病毒感染細胞基于體內的免疫選擇性壓力，可能會試圖調整其對個體抗原的表達。圖3顯示了評價本發(fā)明的T-細胞裂解HLA-A2匹配的黑素瘤靶細胞(Mel526)的能力時得到的結果。T-細胞有效地殺死靶細胞；與HLA-2分子(BB7.2和W6/32)結合的抗體會阻斷這種殺滅，證明HLA-A2I類對這些擴大的細胞培養(yǎng)物中的T-細胞的限制。T-2細胞系是HLA-A2匹配的靶。各圖顯示的結果因而支持HLA-A2限制CTL對抗完整黑素瘤和HLA-A2呈遞的明確肽表位的活性。
盡管以上為說明的目的介紹了本發(fā)明的特定的實施方案，對本領域的技術人員而言顯而易見的是，本發(fā)明的這些細節(jié)的各種變化將不背離以下權利要求所定義的本發(fā)明的范圍。
權利要求
1.一種產生抗原特異性T-細胞的方法，包括a)將至少一個第一細胞與至少一個第二細胞在體外合并，其中所述的第一細胞是自體的樹狀細胞，所述的第二細胞選自腫瘤細胞和病毒感染細胞；b)向步驟a)的合并物中加入自體的T-細胞；c)培養(yǎng)步驟b)的混合物；并d)從步驟c)的混合物中收獲T-細胞。
2.權利要求1所述的方法，其中所述的樹狀細胞選自皮膚表皮朗格罕氏細胞、真皮樹狀細胞、淋巴結樹狀細胞、脾樹狀細胞、由前體體外培養(yǎng)得到的樹狀細胞和血源樹狀細胞。
3.權利要求1所述的方法，其中所述的第二細胞選自自體的細胞和同種異體的細胞。
4.權利要求1所述的方法，其中所述的腫瘤細胞選自黑素瘤細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、乳腺癌細胞、結腸癌細胞和宮頸癌細胞。
5.權利要求1所述的方法，其中所述的病毒感染細胞選自流感病毒、人免疫缺損病毒、巨細胞病毒、人乳頭狀瘤病毒和單純皰疹病毒感染的細胞。
6.權利要求1所述的方法，將其中所述的第一細胞和第二細胞融合以產生雜交瘤。
7.權利要求6所述的方法，其中所述的雜交瘤含有的第一細胞與第二細胞的比例在約1∶100-100∶1之間。
8.權利要求6所述的方法，其中所述的雜交瘤含有的第一細胞與第二細胞的比例約為6∶1。
9.權利要求1所述的方法，將其中所述的第一細胞和第二細胞共培養(yǎng)。
10.權利要求9所述的方法，其中所述的共培養(yǎng)物含有的第一細胞與第二細胞的比例在約1∶100-100∶1之間。
11.權利要求9所述的方法，其中所述的共培養(yǎng)物含有的第一細胞與第二細胞的比例約為6∶1。
12.權利要求1所述的方法，其中按T-細胞與樹狀細胞比例約為10∶1-100∶1的比例加入所述的T-細胞。
13.權利要求1所述的方法，其中所述的T-細胞是未經(jīng)刺激的T-細胞前體。
14.根據(jù)權利要求1的方法制備的抗原特異性T-細胞。
15.根據(jù)權利要求14所述的T-細胞，其中所述的樹狀細胞選自皮膚表皮朗格罕氏細胞、真皮樹狀細胞、淋巴結樹狀細胞、脾樹狀細胞、由前體的體外培養(yǎng)得到的樹狀細胞和血源樹狀細胞。
16.權利要求14所述的T-細胞，其中所述的第二細胞選自自體的細胞和同種異體的細胞。
17.權利要求14所述的T-細胞，其中的腫瘤細胞選自黑素瘤癌細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、乳腺癌細胞、結腸癌細胞和宮頸癌細胞。
