專利名稱：：一種促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)的樹突狀細(xì)胞疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種樹突狀細(xì)胞疫苗，特別涉及一種可有效促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)的樹突狀細(xì)胞疫苗及其制備方法。技術(shù)背景脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)在世界上總發(fā)生率20_40人/百萬人/年。美國發(fā)生率為28—55人/百萬人/年，每年新增病例約l萬人，損傷時平均年齡為31.7歲，約有SCI病人230000人?；颊邆€人終生花費約為50萬一200萬美元，每年護(hù)理與治療總費用超過70億美元。我國沒有全面的統(tǒng)計，但估計不低于此水平。脊髓急性損傷的機械性暴力包括壓迫力與牽拉力。直接的壓迫暴力是由于脊柱骨折與脫位、椎間盤、韌帶損傷所致，引起血管損害、軸突變性崩解、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡等等。在傷后數(shù)分鐘內(nèi)灰質(zhì)發(fā)生小的出血，在數(shù)小時內(nèi)損傷迅速沿軸向蔓延至損傷處上下一段脊髓灰質(zhì)。傷后數(shù)分鐘脊髓腫脹壓迫中央管，脊髓內(nèi)壓力超過血管內(nèi)壓力時，出現(xiàn)局部繼發(fā)性缺血，損傷后神經(jīng)源性休克加重了脊髓缺血，缺血又導(dǎo)致組織缺氧，使組織產(chǎn)生并釋放毒性產(chǎn)物，引起了一系列的級聯(lián)放大損傷效應(yīng)。SCI渡過急性期后，病變與神經(jīng)功能趨向穩(wěn)定進(jìn)入慢性期。在損傷局部出現(xiàn)以囊腔及膠質(zhì)瘢痕形成為特征的病理變化，軸突再生失敗。目前SCI治療的策略包括7個方面(l)橋接缺損；(2)脫髓鞘軸突的再髓鞘化；(3)提供營養(yǎng)因子支持；(4)克服膠質(zhì)瘢痕相關(guān)的生長抑制作用；(5)建立新神經(jīng)通路；(6)克服髓鞘相關(guān)的生長抑制作用；(7)保護(hù)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞阻止繼發(fā)性損害。橋接脊髓缺損包括使用外周神經(jīng)、胚胎脊髓組織、雪旺氏細(xì)胞、嗅神經(jīng)嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathingcells,OECs)、成纖維細(xì)胞，可降解人工材料或生物相容性基質(zhì)，干細(xì)胞和其它的組織等。應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(neurotrophine-3，NF-3)、神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor,NGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(gliaderivedneurotrophicfactor,GDNF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)，另外基因治療使用腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、慢病毒為載體向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)細(xì)胞內(nèi)載入神經(jīng)營養(yǎng)因子基因?？朔枨氏嚓P(guān)的生長抑制因子，使用抗體、肽、基因突變、或提高cAMP，克服髓鞘相關(guān)的抑制因子如nogo、MAGP、OMGP。使用硫酸軟骨素酶ABC，消化CSPGs氨基葡聚糖鏈來克服CSPG的抑制作用，即克服膠質(zhì)瘢痕抑制再生的屏障作用。保護(hù)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，防止繼發(fā)性炎癥、缺血、興奮性毒性、凋亡，阻止少突膠質(zhì)細(xì)胞的延遲死亡。已經(jīng)證明有效的藥物為類固醇激素，需要在損傷后8h內(nèi)給予，作用為抑制脂質(zhì)過氧化和水解，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca^的蓄積，保護(hù)細(xì)胞膜，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。還有神經(jīng)節(jié)苷脂(GM-1)，主要作用是保護(hù)細(xì)胞膜，減輕組織水腫，促進(jìn)軸突再生，抑制一氧化氮合酶的合成，減少其對神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷。另外，促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropinreleasinghormone,TRH)、尼莫地平(nimodipine)禾Qgacycliding已經(jīng)進(jìn)行臨床試驗。免疫反應(yīng)在SCI中的作用受到越來越多的關(guān)注。