專利名稱：一種將抗原轉(zhuǎn)移到樹突狀細(xì)胞的方法
發(fā)明公開本發(fā)明涉及一種將抗原轉(zhuǎn)移到樹突狀細(xì)胞的方法，包括樹突狀細(xì)胞與轉(zhuǎn)染或表達(dá)有關(guān)抗原的細(xì)胞共培養(yǎng)。
樹突狀細(xì)胞(DC)是免疫系統(tǒng)的中心角色。它們?cè)赥細(xì)胞發(fā)育過程中提呈自身抗原，并提呈外來抗原，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。DC定位于絕大多數(shù)組織，捕獲并加工抗原，并且在它們表面高效展示MHC-肽復(fù)合物。而且，它們能夠上調(diào)共刺激分子并遷移到淋巴器官，在那里它們激活抗原特異性T細(xì)胞。
人DC具有許多獨(dú)特特性。通過它們典型的形態(tài)學(xué)、高膜密度的HLAII類分子和共刺激分子以及通過表達(dá)獨(dú)特模式的細(xì)胞表面分子等可以鑒定它們。功能上，DC具有內(nèi)吞能力和在HLA II類分子區(qū)室內(nèi)濃縮可溶性蛋白的能力。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中它們是異源T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)烈刺激物，并具有致敏臍帶血原初T細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì)。
人DC能夠在體外從粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子α(TNFα)刺激的CD34+細(xì)胞產(chǎn)生。DC的另一來源為GM-CSF和白介素4(IL-4)存在時(shí)培養(yǎng)的外周血單個(gè)核細(xì)胞中的單核細(xì)胞(PBMC)級(jí)分。
在過去幾年里，DC在多種小鼠腫瘤系統(tǒng)中誘導(dǎo)有效和長(zhǎng)期持續(xù)的抗腫瘤免疫(通過保護(hù)動(dòng)物免受致死性腫瘤攻擊)的作用受到很大關(guān)注。例如，通過用I類分子限制的合成肽或從腫瘤洗脫的未分級(jí)分離的肽脈沖(pulse)DC獲得了上述結(jié)果。這些動(dòng)物模型與治療人類癌癥的相關(guān)性近來已為臨床研究所證實(shí)，在該研究中使用脈沖的DC誘導(dǎo)已建立的人淋巴瘤消退(Hsu等，自然醫(yī)學(xué)(Nature Med.)2，52-58，1996)。
在體外或體內(nèi)獲得腫瘤特異性DC的努力中，提出了幾種不同的方法，包括用病毒載體或通過脂質(zhì)體方法用核酸(質(zhì)粒DNA、mRNA)轉(zhuǎn)移基因，或用純化的腫瘤抗原、腫瘤裂解物或由其純化的肽或化學(xué)合成肽脈沖樹突狀細(xì)胞。被構(gòu)建成組成型表達(dá)特定抗原的基因工程DC在穩(wěn)定表達(dá)靶基因產(chǎn)物方面比抗原脈沖的DC具有更重要優(yōu)勢(shì)。這能夠克服在離體分離、處理和體內(nèi)施用等不同時(shí)期HLA I類-肽復(fù)合物快速胞內(nèi)降解的潛在局限性。一個(gè)額外的優(yōu)勢(shì)為轉(zhuǎn)導(dǎo)整個(gè)腫瘤抗原基因的可能性，從而可以提呈未知表位。
然而，DC的直接轉(zhuǎn)導(dǎo)有幾個(gè)難題例如與CD34+骨髓來源的樹突狀細(xì)胞相反，來自循環(huán)單核細(xì)胞的DC不能被逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染。另一方面，在免疫受損患者中，不建議動(dòng)員CD34+前體細(xì)胞?？傊?，DC轉(zhuǎn)染總是效率很低。
而且，在來自單核細(xì)胞的DC中使用腺病毒載體轉(zhuǎn)移腫瘤抗原主要引起針對(duì)載體病毒成分的免疫，使隨后載體使用效率降低。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)一種特別有效的將抗原轉(zhuǎn)移到DC的方法，不需要轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)DC本身。
本發(fā)明的方法包括DC和“供體”細(xì)胞的共培養(yǎng)，其中供體細(xì)胞在細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)重組或天然來源的目標(biāo)抗原。通過根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或通過用根據(jù)本發(fā)明的病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)在其中獲得抗原表達(dá)的“供體”細(xì)胞實(shí)例，包括但不限于腫瘤和非腫瘤哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)物或連續(xù)細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞或能夠被有效轉(zhuǎn)染的普通細(xì)胞，例如HeLa、COS、NIH3T3、CHO或HEK-293細(xì)胞(ATCCNo.CRL 1573)，D細(xì)胞或單核細(xì)胞培養(yǎng)物。