本發(fā)明涉及一種文心蘭種質(zhì)資源離體保存及保存后恢復(fù)生長的方法。屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
文心蘭，中國的傳統(tǒng)名花，種質(zhì)資源豐富，分布廣泛，并具有較高的觀賞價值。其繁殖方法一般為分株繁殖，3～4年才能進行一次，繁殖速度較慢。文心蘭種子非常細(xì)小、呈粉狀，沒有胚乳，只有一個簡單的胚，外面包著疏松、透明、不易透水的種皮，胚內(nèi)含有很少的營養(yǎng)物質(zhì)，絕大部分為脂類物質(zhì)，自然條件下文心蘭種子很難萌發(fā)。因此，傳統(tǒng)的種子保存技術(shù)不適用文心蘭種質(zhì)資源保存。
文心蘭多數(shù)栽培品種均是由野生種馴化或自然變異篩選而來。從資源上來說，由于對野生國蘭資源的大量采挖，天然資源已遭到了大量破壞，可采集的野生資源越來越少，再加上自身繁殖速度極其緩慢，我國野生文心蘭資源日趨緊缺，有些珍稀品種已瀕臨滅絕，因此，建立科學(xué)、有效、實用的文心蘭種質(zhì)資源保存技術(shù)迫在敏捷。通過有計劃的培育、繁殖、發(fā)展、保存瀕危的特有種類，才能避免該物種滅絕。
組織培養(yǎng)作為植物種質(zhì)資源離體保存技術(shù)已被廣泛使用，在種質(zhì)資源交換過程中，利用試管苗進行交換不僅運輸成本低，還可避免在交換過程中病蟲害的傳播，也可以解決大田保存占地面積大、費用高等問題。頻繁的離體繼代培養(yǎng)保存技術(shù)，在每一次繼代培養(yǎng)過程中都有可能造成交叉污染，多次的繼代培養(yǎng)還會引發(fā)遺傳變異，同時，隨著繼代培養(yǎng)數(shù)量的增加要耗費大量的人力物力。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種文心蘭種質(zhì)資源離體保存方法。
本發(fā)明還提供了所述離體保存方法保存后恢復(fù)生長的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
一種文心蘭種質(zhì)資源離體保存方法，從文心蘭新生長的假鱗莖上剝?nèi)∏o尖，將其置于VW培養(yǎng)基輔以0.5～1mg/L 6-芐基腺嘌呤的原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面培養(yǎng)成原球莖，將原球莖進行反復(fù)切割和繼代培養(yǎng)，所采用的繼代培養(yǎng)基為VW培養(yǎng)基輔以0.2～0.4mg/L 6-芐基腺嘌呤，從而繁殖出所需數(shù)量的原球莖，然后采用VW培養(yǎng)基輔以2.5mg/L多效唑（PP333）的離體保存培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待原球莖進入發(fā)育生長階段后，在0～5℃條件下暗培養(yǎng)。
優(yōu)選的，所述莖尖的剝?nèi)》椒ㄈ缦拢哼x擇長度為5～7cm的假鱗莖，用自來水清洗表面塵土，剝?nèi)プ钔鈱拥?～2個葉片，用體積濃度75%的酒精擦洗3～4秒，放入質(zhì)量濃度0.1%的升汞溶液中滅菌20分鐘，無菌水沖洗3～4次，晾干或用濾紙吸干表面水分，在顯微鏡下剝?nèi)〈笮〖s為0.5mm的莖尖。
優(yōu)選的，將莖尖置于試管或培養(yǎng)瓶中原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的表面，輕壓莖尖以接觸到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的表面為宜，避免埋入，進而引起窒息死亡，及時密封并做好標(biāo)記。
優(yōu)選的，原球莖的培養(yǎng)方法是：將莖尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養(yǎng)15天后，出現(xiàn)明顯膨大，30天后出現(xiàn)若干個白色突起，45天后，所述突起體積增大形成原球莖。
優(yōu)選的，反復(fù)切割和繼代培養(yǎng)的具體方法是：將生長為4～6mg的原球莖切割成4塊，然后置于繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)擴增培養(yǎng)，建立無性繁殖系，反復(fù)切割和繼代培養(yǎng)，從而短時間繁殖出所需數(shù)量的原球莖。
優(yōu)選的，所述發(fā)育生長階段是選擇發(fā)育健壯、大小均勻的原球莖，置于離體保存培養(yǎng)基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養(yǎng)7天。
