本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高甘蔗莖尖培養(yǎng)成活率的方法。
背景技術(shù)：
甘蔗屬無性系繁殖作物，利用自身的蔗莖作為種源繁殖，連續(xù)種植多年后容易感染或者積累病菌。巴西李增生（Lee.TSC）博士報(bào)道，所有甘蔗品種的健康良種在生產(chǎn)上使用5年后，100％感染宿根矮化病。因此，一個(gè)優(yōu)良的甘蔗品種，在連續(xù)種植多年之后，由于病蟲害的侵染，種性嚴(yán)重退化，造成甘蔗品質(zhì)改變，產(chǎn)量減少等問題。通過熱處理結(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)是現(xiàn)在生產(chǎn)上培養(yǎng)甘蔗脫毒健康種苗的一個(gè)主要的技術(shù)。研究結(jié)果表明:這個(gè)方法可以把蔗株上的花葉病、宿根矮化病等用常規(guī)方法難以防治的病害根除，生產(chǎn)無病、無毒的健康種苗。很多國家如巴西、澳大利亞、古巴等都應(yīng)用此技術(shù)建立工廠化生產(chǎn)脫毒苗。但是目前此技術(shù)還存在些許問題，如程序繁多，培養(yǎng)周期時(shí)間長、酚污染嚴(yán)重，莖尖培養(yǎng)成活率不高，培養(yǎng)成本偏高等，這極大的限制了甘蔗脫毒健康種苗的生產(chǎn)數(shù)量和速度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問題，本發(fā)明公開了一種提高甘蔗莖尖培養(yǎng)成活率的方法，簡潔有效的解決了甘蔗莖尖培養(yǎng)酚污染嚴(yán)重、培養(yǎng)成活率不高的技術(shù)問題。
對(duì)此，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
一種提高甘蔗莖尖培養(yǎng)成活率的方法，包含以下步驟：
步驟S1：外植體挑選，挑選生長健康的大田甘蔗植株尾梢為外植體；
步驟S2：前處理，將甘蔗尾梢表面消毒，剝?nèi)ネ鈱尤~鞘；
步驟S3：培養(yǎng)基配置，配置配方為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+白糖30g/L+抗壞血酸5~15mg/L +核黃素10~20mg/L的培養(yǎng)基溶液放入培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶內(nèi)放置濾紙；
步驟S4：接種，切取甘蔗莖尖，放入MS培養(yǎng)液內(nèi)浸泡，取出后接種到步驟S3所述培養(yǎng)瓶內(nèi)的濾紙上進(jìn)行培養(yǎng)；
步驟S5：培養(yǎng)管理，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶一次，使甘蔗莖尖改變?cè)跒V紙上了位置。
優(yōu)選的，所述步驟S1中，挑選生長期為4-6個(gè)月，健康、無病蟲害的大田甘蔗植株尾梢為外植體。
優(yōu)選的，所述步驟S3中，培養(yǎng)瓶內(nèi)墊上4層大小為4cm*4cm的濾紙，培養(yǎng)基溶液不淹沒濾紙。
優(yōu)選的，所述步驟S4中，在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)ネ鈱拥娜~鞘，直至露出甘蔗莖尖生長點(diǎn)為止，切取包含1-2個(gè)芽原基的甘蔗莖尖，切割點(diǎn)位于生長點(diǎn)下方2-3mm。
優(yōu)選的，所述步驟S4中，將切取的甘蔗莖尖放入MS培養(yǎng)液內(nèi)浸泡10~30min，取出后接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)的濾紙墊上進(jìn)行培養(yǎng)。
優(yōu)選的，所述步驟S5中，甘蔗莖尖每星期轉(zhuǎn)接一次新的培養(yǎng)基。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
1、外植體獲取材料方便，不需要沙床培養(yǎng)，節(jié)省時(shí)間，莖尖生長活力強(qiáng)，培養(yǎng)易成活。
2、在培養(yǎng)基內(nèi)添加抗壞血酸和核黃素，抗壞血酸具有抗氧化作用，核黃素具有促進(jìn)發(fā)育和細(xì)胞再生的作用。因此，此配方具有降低莖尖酚害，促進(jìn)莖尖生長的作用。
3、在液體培養(yǎng)基內(nèi)放濾紙，相比傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)，莖尖可以移動(dòng)位置，濾紙可以吸附酚害物質(zhì)，液體可以稀釋莖尖切割產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，有助于降低酚類物質(zhì)對(duì)莖尖的傷害。
4、切取的甘蔗莖尖先浸泡后接種，這樣可以清洗莖尖被切割所破壞的細(xì)胞質(zhì)液，同時(shí)使表面細(xì)胞吸附營養(yǎng)，有助于減少酚害物質(zhì)的產(chǎn)生以及莖尖的生長。
5、這個(gè)方法相比傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)相比，莖尖成活率提高40-55%，培養(yǎng)周期縮短20-30天。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
（1）外植體的挑選：挑選生長期為4個(gè)月的健康、生長旺盛、無病蟲害的甘蔗植株尾梢作為外植體。
（2）前處理：將甘蔗尾梢表面使用75%的酒精消毒，剝?nèi)ネ鈱尤~鞘。
（3）培養(yǎng)基的配置：培養(yǎng)基配方為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+抗壞血酸5mg/L+核黃素10mg/L+白糖30g/L；先按照配方量取各個(gè)成分的母液，稱量白糖，將其混合溶解在總體積1/3的蒸餾水內(nèi)，加入白糖，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤胝麴s水定容至所需的體積；然后用1mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl 調(diào)節(jié)pH 值至5.8；在每個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)放入一張折成4層，大小為4cm*4cm的濾紙；用移液器量取10ml配好的培養(yǎng)液分裝到各個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)；最后在1.1 kg/cm2 壓力下滅菌30 分鐘，出鍋冷卻后即為莖尖培養(yǎng)基。