特別優(yōu)選的是NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法基于所使用的合適質(zhì)粒表達(dá)載體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒，它們含有用于高效表達(dá)的病毒或細(xì)胞組成型啟動(dòng)子(如CMV、SV40、HSV TK等)控制的目標(biāo)基因。所述載體也可以含有一個(gè)用于篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因(新霉素、erbamycin、TK等)。
轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)“供體”細(xì)胞的方法是常規(guī)的，包括例如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、DNA的磷酸鈣沉淀或使用DEAE葡聚糖、感染或例如Sambrook等(eds)(1989)在《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(冷泉港出版社，Plainview，紐約)中描述的其它常規(guī)方法。
本發(fā)明中的方法可將完整的細(xì)胞質(zhì)和表面抗原轉(zhuǎn)入DC，該抗原或是重組的，如Mavilio等人(1994，血液(Blood)831988-1997)所描述的那些用于標(biāo)記和選擇轉(zhuǎn)染的ΔLNGFr細(xì)胞的抗原，或是天然的，如組織相容性抗原、或獲自腫瘤活檢的細(xì)胞表達(dá)的腫瘤抗原。
也能夠以重組形式在供體細(xì)胞中表達(dá)的抗原實(shí)例包括但不限于“腫瘤抗原”或腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)的抗原，如MAGE(黑色素瘤相關(guān)抗原)或BAGE家族成員、Melan-A、gp100、Mart-1、PSA(前列腺特異抗原)、MUC-1，或胚胎抗原如AFP(甲胎蛋白)或CEA(癌胚抗原)，或癌基因如HER2/neu，或來自“正常”基因突變的癌基因如p53、c-ras，或淋巴瘤中高產(chǎn)免疫球蛋白V區(qū)的獨(dú)特型，或者作為腫瘤病原因子的病毒所編碼的抗原如EBV(Epstein-Barr病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)、HPV(人乳頭瘤病毒)，或病毒抗原如HIV gp160、HbsAg等。通?？捎媚壳耙阎乃心[瘤和非腫瘤抗原進(jìn)行轉(zhuǎn)染，特別是組織相容性抗原，黑色素瘤、癌和肉瘤細(xì)胞的抗原，或來自淋巴瘤、上皮腫瘤等的抗原。
表達(dá)天然抗原的“供體”細(xì)胞是例如來自患者活檢的腫瘤細(xì)胞、或表達(dá)異源性組織相容性抗原的細(xì)胞，對(duì)其必須誘導(dǎo)免疫耐受，例如器官或骨髓移植受體的那些細(xì)胞，或用于誘導(dǎo)宿主耐受的被移植器官(肝、肺、胰腺、心臟)的細(xì)胞。組織相容性抗原轉(zhuǎn)移到DC細(xì)胞表面，然后它們與DC本身編碼的那些共表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明得到的樹突狀細(xì)胞其上負(fù)載了異源性組織相容性抗原且任選地用適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子處理，能夠用于調(diào)節(jié)GVHD(移植物抗宿主疾病)，或控制被移植器官的移植物排斥，或控制自身免疫反應(yīng)。
如果細(xì)胞轉(zhuǎn)染了細(xì)胞內(nèi)抗原，通過前凋亡(pro-apoptotic)因子處理轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)抗原轉(zhuǎn)移到DC，所述前凋亡因子處理如輻照(UV、X光)、或細(xì)胞因子(如TNF-α)、或分子(如放線菌素-D)處理，或使它們與FasL或能夠激活前凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抗體(抗Fas、FasL抗體等)相互作用。在這種情況下，由于DC細(xì)胞具有巨噬凋亡小體的能力，細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤抗原能夠被它們攝取。然后巨噬的抗原物質(zhì)被DC細(xì)胞內(nèi)加工處理并以HLA-I和/或II類肽復(fù)合物的形式展示在細(xì)胞表面。如果是表面抗原，不必誘導(dǎo)凋亡就可將完整分子從受體細(xì)胞有效轉(zhuǎn)移到DC。在這種情況下，DC與供體細(xì)胞之間的接觸足矣。根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的DC能夠用于過繼免疫治療方案，即用于效應(yīng)細(xì)胞的離體擴(kuò)增，使用處理過的DC作為提呈抗原的細(xì)胞，或用于主動(dòng)免疫治療策略，將處理過的DC回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。