18.權利要求14所述的T-細胞，其中的病毒感染細胞選自流感病毒、人免疫缺損病毒、巨細胞病毒、人乳頭狀瘤病毒和單純皰疹病毒感染的細胞。
19.權利要求15所述的T-細胞，其中的樹狀細胞是血源樹狀細胞，所述的腫瘤細胞是從它可以得到其自身腫瘤的單細胞懸浮液的一種細胞。
20.一種在宿主體內進行免疫治療的方法，包括給宿主服用有效量的權利要求14所述的T-細胞。
21.權利要求20所述的方法，其中所述的第二細胞是腫瘤細胞，其中所述的給藥導致在所述宿主體內產生對抗腫瘤細胞的免疫治療。
22.權利要求20所述的方法，其中所述的第二細胞是病毒感染的細胞，其中所述的給藥在所述宿主體內產生對抗病毒感染細胞的免疫治療。
23.權利要求20所述的方法，其中所述的樹狀細胞選自皮膚表皮朗格罕氏細胞、真皮樹狀細胞、淋巴結樹狀細胞、脾樹狀細胞、由前體的體外培養(yǎng)得到的樹狀細胞和血源樹狀細胞。
24.權利要求20所述的方法，其中所述的腫瘤細胞選自黑素瘤細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、乳腺癌細胞、結腸癌細胞和宮頸癌細胞。
25.權利要求22所述的方法，其中所述的病毒感染細胞選自流感病毒、人免疫缺損病毒、巨細胞病毒、人乳頭狀瘤病毒和單純皰疹病毒感染的細胞。
26.權利要求20所述的方法，其中所述的T-細胞存在于一種適當?shù)乃幬镙d體中。
27.權利要求20所述的方法，其中所述的有效量是1011細胞或更少。
28.一種鑒別抗原的方法，包括a)用從腫瘤細胞提取得到的肽荷載抗原呈遞細胞；b)用權利要求14所述的T-細胞分析抗原呈遞細胞的反應性；并c)鑒別被所述的T-細胞識別的肽。
29.權利要求28所述的方法，其中還包括d)對步驟c)中單個的肽測序。
30.權利要求29所述的方法，其中還包括e)按步驟d)的序列制備合成的肽。
31.權利要求30所述的方法，其中還包括f)制備含有步驟e)的合成肽的制劑。
32.一種鑒別抗原的方法，包括a)用源于腫瘤的DNA或源于腫瘤的cDNA轉染細胞；b)對步驟a)的轉染細胞按其被權利要求14所述的T-細胞識別的能力進行篩選；并c)從步驟b)所述的被識別的細胞中提取轉染的DNA或cDNA。
33.權利要求32所述的方法，其中還包括d)對步驟c)的提取的DNA測序。
34.權利要求33所述的方法，其中還包括e)按步驟d)的序列制備合成的肽。
35.權利要求34所述的方法，其中還包括f)制備含有步驟e)的合成肽的制劑。
36.產生用于研究免疫治療的動物模型的方法，包括將一或多種權利要求14所述的T-細胞轉移到荷載腫瘤的宿主體內。
全文摘要
本發(fā)明公開了用含有DC和腫瘤細胞或病毒感染細胞的組合的制劑培養(yǎng)的抗原特異性T－細胞。這些制劑通常含有至少一種樹狀細胞融合在至少一種腫瘤細胞或至少一種病毒感染細胞中形成的雜交瘤,或樹狀細胞和腫瘤細胞或病毒感染細胞的共培養(yǎng)物。通過已建立的技術將自體的抗原特異性T－細胞轉移到病人體內而使產生的T－細胞可以用于免疫治療,作為識別腫瘤抗原的藥劑,并建立動物模型。
文檔編號C12N5/16GK1353575SQ00808298
公開日2002年6月12日 申請日期2000年3月30日 優(yōu)先權日1999年3月31日
發(fā)明者小L·D·法羅, W·斯托爾庫斯 申請人:匹茲堡大學聯(lián)邦制高等教育