Schwartz等研究發(fā)現(xiàn)SCI后，免疫反應(yīng)在局部組織修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)中起到重要作用，并提出了保護(hù)性自身免疫反應(yīng)(protectiveautoimmunity)的概念。這是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性的自身免疫反應(yīng)，在SCI后對局部神經(jīng)組織和神經(jīng)功能恢復(fù)起到保護(hù)作用，目前研究較多的自身抗原為髓磷脂堿性蛋白(myelinbasicprotein,MBP)及其相關(guān)肽。樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)作為是專職抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcell,APC)，能夠有效地調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強度和反應(yīng)時間。研免證實，骨髓來源的DCs負(fù)載MBP可以改善SCI實驗大鼠的后肢負(fù)重功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步研究證實，導(dǎo)致自身免疫性疾病、具有神經(jīng)保護(hù)作用的是Th-1細(xì)胞(Thelper1cell),而抗原特異性免疫細(xì)胞與成年神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞(adultneuralstem/progenitorcells,aNPCs)之間具有協(xié)同作用。DCs在SCI中的作用獲得肯定，但目前研究尚存在的一些問題首先，研究中使用的動物模型多為脊髓切割傷模型，與臨床患者多因骨折塊、韌帶、椎間盤或血腫壓迫所致的挫傷性損傷病理類型不相符，影響著研究結(jié)果應(yīng)用到臨床；打擊傷模型需要特殊器械，人為誤差大，難以標(biāo)準(zhǔn)化；第二，MBP等制備復(fù)雜，不利于臨床醫(yī)生掌握和研究；第三，使用的自身抗原越來越特異化，多為某單一肽段，而SCI時體內(nèi)多種組織抗原成分并存，相互作用關(guān)系復(fù)雜，可能存在多種相加或相減作用，單一抗原成分難以反映體內(nèi)真實情況。因此我們釆用脊髓鉗夾傷模型，使用包含所有可能抗原成分的脊髓勻漿蛋白(homogenateproteinofspinalcord,hp)研究DCs在SCI中的作用，通過神經(jīng)運動功能評分、病理學(xué)及免疫學(xué)方法相結(jié)合，觀察其對SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，并觀察局部病變范圍、膠質(zhì)瘢痕厚度、空洞大小及軸突再生的變化，希望能為SCI修復(fù)提供新的有效手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可有效促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)的樹突狀細(xì)胞疫苗。本發(fā)明的另一目的是提供此疫苗的制備方法。本發(fā)明所述樹突狀細(xì)胞疫苗是負(fù)載脊髓勻漿蛋白的未成熟樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明所述脊髓損傷是各種機械性暴力(包括壓迫力與牽拉力)所致脊髓的軸突變性崩解、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡等。本發(fā)明所述樹突狀細(xì)胞是從體內(nèi)免疫器官或/和免疫細(xì)胞中直接分離的樹突狀細(xì)胞以及通過骨髓、外周血單核細(xì)胞以及干細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明的疫苗，制備過程簡單，主要步驟是將脊髓勻漿蛋白負(fù)載到自身樹突狀細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明的疫苗的使用方法是，制備好的疫苗通過注射輸入到體內(nèi)，激發(fā)機體的保護(hù)性免疫反應(yīng)，促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)。本發(fā)明的疫苗是通過以下方法制備的1)骨髓細(xì)胞分離，2)用粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化為未成熟樹突狀細(xì)胞，3)制備脊髓勻漿蛋白，4)脊髓勻漿蛋白負(fù)載到未成熟樹突狀細(xì)胞內(nèi)。其中步驟1中所述骨髓細(xì)胞是從人或動物的含有骨髓的骨骼中提取分離出來的。其中步驟2中所述未成熟樹突狀細(xì)胞是從骨髓細(xì)胞分化而來的。其中步驟3中所述脊髓勻漿蛋白是從同系動物的脊髓提取分離出來的。其中步驟4中所述負(fù)載是脊髓勻漿蛋白和未成熟樹突狀細(xì)胞混合后共同用培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間，使前者被后者攝取。本發(fā)明的疫苗經(jīng)過洗滌，即可保存使用，使用前，將細(xì)胞離心分離，加入到PBS中供注射用。