優(yōu)選的，暗培養(yǎng)階段應(yīng)當(dāng)定期觀察生長情況，隨時剔除有污染的培養(yǎng)瓶。
優(yōu)選的，暗培養(yǎng)階段所使用的離體保存培養(yǎng)基，厚度約為4cm，并且，用于放置離體保存培養(yǎng)基的試管或培養(yǎng)瓶應(yīng)當(dāng)密閉良好，以減少離體保存培養(yǎng)基中水分的揮發(fā)。
進一步優(yōu)選的，試管或培養(yǎng)瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外層纏繞3層塑料保鮮薄膜。
上述離體保存方法保存后恢復(fù)生長的方法，將暗培養(yǎng)中的原球莖轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，由原球莖分化產(chǎn)生幼苗；所述分化培養(yǎng)基為KC培養(yǎng)基輔以質(zhì)量濃度10%的香蕉汁，培養(yǎng)溫度25℃，光照強度2000lux，每天光照時間為10小時。
優(yōu)選的，原球莖在分化培養(yǎng)基上接種30天后，在原球莖頂端部分出現(xiàn)由葉原基發(fā)育成的幼葉，隨后幼葉迅速生長，待出現(xiàn)第2～3片葉時，原球莖向下伸長，并且有第1條根生出；50天后，等到幼苗有2～3條根，5～6片葉，生長到10cm左右，發(fā)育成完整的植株，將試管苗移栽在育苗基質(zhì)中，在自然條件下生長成正常植株。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明是利用文心蘭莖尖培養(yǎng)技術(shù)，誘導(dǎo)出原球莖，然后通過原球莖分化獲得文心蘭幼苗。作為繼代培養(yǎng)過程中的原球莖，是分化幼苗的中間體，通過低溫保存原球莖，在離體保存培養(yǎng)基中添加適量多效唑，可以大大延長保存時間，減少繼代培養(yǎng)次數(shù)，有效保持了種質(zhì)資源的遺傳特性。保存一定時間后，將培養(yǎng)物置于正常溫度和光照條件下培養(yǎng)，能迅速恢復(fù)生長，分化出幼苗。
現(xiàn)有技術(shù)中通常采用的種子萌發(fā)及快速繁殖技術(shù)，雖然能獲得大量植株，但繁殖后代變異系數(shù)較大，遺傳穩(wěn)定性和品種一致性存在問題，不符合種質(zhì)資源的保存條件。本發(fā)明采用莖尖培養(yǎng)作為外植體，莖尖是植物中生長最快的分生組織，遺傳基因穩(wěn)定，再生能力強，基本不含病毒和其他病源組織（如細(xì)菌、真菌等），經(jīng)過組織培養(yǎng)后可以得到遺傳穩(wěn)定、品種一致以及健壯的無病毒、無病菌植株，達到了去病菌和快速繁殖的目的，具備了種質(zhì)資源離體保存的必要條件。
一般種質(zhì)資源離體保存技術(shù)大都采用試管幼苗保存，但試管幼苗對溫度反應(yīng)比較敏感，保存溫度基本都在12℃以上，不利于較低溫度保存。除文心蘭植物之外，其他植物誘導(dǎo)、分化試管苗的中間體大多為愈傷組織，將愈傷組織誘導(dǎo)成胚狀體或不定芽，最終分化生產(chǎn)出試管苗，而愈傷組織誘導(dǎo)率一般比較低，恢復(fù)培養(yǎng)后在繼續(xù)分化出試管苗的比例也較低，相對于文心蘭原球莖90%以上的分化率，保存愈傷組織需要較高的成本。
本發(fā)明采用原球莖進行離體培養(yǎng)保存，原球莖對溫度的敏感性大大降低，可以有效降低保存溫度，溫度越低，生長速度就越緩慢，保存時間就越長，原球莖在溫度0～5℃范圍內(nèi)可以緩慢生長；保存設(shè)施也相對簡單，在低溫冰柜中采用暗培養(yǎng)保存技術(shù)，去掉了光照設(shè)施，控溫也相對容易，減少了光能損耗，降低了電能消耗，有效的降低保存成本；在離體保存培養(yǎng)基中輔以多效唑，多效唑為植物生長延緩劑，通過抑制赤霉素的合成，減少細(xì)胞的分裂和伸長，降低生長速度，減少了對培養(yǎng)成分的消耗，延長離體培養(yǎng)物的保存時間，保存時間可達到40個月以上。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步的闡述，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。
實施例1：
一種文心蘭種質(zhì)資源離體保存及保存后恢復(fù)生長的方法，具體步驟如下：
（1）從文心蘭新生長的假鱗莖上剝?nèi)∏o尖，將其置于VW培養(yǎng)基輔以0.5mg/L 6-芐基腺嘌呤的原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面培養(yǎng)成原球莖。