樹突狀細(xì)胞的施用方法在WO93/20185和EP-A-0 563 485中已經(jīng)公開。
根據(jù)本發(fā)明處理的樹突狀細(xì)胞還可用于鑒定和使用(例如在腫瘤治療中)樹突狀細(xì)胞加工完全抗原直接產(chǎn)生的新穎表位。通過編碼完全抗原的cDNA或來自“文庫”(例如腫瘤細(xì)胞文庫)的cDNA轉(zhuǎn)染，抗原可在供體細(xì)胞中表達(dá)，因此通過本發(fā)明的方法可將抗原轉(zhuǎn)移到DC，并通過DC的亞細(xì)胞區(qū)室進(jìn)行天然加工。
因此根據(jù)本發(fā)明可獲得的樹突狀細(xì)胞能夠用于活化HLA-I或II類限制的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
DC與轉(zhuǎn)染了或在其表面表達(dá)抗原的細(xì)胞的共培養(yǎng)條件是常規(guī)的。典型地，共培養(yǎng)維持12-48小時(shí)，優(yōu)選地大約24小時(shí)，可選擇地存在1，5-二甲基-1，5-二氮十一甲基聚甲溴化物或促進(jìn)細(xì)胞融合的其它試劑。根據(jù)本發(fā)明用負(fù)載了抗原的DC刺激淋巴細(xì)胞的方法也是常規(guī)的。例如，來自腫瘤患者的淋巴細(xì)胞與輻照處理的DC在含有10％人血清的IMDM培養(yǎng)基(Iscove’s Modified Dulbecco Medium)中共培養(yǎng)。初次刺激幾天后，培養(yǎng)基中加入濃度為10U/ml的白介素-2。
在下面的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)地描述。實(shí)施例1將免疫原性融合蛋白TN(單純皰疹胸腺嘧啶激酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)以及ΔLNGFr表面標(biāo)記轉(zhuǎn)移到DC已經(jīng)描述過的包裝細(xì)胞系SFCMM2(Bonini等，科學(xué)(Science)276，1719-1724(1997))產(chǎn)生編碼融合蛋白(TN)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中含有單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NeoR)以及ΔLNGFr表面標(biāo)記。
所有細(xì)胞系培養(yǎng)在補(bǔ)加了2mM L-谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。
使肝素抗凝的新鮮全血(5-6×107)或富含淋巴細(xì)胞的血色棕黃層中分離的DC貼壁到T25瓶上。37℃下1小時(shí)后，去除未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞層培養(yǎng)在補(bǔ)加了10％FCS、10μg/ml LPS、800U/ml GMCSF、100U/ml的IL-4、2mM L-谷氨酰胺、50mM β-ME的RPMI培養(yǎng)基中。
在培養(yǎng)的第二天，用兩種不同方法轉(zhuǎn)導(dǎo)正在分化的DC1-在1，5-二甲基-1，5-二氮十一甲基聚甲溴化物(4μg/ml)存在條件下與輻照處理(100Gys)的包裝細(xì)胞單層共培養(yǎng)。72小時(shí)后，收獲DC，并接種到新鮮培養(yǎng)基中。
2-用無包裝細(xì)胞系的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清替換培養(yǎng)基。三個(gè)連續(xù)的感染循環(huán)，每24小時(shí)進(jìn)行一次。
在最后一次逆轉(zhuǎn)錄病毒感染48小時(shí)后，用mAb 20.4(ATCC，Rockville，MD)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ΔLNGFr的表達(dá)，從而評(píng)估用這兩種方法獲得的感染細(xì)胞百分率。圖la中報(bào)道的結(jié)果顯示了非常高的表面標(biāo)記DC轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，范圍從50％-90％，并且不依賴所用的方法。轉(zhuǎn)導(dǎo)方法不改變DC的免疫表型和刺激能力，如實(shí)施例3所示，在該實(shí)施例中，通過檢測(cè)DC誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞中TN特異性細(xì)胞毒反應(yīng)的能力來監(jiān)測(cè)TN轉(zhuǎn)基因向DC的轉(zhuǎn)移。