本發(fā)明的疫苗具體可以采用以下方法制備1)、骨髓細(xì)胞的獲取取鼠股骨與脛骨，用PBS沖洗后，乙醇固定，再清洗，置RPMI1640培養(yǎng)液中備用；用無菌空針抽取RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將骨髓細(xì)胞沖洗到培養(yǎng)皿中，經(jīng)消毒棉球過濾；收集過濾后的含骨髓細(xì)胞RPMI1640培養(yǎng)液，離心，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，然后加入等體積的PBS，終止裂解反應(yīng)；離心，棄上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液混勻，離心，棄上清。2)、骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)將洗滌后的骨髓細(xì)胞用含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制成細(xì)胞懸液，調(diào)濃度；取6孔板，加入細(xì)胞懸液，同時加入含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，最后加入鼠粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天，期間，換液，同時補充等量含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液與巨噬細(xì)胞集落刺激因子。3)、樹突狀細(xì)胞的鑒定第10天，收集非粘附細(xì)胞并離心，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，本實驗中所使用DCs經(jīng)檢測CDllc+細(xì)胞〉94。/。(見圖5)。以CDllc+細(xì)胞圈門，作I-A/I-E、CD40、CD80、CD86表面標(biāo)志檢測，判定成熟度(見圖6)。其中黑線為未成熟DCs，紅線為LPS刺激后的成熟DCs,檢測顯示刺激后的DCs的特征性標(biāo)記物表達(dá)明顯升高。本實驗中采用未成熟DCs。4)、樹突狀細(xì)胞的負(fù)載獲取同系動物的脊髓，常規(guī)制備脊髓勻槳蛋白并定量，將未成熟DCs放入含脊髓勻漿蛋白的DC培養(yǎng)基培養(yǎng)共同孵育2h，新鮮DC培養(yǎng)基沖洗，冰上保存?zhèn)溆?，注射前，?xì)胞進(jìn)行離心，并懸浮于PBS。實驗表明，本發(fā)明的疫苗可用于動物的促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的疫苗可以用于人類。本發(fā)明的疫苗以從自身或同系動物提取脊髓勻漿蛋白，用自身樹突狀細(xì)胞負(fù)載并注射到自身體內(nèi)為佳。本發(fā)明的疫苗的優(yōu)選制備方法列在實施例中。對本發(fā)明實施例1中從小鼠得到的骨髓制備的疫苗進(jìn)行測試，結(jié)果如下實驗一、脊髓損傷小鼠各治療組運動功能評價成年BALBZc小鼠，使用顯微外科動脈夾制作T10節(jié)段重度鉗夾傷SCI模型；制備小鼠未成熟DCs、hp及hpDCs;實驗動物分3組，傷后1天，BBB評分<2分者，分別局部或腹腔注射hp(局部40Mg/5MU腹腔40/ig/0.3mL)、DCs(局部:lx106cells/5/iL;腹腔lxl06celIs/0.3mL)或hpDCs(局部lxl06cells/5/xL;腹腔lxl06cells/0.3mL);各動物每周進(jìn)行BBB評分，觀察神經(jīng)功能恢復(fù)情況。結(jié)果表明，模型成功率86.5%,各組小鼠在傷后均出現(xiàn)完全性截癱，lw左右BBB評分逐漸恢復(fù)。其中，hpDCs組小鼠恢復(fù)最快，于28dpi進(jìn)入平臺期，BBB評分高達(dá)14.0±2.0，最終達(dá)到16.3±2.1,顯著高于hp組(10.4士1.8)和DCs組(10.0±2.0)。腹腔注射和局部注射BBB評分結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表l、圖l。表1小鼠BBB評分記錄結(jié)果(!1=90)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:與其它二組比較，p<0.01。實驗二、各治療組84dpi脊髓縱行矢狀切片的病理變化觀察小鼠分別于注射后28、56、84天(dayspostinjection,dpi)過量麻醉處死，每個時間點隨機處死4只動物，先用生理鹽水100ml經(jīng)左心室灌注沖凈血液，再用100ml4%多聚甲醛灌注固定。以脊髓損傷區(qū)為中心取脊髓1.5cm，4%多聚甲醛液后固定，石蠟包埋，連續(xù)縱行切片(5Atm)，HE染色觀察損傷后損傷區(qū)病理變化及病變結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色(IHC)與免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)法觀察損傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)、Nestin、神經(jīng)微絲(neurofilament,NF)在損傷區(qū)表達(dá)情況，測量膠質(zhì)瘢痕厚度。HE染色顯示各組在相應(yīng)時間點的病理結(jié)構(gòu)基本相同。在28dpi，損傷區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)混亂，喪失正常脊髓傳導(dǎo)束的縱行排列結(jié)構(gòu)，損傷區(qū)與周圍分界范圍不清；在56dpi,損傷區(qū)形成囊腔，邊界較清楚，有條狀膠質(zhì)瘢痕伸入囊腔內(nèi)，囊腔內(nèi)有較多無定形成分及細(xì)胞成分，囊腔壁有較完整的室管膜細(xì)胞覆蓋；在84dpi,損傷處囊腔邊界清楚，囊壁膠質(zhì)瘢痕增生，囊壁光滑，內(nèi)為液體成分，損傷處形成的囊腔壁有較多新生血管。