其中，莖尖的剝?nèi)》椒ㄈ缦拢哼x擇長度為5cm的假鱗莖，用自來水清洗表面塵土，剝?nèi)プ钔鈱拥?個葉片，用體積濃度75%的酒精擦洗3秒，放入質(zhì)量濃度0.1%的升汞溶液中滅菌20分鐘，無菌水沖洗3次，晾干或用濾紙吸干表面水分，在顯微鏡下剝?nèi)〈笮〖s為0.5mm的莖尖。
將莖尖置于試管或培養(yǎng)瓶中原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的表面，輕壓莖尖以接觸到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的表面為宜，避免埋入，進而引起窒息死亡，及時密封并做好標(biāo)記。
原球莖的培養(yǎng)方法是：將莖尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養(yǎng)15天后，出現(xiàn)明顯膨大，30天后出現(xiàn)若干個白色突起，45天后，所述突起體積增大形成原球莖。表1示出了不同的6-芐基腺嘌呤濃度對原球莖形成的影響。
表1. 6-芐基腺嘌呤含量對原球莖形成的影響
（2）將原球莖進行反復(fù)切割和繼代培養(yǎng)，所采用的繼代培養(yǎng)基為VW培養(yǎng)基輔以0.2mg/L 6-芐基腺嘌呤，從而繁殖出所需數(shù)量的原球莖。
具體方法是：將生長為4mg的原球莖切割成4塊，然后置于繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)擴增培養(yǎng)，建立無性繁殖系，反復(fù)切割和繼代培養(yǎng)，從而短時間繁殖出所需數(shù)量的原球莖。
（3）采用VW培養(yǎng)基輔以2.5mg/L多效唑的離體保存培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待原球莖進入發(fā)育生長階段后，在0℃條件下暗培養(yǎng)。
其中，發(fā)育生長階段是選擇發(fā)育健壯、大小均勻的原球莖，置于離體保存培養(yǎng)基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養(yǎng)7天。
暗培養(yǎng)階段應(yīng)當(dāng)定期觀察生長情況，隨時剔除有污染的培養(yǎng)瓶。
暗培養(yǎng)階段所使用的離體保存培養(yǎng)基，厚度約為4cm，并且，用于放置離體保存培養(yǎng)基的試管或培養(yǎng)瓶應(yīng)當(dāng)密閉良好（試管或培養(yǎng)瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外層纏繞3層塑料保鮮薄膜），以減少離體保存培養(yǎng)基中水分的揮發(fā)。
（4）保存后恢復(fù)生長：將暗培養(yǎng)中的原球莖轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，由原球莖分化產(chǎn)生幼苗；所述分化培養(yǎng)基為KC培養(yǎng)基輔以質(zhì)量濃度10%的香蕉汁，培養(yǎng)溫度25℃，光照強度2000lux，每天光照時間為10小時。
其中，原球莖在分化培養(yǎng)基上接種30天后，在原球莖頂端部分出現(xiàn)由葉原基發(fā)育成的幼葉，隨后幼葉迅速生長，待出現(xiàn)第2片葉時，原球莖向下伸長，并且有第1條根生出；50天后，等到幼苗有2條根，5片葉，生長到10cm左右，發(fā)育成完整的植株，將試管苗移栽在育苗基質(zhì)中，在自然條件下生長成正常植株。
實施例1涉及的各培養(yǎng)基如下：原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以0.5mg/L 6-芐基腺嘌呤）、繼代培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以0.2mg/L 6-芐基腺嘌呤）、離體保存培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以2.5mg/L多效唑）、分化培養(yǎng)基（KC培養(yǎng)基輔以質(zhì)量濃度10%的香蕉汁）。
實施例2：
一種文心蘭種質(zhì)資源離體保存及保存后恢復(fù)生長的方法，具體步驟如下：
（1）從文心蘭新生長的假鱗莖上剝?nèi)∏o尖，將其置于VW培養(yǎng)基輔以1mg/L 6-芐基腺嘌呤的原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面培養(yǎng)成原球莖。
