專利名稱：一種基因克隆的高效方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是生物克隆方法，特別是一種基因克隆的高效方法，適合于克隆基因組DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
背景資料原核生物基因的克隆可以通過構(gòu)建基因組文庫(kù)方法來篩選目的基因，也可通過PCR擴(kuò)增目的基因的方法來克隆。
目前最常用的基因組文庫(kù)的構(gòu)建方法是這樣的，基因組DNA用Sau3A I部分酶切后，克隆到經(jīng)BamH I酶切，去磷酸化的載體上，或基因組DNA用Sau3A I部分酶切，經(jīng)半補(bǔ)平克隆到經(jīng)Sal I(或Xho I)酶切，半補(bǔ)平的載體上。這兩種方法均存在著不足，眾所周知，載體去磷酸化反應(yīng)難以控制，對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響很大，而載體和基因組半補(bǔ)平反應(yīng)效率也不高，這都造成克隆效率低下的結(jié)果。
PCR產(chǎn)物的克隆目前常用的方法有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)添加法、尿密啶DNA糖基化酶克隆法、不依賴連接反應(yīng)的克隆法、T/A克隆法及平端克隆法。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)添加法克隆PCR產(chǎn)物，需在PCR擴(kuò)增后再增加幾步處理過程，不僅花費(fèi)時(shí)間，而且會(huì)損失DNA，降低克隆效率，而且基因內(nèi)部存在的限制性酶切位點(diǎn)常常會(huì)妨礙這種方法的應(yīng)用；不依賴連接反應(yīng)的克隆方法引入非基因序列過多；而平端克隆效率很低；T/A克隆法是最流行的PCR產(chǎn)物克隆的方法，但使用T載體克隆，只能用缺乏3′～5′校正酶活性的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)或這類酶與其他類聚合酶的混合物擴(kuò)增目的基因，不適合于單一的具有3′～5′校正酶活性的DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效基因克隆的方法，既可用來高效構(gòu)建基因組文庫(kù)，也適用于克隆任何一種DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，按克隆的要求選擇載體和外源基因DNA片段。在載體上串聯(lián)兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)(如Ear I或Sap I)，經(jīng)Ear I(或Sap I)酶切或Ear I和Sap I雙酶切產(chǎn)生5′端突出3個(gè)堿基的粘性末端5′CTCTTCC 3′3′GAGAAGGCTA5′；外源基因組DNA用合適的限制性內(nèi)切酶，如Sau3A I(或Sau 3A I的同尾酶)酶切后，用Klenow酶補(bǔ)加一個(gè)堿基(dGTP)，形成能與載體粘性末端匹配的粘性末端5′NG3′NCTAG 5′；或者在克隆PCR產(chǎn)物時(shí)，擴(kuò)增引物的兩端分別引入額外的3～4個(gè)核苷酸如Sau3A I酶切位點(diǎn)，得到的產(chǎn)物在d GTP存在下，被T4DNA聚合酶削出5′端突出3個(gè)堿基的粘性末端5′GATC3′3′G 5′恰好與載體酶切形成的粘性末端匹配。
載體與上述方法修飾過的基因組DNA片段或PCR產(chǎn)物通過三個(gè)堿基的粘性末端互補(bǔ)而連接起來。
載體選用的限制性內(nèi)切酶可以是Ear I和Sap I中的任一種，或者是這兩種酶的組合，消化外源片段所選用的內(nèi)切酶可以是Sau3A I，也可用其它Sau3A I的同尾酶。
本發(fā)明的原理是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，使克隆載體與外源DNA片段產(chǎn)生能相互匹配的粘性末端，同時(shí)避免載體自連和外源片段串聯(lián)，從而極大地提高克隆效率。