觀察小鼠SCI后84dpi切片，NF與GFAP熒光雙標(biāo)，以肥大的星形膠質(zhì)細(xì)胞為標(biāo)記，對囊腔壁膠質(zhì)瘢痕的厚度進(jìn)行測量，結(jié)果顯示hpDCs組在損傷區(qū)范圍、空洞面積、膠質(zhì)瘢痕厚度等指標(biāo)與DCs組相比均明顯減輕；空洞面積與hp組相比也明顯減輕。結(jié)果見表2、圖2。表284dpi各組損傷區(qū)范圍、空洞、膠質(zhì)瘢痕厚度測量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實驗三、各治療組脊髓縱行矢狀切片的免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色觀察各組處理同上，免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色觀察損傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)、祌經(jīng)微絲(neurofilament,NF)、Nestin在損傷區(qū)表達(dá)情況。結(jié)果表明，慢性脊髓損傷的囊腔周圍GFAP陽性表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大增生，突起豐富，構(gòu)成膠質(zhì)瘢痕的主要成分。與其它二組相比，hpDCs組GFAP表達(dá)出現(xiàn)較慢，且GFAP陽性細(xì)胞分布較稀疏，說明hpDCs可降低局部膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生，從而可能降低局部由膠質(zhì)細(xì)胞形成的物理屏障，并減少其分泌的抑制性細(xì)胞因子，因此改善神經(jīng)功能；hpDCs組的Nestin陽性細(xì)胞在注射后56dpi仍可見，而其它二組在注射后28dpi基本消失，說明hpDCs可以增加局部神經(jīng)內(nèi)源性再生能力。NF表達(dá)可以明確地觀察到損傷后軸突分布的情況，各組無顯著區(qū)別。結(jié)果見圖3、圖4。圖1為脊髓損傷小鼠各治療組運動功能評價。圖2為各治療組84dpi脊髓縱行矢狀切片的膠質(zhì)瘢痕厚度觀察。A:hp組；B:DCS組；C:hpDCs纟a(紅一NF，綠一GFAP)。圖3為各治療組84dpi脊髓縱行矢狀切片的GFAP陽性細(xì)胞觀察。A:hp組；B:DCs組；C:hpDCs組。圖4為各治療組84dpi脊髓縱行矢狀切片的Nestin陽性細(xì)胞觀察。A:hp組；B:DCs組；C:hpDCs組(紅一Nestin，綠一GFAP)。圖5為DCs百分率(CDlc+細(xì)胞)測定。圖6為DCs表面標(biāo)志物檢測。具體實施方式以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例l、樹突狀細(xì)胞疫苗制備方法的操作步驟1、骨髓細(xì)胞的獲取取BALB/C小鼠兩只，頸椎脫位處死，于75%乙醇中浸泡3min后，將小鼠固定在超凈臺，消毒剝開皮膚，剔去肌肉，取出股骨與脛骨，用PBS沖洗后，在75%乙醇固定3min,再以PBS清洗，置RPMI1640培養(yǎng)液中備用。用鑷子固定骨干，剪刀剪去骨兩端，再用無菌空針抽取RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，反復(fù)2-3次，將骨髓細(xì)胞沖洗到培養(yǎng)皿中，最后將培養(yǎng)皿中含骨髓細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)液經(jīng)消毒棉球過濾，除去其組織成分。收集過濾后的含骨髓細(xì)胞RPMI1640培養(yǎng)液，1500rpm離心15min，棄上清，加入紅細(xì)胞(redbloodcells,RBC)裂解液4ml，裂解3min，然后加入等體積的PBS，充分混勻，終止裂解反應(yīng)。900卬m離心10min，棄上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液混勻，900rpm離心10min，棄上清。2、骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)將洗滌后的骨髓細(xì)胞用含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制成lml的細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)濃度至lxl()S個/ml。取6孔板，加入細(xì)胞懸液0.5mV孔，同時加入含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液2ml/L，最后加入濃度為5mg/ml的鼠粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(mouseGranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,mGM-CSF)10/xl/孔(終濃度為20/xg/ml)。