實(shí)施例2ΔLNGFr表面標(biāo)記的獲得根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法，通過利用3T3-TN/ΔLNGFr細(xì)胞系與DC共培養(yǎng)證明了ΔLNGFr表面標(biāo)記的轉(zhuǎn)移機(jī)制，即用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)并表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記ΔLNGFr的一種細(xì)胞系，該細(xì)胞系包裝缺陷，不能產(chǎn)生任何載體顆粒。3T3-TN/ΔLNGFr細(xì)胞系由NIH/3T3成纖維細(xì)胞(缺失產(chǎn)生完整逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒所必需的gag-pol包膜基因)的轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生，其中該成纖維細(xì)胞用包裝細(xì)胞系SFCMM2產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在這種無載體系統(tǒng)中，ΔLNGFr標(biāo)記的攝取頻率與那些使用載體生產(chǎn)細(xì)胞系所觀察到的相似(


圖1b)。而且，系統(tǒng)的顯微鏡檢查表明，只有與表達(dá)ΔLNGFr的細(xì)胞靠近和直接接觸的DC才能有效攝取標(biāo)記，并表達(dá)在它們的細(xì)胞表面。實(shí)施例3用負(fù)載TN轉(zhuǎn)基因的DC刺激特異性PBL用預(yù)先與輻照處理的SFCMM2載體(如實(shí)施例1所述)共培養(yǎng)的輻照處理(50Gys)的自體DC，在體外刺激來自胸腺嘧啶激酶免疫患者(TK-免疫)的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)(2×106)。在一輪刺激后檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞的裂解活性。所有刺激均在含有10％人血清的IMDM中進(jìn)行。初次刺激3天后，向各培養(yǎng)物中加入終濃度為10U/ml的IL2。最后一次重復(fù)刺激8天后，用針對(duì)適當(dāng)靶細(xì)胞的4小時(shí)細(xì)胞裂解性鉻釋放分析來檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞的活性。
通過共培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC顯示了誘導(dǎo)對(duì)TN轉(zhuǎn)基因強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力(圖2a)，而通過無細(xì)胞載體上清轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC不能引起任何可檢測(cè)的應(yīng)答。
與輻照處理的3T3-TN/ΔLNGFr細(xì)胞系共培養(yǎng)的DC誘導(dǎo)的應(yīng)答可與載體生產(chǎn)細(xì)胞獲得的應(yīng)答相比(圖2b)，其中該細(xì)胞系中細(xì)胞質(zhì)表達(dá)TN抗原但不能產(chǎn)生載體顆粒。實(shí)施例4MAGE-3轉(zhuǎn)導(dǎo)DC使用實(shí)施例3所描述的相同方法，使用“免疫學(xué)雜志(J.Immunol)159，2513-2521，1997”所描述的編碼黑色素瘤相關(guān)MAGE-3腫瘤抗原的包裝細(xì)胞系M3-CSM。
為了檢測(cè)對(duì)凋亡小體的巨噬作用，用PKH-26紅熒光染料(Sigma)標(biāo)記M3-CSM包裝細(xì)胞，輻照處理后加入到培養(yǎng)2天的DC中。在24和48小時(shí)后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC對(duì)凋亡細(xì)胞的攝取，并用共聚焦顯微鏡技術(shù)分析DC群體。按照廠商的使用說明，用膜聯(lián)蛋白和碘化丙錠分析凋亡細(xì)胞的死亡。未經(jīng)輻照處理的包裝細(xì)胞作陰性對(duì)照。