本發(fā)明不僅可用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建，還可用于PCR產(chǎn)物的克隆，且適合各種DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的克隆，克隆效率均優(yōu)于現(xiàn)行的克隆方法。按本發(fā)明的方法克隆效率可達(dá)90％以上。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1枯草芽孢桿菌外切菊粉酶基因的克隆首先通過定點(diǎn)誘變消除載體pUC18上的三個(gè)Ear I酶切位點(diǎn)，再接上一個(gè)含兩個(gè)串聯(lián)Ear I酶切位點(diǎn)的接頭，構(gòu)建好克隆載體，該克隆載體用Ear I酶切，回收大片段，片段兩端均有一個(gè)5′端突出3個(gè)堿基的粘性末端。抽提枯草芽孢桿菌基因組DNA，用Sau3A I部分酶切并回收2～6kb片段，加dGTP，給Klenow酶作用后，片段兩端均產(chǎn)生一個(gè)5′端突出3個(gè)堿基的粘性末端，然后該片段與酶切后回收的克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過特異性選擇平板篩選到含目的基因的克隆，克隆重組效率達(dá)90％以上。
實(shí)施例2短小芽孢桿菌內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆首先定點(diǎn)誘變消除pUC18上的一個(gè)Sap I位點(diǎn)，接上一個(gè)含兩個(gè)串聯(lián)Sap I酶切位點(diǎn)的接頭，構(gòu)建好克隆載體，用Sap I酶切該克隆載體，回收大片段，片段兩端均有一個(gè)5′端突出3個(gè)堿基的粘性末端。根據(jù)已發(fā)表的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，并在5′端引入四個(gè)核苷酸5′GATC 3′，擴(kuò)增產(chǎn)物加dGTP和T4DNA聚合酶作用后，產(chǎn)生5′端突出3個(gè)堿基的粘性末端，然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物與酶切后的克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過特異性選擇平板篩選到含目的基因的克隆。
權(quán)利要求
1.一種基因克隆的高效方法，按克隆的要求選擇載體和外源基因DNA片段，其特征在于在載體上串聯(lián)兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)生5′端突出3個(gè)堿基的粘性末端；外源基因組DNA用合適的限制性內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)Klenow酶補(bǔ)加一個(gè)堿基(dGTP)，形成能與載體粘性末端匹配的粘性末端，或者在克隆PCR產(chǎn)物時(shí)，擴(kuò)增引物的兩端分別引入額外的3～4個(gè)核苷酸得到的產(chǎn)物在dGTP存在下，被T4DNA聚合酶削出5′端突出3個(gè)堿基的粘性末端，恰好與載體酶切形成的粘性末端匹配，載體與基因組DNA片段或PCR產(chǎn)物通過三個(gè)堿基的粘性末端互補(bǔ)而連接起來，因而外源DNA片段能克隆到載體上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因克隆的高效方法，載體選用的限制性內(nèi)切酶可以是Ear I和Sap I中的任一種，或者是這兩種酶的組合，消化外源片段所選用的內(nèi)切酶可以是Sau3A I，也可用其它Sau3A I的同尾酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的克隆方法，其特征在于該方法既可用于構(gòu)建基因組文庫(kù)，也可用于克隆用各種DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提出一種用于克隆基因組DNA的高效方法。構(gòu)建的克隆載體經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶酶切后,產(chǎn)生的粘性末端能與Sau3A I(或Sau3A I的同尾酶)部分酶切的基因組片段補(bǔ)加一個(gè)堿基dGTP后的粘性末端匹配,可有效地構(gòu)建基因組文庫(kù),也能克隆PCR產(chǎn)物。該方法選用的限制性內(nèi)切酶可以是EarI和SapI中的任一種。使用該載體克隆PCR產(chǎn)物時(shí)需在PCR引物的5′端額外引進(jìn)Sau3A I酶切位點(diǎn),在dGTP存在的條件下,利用T
文檔編號(hào)C12P19/34GK1341750SQ0113351
公開日2002年3月27日 申請(qǐng)日期2001年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月30日
發(fā)明者馬立新, 蔣思婧 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)