置C02培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)10天，并在第3、6、8天換液，同時補充等量含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液與mGM-CSF。3、樹突狀細(xì)胞的鑒定第10天，收集非粘附細(xì)胞并離心，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，本實驗中所使用DCs經(jīng)檢測CDllc+細(xì)胞〉94。/。(見圖5)。DCs分為兩組，一組為未成熟DCs，另一組為脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激24h(lng/ml)后的成熟DCs。以CDllc十細(xì)胞圈門，作I-A/I-E、CD40、CD80、CD86表面標(biāo)志檢測，判定成熟度(見圖6)。其中黑線為未成熟DCs，紅線為LPS刺激后的成熟DCs，檢測顯示刺激后的DCs的特征性標(biāo)記物表達(dá)明顯升高。本實驗中采用未成熟DCs。4、樹突狀細(xì)胞的負(fù)載獲取同系動物的脊髓，常規(guī)制備脊髓勻漿蛋白并定量，將未成熟DCs放入含脊髓勻漿蛋白(lpg^il)的DC培養(yǎng)基培養(yǎng)(不添加細(xì)胞因子mGM-CSF，細(xì)胞濃度為2xl06/ml)共同孵育2h，新鮮DC培養(yǎng)基沖洗，冰上保存?zhèn)溆?。注射前，?xì)胞進(jìn)行離心，并懸浮于PBS(5xl()5/5nlPBS供局部注射，lxl()6/0.3mlPBS供腹腔注射)。權(quán)利要求1.一種促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)的樹突狀細(xì)胞疫苗，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞疫苗是負(fù)載脊髓勻漿蛋白的未成熟樹突狀細(xì)胞。2.權(quán)利要求1的樹突狀細(xì)胞疫苗，其特征在于，所述未成熟樹突狀細(xì)胞是從體內(nèi)免疫器官或/和免疫細(xì)胞中直接分離的樹突狀細(xì)胞以及通過骨髓、外周血單核細(xì)胞以及干細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞。3.權(quán)利要求1的樹突狀細(xì)胞疫苗，其特征在于，所述脊髓損傷是各種機械性暴力所致脊髓的軸突變性崩解、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡。4.一種促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下幾個步驟1)骨髓細(xì)胞分離，2)用粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化為未成熟樹突狀細(xì)胞，3)制備脊髓勻漿蛋白，4)脊髓勻漿蛋白負(fù)載到未成熟樹突狀細(xì)胞內(nèi)。5.權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于，其中步驟1中所述骨髓細(xì)胞是從人或動物的含有骨髓的骨骼中提取分離出來的。其中步驟2中所述未成熟樹突狀細(xì)胞是從骨髓細(xì)胞分化而來的。其中步驟3中所述脊髓勻漿蛋白是從同系動物的脊髓提取分離出來的。其中步驟4中所述負(fù)載是脊髓勻漿蛋白和未成熟樹突狀細(xì)胞混合后共同用培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間，使前者被后者攝取。6.權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于，步驟如下1)、骨髓細(xì)胞的獲取取鼠股骨與脛骨，用PBS沖洗后，乙醇固定，再清洗，置RPMI1640培養(yǎng)液中備用；用無菌空針抽取RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將骨髓細(xì)胞沖洗到培養(yǎng)皿中，經(jīng)消毒棉球過濾；收集過濾后的含骨髓細(xì)胞RPMI1640培養(yǎng)液，離心，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，然后加入等體積的PBS，終止裂解反應(yīng)；離心，棄上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液混勻，離心，棄上清。2)、骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)將洗滌后的骨髓細(xì)胞用含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制成細(xì)胞懸液，調(diào)濃度；取6孔板，加入細(xì)胞懸液，同時加入含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，最后加入鼠粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子，置C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天，期間，換液，同時補充等量含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液與巨噬細(xì)胞集落刺激因子。3)、樹突狀細(xì)胞的鑒定第10天，收集非粘附細(xì)胞并離心，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，本實驗中所使用DCs經(jīng)檢測CDllc+細(xì)胞〉94。