得到的結(jié)果證明，大約30％的DC在24小時(shí)內(nèi)攝取了凋亡小體，陽性細(xì)胞比例隨時(shí)間而增加。共聚焦顯微鏡技術(shù)證實(shí)DC細(xì)胞質(zhì)中存在熒光小體。使用未輻照包裝細(xì)胞的適當(dāng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該現(xiàn)象對(duì)輻照的完全依賴性。實(shí)施例5用負(fù)載MAGE-3基因的樹突狀細(xì)胞刺激腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)從黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶收集的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)(2×106)，和預(yù)先與輻照處理的M3-CSM包裝細(xì)胞共培養(yǎng)(實(shí)施例3)并經(jīng)輻照處理的DC(5×105)混和。按實(shí)施例3描述對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行初次刺激。10天后在相同條件下對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行再刺激，而第三次刺激使用輻照處理的轉(zhuǎn)導(dǎo)了相同載體的自體T母細(xì)胞(2×106)。檢測(cè)到對(duì)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T母細(xì)胞的識(shí)別，而對(duì)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體T母細(xì)胞不識(shí)別(圖3)。此外，這些效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別并殺死自身黑色素瘤細(xì)胞(圖3)。總之，這些數(shù)據(jù)表明基因工程DC能夠誘導(dǎo)涉及腫瘤抗原MAGE-3的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物特異的免疫應(yīng)答。實(shí)施例6通過供體細(xì)胞獲得HLA-I類異源分子從一個(gè)HLA-Bw4陰性供體獲得的DC暴露于表達(dá)HLA-Bw4的黑色素瘤細(xì)胞。24小時(shí)后，用流式細(xì)胞術(shù)分析DC上相關(guān)組織相容性抗原HLA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DC獲得了HLA-Bw4等位基因(圖4a)。在HLA-A2系統(tǒng)也重復(fù)了相似結(jié)果(圖4b)。為了提供該現(xiàn)象的直接圖像，進(jìn)行了共聚焦顯微鏡分析。顯微鏡下清楚地證實(shí)了DC與供體細(xì)胞的細(xì)胞膜融合。上述分析證明細(xì)胞-細(xì)胞間的接觸是表面分子轉(zhuǎn)導(dǎo)DC的前提。
權(quán)利要求
1.一種涉及將抗原轉(zhuǎn)移到樹突狀細(xì)胞的方法，包括樹突狀細(xì)胞與轉(zhuǎn)染或在其表面表達(dá)目標(biāo)抗原的供體細(xì)胞共培養(yǎng)。
2.權(quán)利要求1中要求的一種方法，其中待轉(zhuǎn)移抗原為腫瘤抗原。
3.權(quán)利要求1中要求的一種方法，其中待轉(zhuǎn)移抗原為重組抗原。
4.權(quán)利要求2中要求的一種方法，其中腫瘤抗原轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞預(yù)先用凋亡因子處理。
5.權(quán)利要求4中要求的一種方法，其中凋亡因子選自輻照或紫外線。
6.權(quán)利要求1中要求的一種方法，其中轉(zhuǎn)移到樹突狀細(xì)胞的抗原為表達(dá)在供體細(xì)胞表面的一種膜抗原。
7.權(quán)利要求1中要求的一種方法，其中表面抗原是一種HLA組織相容性抗原。
8.權(quán)利要求1中要求的一種方法，其中表面抗原是一種重組表面標(biāo)記。
9.權(quán)利要求8中要求的一種方法，其中重組表面標(biāo)記為ΔLNGFr。
10.權(quán)利要求1-9之任意一項(xiàng)要求的一種方法，其中轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。
11.可通過權(quán)利要求1-9的方法獲得的樹突狀細(xì)胞。
12.天然或基因工程細(xì)胞用于將抗原轉(zhuǎn)移到樹突狀細(xì)胞的用途。
13.權(quán)利要求11的樹突狀細(xì)胞用于制備用在主動(dòng)或被動(dòng)免疫治療方案中的試劑之用途。
14.權(quán)利要求11中的樹突狀細(xì)胞用于制備用來調(diào)節(jié)GVHD(移植物抗宿主疾病)和控制被移植器官的移植物排斥的試劑中的用途，其中樹突狀細(xì)胞負(fù)載了異源性組織相容性抗原并可選擇地用合適的細(xì)胞因子處理。
全文摘要
本發(fā)明涉及將抗原轉(zhuǎn)移到樹突狀細(xì)胞的一種方法,包括樹突狀細(xì)胞與轉(zhuǎn)染或表達(dá)有關(guān)抗原的細(xì)胞共培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1360628SQ00808155
公開日2002年7月24日 申請(qǐng)日期2000年5月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月28日
發(fā)明者C·特拉夫薩利, V·盧梭, C·波迪格農(nóng) 申請(qǐng)人:格內(nèi)拉股份公司