其中，莖尖的剝?nèi)》椒ㄈ缦拢哼x擇長度為7cm的假鱗莖，用自來水清洗表面塵土，剝?nèi)プ钔鈱拥?個葉片，用體積濃度75%的酒精擦洗4秒，放入質(zhì)量濃度0.1%的升汞溶液中滅菌20分鐘，無菌水沖洗4次，晾干或用濾紙吸干表面水分，在顯微鏡下剝?nèi)〈笮〖s為0.5mm的莖尖。
將莖尖置于試管或培養(yǎng)瓶中原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的表面，輕壓莖尖以接觸到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的表面為宜，避免埋入，進而引起窒息死亡，及時密封并做好標(biāo)記。
原球莖的培養(yǎng)方法是：將莖尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養(yǎng)15天后，出現(xiàn)明顯膨大，30天后出現(xiàn)若干個白色突起，45天后，所述突起體積增大形成原球莖。
（2）將原球莖進行反復(fù)切割和繼代培養(yǎng)，所采用的繼代培養(yǎng)基為VW培養(yǎng)基輔以0.4mg/L 6-芐基腺嘌呤，從而繁殖出所需數(shù)量的原球莖。
具體方法是：將生長為6mg的原球莖切割成4塊，然后置于繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)擴增培養(yǎng)，建立無性繁殖系，反復(fù)切割和繼代培養(yǎng)，從而短時間繁殖出所需數(shù)量的原球莖。
（3）采用VW培養(yǎng)基輔以2.5mg/L多效唑的離體保存培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待原球莖進入發(fā)育生長階段后，在5℃條件下暗培養(yǎng)。
其中，發(fā)育生長階段是選擇發(fā)育健壯、大小均勻的原球莖，置于離體保存培養(yǎng)基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養(yǎng)7天。
暗培養(yǎng)階段應(yīng)當(dāng)定期觀察生長情況，隨時剔除有污染的培養(yǎng)瓶。
暗培養(yǎng)階段所使用的離體保存培養(yǎng)基，厚度約為4cm，并且，用于放置離體保存培養(yǎng)基的試管或培養(yǎng)瓶應(yīng)當(dāng)密閉良好（試管或培養(yǎng)瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外層纏繞3層塑料保鮮薄膜），以減少離體保存培養(yǎng)基中水分的揮發(fā)。
（4）保存后恢復(fù)生長：將暗培養(yǎng)中的原球莖轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，由原球莖分化產(chǎn)生幼苗；所述分化培養(yǎng)基為KC培養(yǎng)基輔以質(zhì)量濃度10%的香蕉汁，培養(yǎng)溫度25℃，光照強度2000lux，每天光照時間為10小時。
其中，原球莖在分化培養(yǎng)基上接種30天后，在原球莖頂端部分出現(xiàn)由葉原基發(fā)育成的幼葉，隨后幼葉迅速生長，待出現(xiàn)第3片葉時，原球莖向下伸長，并且有第1條根生出；50天后，等到幼苗有3條根，6片葉，生長到10cm左右，發(fā)育成完整的植株，將試管苗移栽在育苗基質(zhì)中，在自然條件下生長成正常植株。
實施例2涉及的各培養(yǎng)基如下：原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以1mg/L 6-芐基腺嘌呤）、繼代培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以0.4mg/L 6-芐基腺嘌呤）、離體保存培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以2.5mg/L多效唑）、分化培養(yǎng)基（KC培養(yǎng)基輔以質(zhì)量濃度10%的香蕉汁）的具體配方見表2。
實施例3：
一種文心蘭種質(zhì)資源離體保存及保存后恢復(fù)生長的方法，具體步驟如下：
（1）從文心蘭新生長的假鱗莖上剝?nèi)∏o尖，將其置于VW培養(yǎng)基輔以0.8mg/L 6-芐基腺嘌呤的原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面培養(yǎng)成原球莖。
其中，莖尖的剝?nèi)》椒ㄈ缦拢哼x擇長度為6cm的假鱗莖，用自來水清洗表面塵土，剝?nèi)プ钔鈱拥?個葉片，用體積濃度75%的酒精擦洗4秒，放入質(zhì)量濃度0.1%的升汞溶液中滅菌20分鐘，無菌水沖洗3次，晾干或用濾紙吸干表面水分，在顯微鏡下剝?nèi)〈笮〖s為0.5mm的莖尖。