/。(見圖5)。以CDllc+細(xì)胞圈門，作I-A/I-E、CD40、CD80、CD86表面標(biāo)志檢測，判定成熟度(見圖6)。其中黑線為未成熟DCs，紅線為LPS刺激后的成熟DCs，檢測顯示刺激后的DCs的特征性標(biāo)記物表達(dá)明顯升高。本實驗中采用未成熟DCs。4)、樹突狀細(xì)胞的負(fù)載獲取同系動物的脊髓，常規(guī)制備脊髓勻漿蛋白并定量，將未成熟DCs放入含脊髓勻漿蛋白的DC培養(yǎng)基培養(yǎng)共同孵育2h,新鮮DC培養(yǎng)基沖洗，冰上保存?zhèn)溆?，注射前，?xì)胞進(jìn)行離心，并懸浮于PBS。7.權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)骨髓細(xì)胞的獲取取小鼠兩只，頸椎脫位處死，于75。/。乙醇中浸泡3min后，將小鼠固定在超凈臺，消毒剝開皮膚，剔去肌肉，取出股骨與脛骨，用PBS沖洗后，在75%乙醇固定3min，再以PBS清洗，置RPMI1640培養(yǎng)液中備用。用鑷子固定骨干，剪刀剪去骨兩端，再用無菌空針抽取RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，反復(fù)2-3次，將骨髓細(xì)胞沖洗到培養(yǎng)皿中，最后將培養(yǎng)皿中含骨髓細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)液經(jīng)消毒棉球過濾，除去其組織成分，收集過濾后的含骨髓細(xì)胞RPMI1640培養(yǎng)液，1500rpm離心15min,棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液4ml，裂解3min，然后加入等體積的PBS，充分混勻，終止裂解反應(yīng)，900rpm離心10min，棄上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液混勻，900rpm離心10min，棄上清；(2)骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)將洗滌后的骨髓細(xì)胞用含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制成lml的細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)濃度至lxl(^個/ml，取6孔板，加入細(xì)胞懸液0.5ml/孔，同時加入含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液2ml/孔，最后加入濃度為5mg/ml的鼠粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子10/il/孔終濃度為20/xg/ml，置C02培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)10天，并在第3、6、8天換液，同時補充等量含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液與mGM-CSF;(3)樹突狀細(xì)胞的鑒定第10天，收集非粘附細(xì)胞并離心，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，本實驗中所使用DCs經(jīng)檢測CDllc+細(xì)胞〉9415/。，DCs分為兩組，一組為未成熟DCs，另一組為脂多糖刺激24h(lng/ml)后的成熟DCs，以CDllc+細(xì)胞圈門，作I-A/I-E、CD40、CD80、CD86表面標(biāo)志檢測，判定成熟度，其中黑線為未成熟DCs，紅線為LPS刺激后的成熟DCs，檢測顯示刺激后的DCs的特征性標(biāo)記物表達(dá)明顯升高，本實驗中采用未成熟DCs;(4)樹突狀細(xì)胞的負(fù)載獲取同系動物的脊髓，常規(guī)制備脊髓勻漿蛋白并定量，將未成熟DCs放入含脊髓勻漿蛋白lpg/W的DC培養(yǎng)基培養(yǎng)(不添加細(xì)胞因子mGM-CSF，細(xì)胞濃度為2xl06/ml)共同孵育2h，新鮮DC培養(yǎng)基沖洗，冰上保存?zhèn)溆?，注射前，?xì)胞進(jìn)行離心，并懸浮于PBS(5xl05/5nlPBS供局部注射，lxl06/0.3mlPBS供腹腔注射)。8.用權(quán)利要求1的樹突狀細(xì)胞疫苗制備一種促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)的疫苗。9.權(quán)利要求1的疫苗的使用方法，其特征在于，注射到自身體內(nèi)。10.權(quán)利要求9的使用方法，其特征在于，注射前，細(xì)胞進(jìn)行離心，并懸浮于PBS供注射。全文摘要本發(fā)明涉及一種樹突狀細(xì)胞疫苗，特別涉及一種可有效促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)的樹突狀細(xì)胞疫苗及其制備方法。文檔編號C12N5/06GK101332296SQ200810110498公開日2008年12月31日申請日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日發(fā)明者劉明永,梁華平,趙建華申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院