將莖尖置于試管或培養(yǎng)瓶中原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的表面，輕壓莖尖以接觸到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的表面為宜，避免埋入，進而引起窒息死亡，及時密封并做好標(biāo)記。
原球莖的培養(yǎng)方法是：將莖尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養(yǎng)15天后，出現(xiàn)明顯膨大，30天后出現(xiàn)若干個白色突起，45天后，所述突起體積增大形成原球莖。
（2）將原球莖進行反復(fù)切割和繼代培養(yǎng)，所采用的繼代培養(yǎng)基為VW培養(yǎng)基輔以0.3mg/L 6-芐基腺嘌呤，從而繁殖出所需數(shù)量的原球莖。
具體方法是：將生長為5mg的原球莖切割成4塊，然后置于繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)擴增培養(yǎng)，建立無性繁殖系，反復(fù)切割和繼代培養(yǎng)，從而短時間繁殖出所需數(shù)量的原球莖。
（3）采用VW培養(yǎng)基輔以2.5mg/L多效唑的離體保存培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待原球莖進入發(fā)育生長階段后，在2℃條件下暗培養(yǎng)。
其中，發(fā)育生長階段是選擇發(fā)育健壯、大小均勻的原球莖，置于離體保存培養(yǎng)基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養(yǎng)7天。
暗培養(yǎng)階段應(yīng)當(dāng)定期觀察生長情況，隨時剔除有污染的培養(yǎng)瓶。
暗培養(yǎng)階段所使用的離體保存培養(yǎng)基，厚度約為4cm，并且，用于放置離體保存培養(yǎng)基的試管或培養(yǎng)瓶應(yīng)當(dāng)密閉良好（試管或培養(yǎng)瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外層纏繞3層塑料保鮮薄膜），以減少離體保存培養(yǎng)基中水分的揮發(fā)。
（4）保存后恢復(fù)生長：將暗培養(yǎng)中的原球莖轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，由原球莖分化產(chǎn)生幼苗；所述分化培養(yǎng)基為KC培養(yǎng)基輔以質(zhì)量濃度10%的香蕉汁，培養(yǎng)溫度25℃，光照強度2000lux，每天光照時間為10小時。
其中，原球莖在分化培養(yǎng)基上接種30天后，在原球莖頂端部分出現(xiàn)由葉原基發(fā)育成的幼葉，隨后幼葉迅速生長，待出現(xiàn)第3片葉時，原球莖向下伸長，并且有第1條根生出；50天后，等到幼苗有2條根，5片葉，生長到10cm左右，發(fā)育成完整的植株，將試管苗移栽在育苗基質(zhì)中，在自然條件下生長成正常植株。
實施例3涉及的各培養(yǎng)基如下：原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以0.8mg/L 6-芐基腺嘌呤）、繼代培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以0.3mg/L 6-芐基腺嘌呤）、離體保存培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以2.5mg/L多效唑）、分化培養(yǎng)基（KC培養(yǎng)基輔以質(zhì)量濃度10%的香蕉汁）。
實施例1～3涉及的原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以0.5～1mg/L 6-芐基腺嘌呤）、繼代培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以0.2～0.4mg/L 6-芐基腺嘌呤）、離體保存培養(yǎng)基（VW培養(yǎng)基輔以2.5mg/L多效唑）、分化培養(yǎng)基（KC培養(yǎng)基輔以質(zhì)量濃度10%的香蕉汁）的具體配方見表2。
表2.各種培養(yǎng)基的具體配方
上述雖然對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。