（4）莖尖接種：在超凈工作臺(tái)上將甘蔗尾梢一層層地剝?nèi)ネ獠咳~鞘，直至露出生長點(diǎn)，切取生長點(diǎn)下2-3mm的位置，放入經(jīng)過滅菌的MS培養(yǎng)液內(nèi)浸泡10分鐘；撈出后接種到莖尖培養(yǎng)基的濾紙墊上進(jìn)行培養(yǎng)。
（5）培養(yǎng)管理：每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶一次，使莖尖改變?cè)跒V紙上了位置。每星期轉(zhuǎn)接一次新的培養(yǎng)基，直至莖尖長出新的側(cè)芽為止。
本實(shí)施例所述培養(yǎng)方法中，莖尖成活率為60%，培養(yǎng)周期為55天。
實(shí)施例 2
（1）外植體的挑選：挑選生長期為5個(gè)月的甘蔗健康、生長旺盛、無病蟲害的植株尾梢作為外植體。
（2）前處理：將甘蔗尾梢表面使用75%的酒精消毒，剝?nèi)ネ鈱尤~鞘。
（3）培養(yǎng)基的配置：培養(yǎng)基配方為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+抗壞血酸10mg/L+核黃素15mg/L+30 g/L 白糖；先按照配方量取各個(gè)成分的母液，稱量白糖，將其混合溶解在總體積1/3的蒸餾水內(nèi)，加入白糖，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤胝麴s水定容至所需的體積；然后用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至5.8；在每個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)放入一張折成4層，大小為4cm*4cm的濾紙；用移液器量取10ml配好的培養(yǎng)液分裝到各個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)；最后在1.1 kg/cm2壓力下滅菌30 分鐘，出鍋冷卻后即為莖尖培養(yǎng)基。
（4）莖尖接種：在超凈工作臺(tái)上將甘蔗尾梢一層層地剝?nèi)ネ獠咳~鞘，直至露出生長點(diǎn)，切取生長點(diǎn)下2-3mm的位置，放入經(jīng)過滅菌的MS培養(yǎng)液內(nèi)浸泡20分鐘；撈出后接種到莖尖培養(yǎng)基的濾紙墊上進(jìn)行培養(yǎng)。
（5）培養(yǎng)管理：每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶一次，使莖尖改變?cè)跒V紙上了位置。每星期轉(zhuǎn)接一次新的培養(yǎng)基，直至莖尖長出新的側(cè)芽為止。
本實(shí)施例所述培養(yǎng)方法中，莖尖成活率為75%，培養(yǎng)周期為40天。
實(shí)施例 3
（1）外植體的挑選：挑選生長期為6個(gè)月的甘蔗健康、生長旺盛、無病蟲害的植株尾梢作為外植體。
（2）前處理：將甘蔗尾梢表面使用75%的酒精消毒，剝?nèi)ネ鈱尤~鞘。
（3）培養(yǎng)基的配置：培養(yǎng)基配方為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+抗壞血酸15mg/L+核黃素20mg/L+30 g/L白糖；先按照配方量取各個(gè)成分的母液，稱量白糖，將其混合溶解在總體積1/3的蒸餾水內(nèi)，加入白糖，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤胝麴s水定容至所需的體積；然后用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至5.8；在每個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)放入一張折成4層，大小為4cm*4cm的濾紙；用移液器量取10ml配好的培養(yǎng)液分裝到各個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)；最后在1.1 kg/cm2壓力下滅菌30 分鐘，出鍋冷卻后即為莖尖培養(yǎng)基。
（4）莖尖接種：在超凈工作臺(tái)上將甘蔗尾梢一層層地剝?nèi)ネ獠咳~鞘，直至露出生長點(diǎn)，切取生長點(diǎn)下2-3mm的位置，放入經(jīng)過滅菌的MS培養(yǎng)液內(nèi)浸泡30分鐘；撈出后接種到莖尖培養(yǎng)基的濾紙墊上進(jìn)行培養(yǎng)。
（5）培養(yǎng)管理：每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶一次，使莖尖改變?cè)跒V紙上了位置。每星期轉(zhuǎn)接一次新的培養(yǎng)基，直至莖尖長出新的側(cè)芽為止。
本實(shí)施例所述培養(yǎng)方法中，莖尖成活率為65%，培養(yǎng)周期為50天。
由實(shí)施例1～3可知，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法方法可使甘蔗莖尖培養(yǎng)成活率達(dá)到60-75%，培養(yǎng)周期為40-55天。
對(duì)比例
（1）外植體的挑選和準(zhǔn)備：挑選健康的甘蔗蔗莖，砍成單芽，放入52°C的溫水中浸泡半個(gè)小時(shí)，再將其種在沙床上進(jìn)行催芽15-20天，待芽長至10-15cm高時(shí)便可作為莖尖培養(yǎng)的外植體。
（2）前處理：切下腋芽苗，清洗干凈，使用75%的酒精拭擦表面。
（3）培養(yǎng)基的配置：培養(yǎng)基配方為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L +30 g/L 白糖+4.5g/L瓊脂；先按照配方量取各個(gè)成分的母液，稱量白糖和瓊脂，將其混合溶解在總體積1/3的蒸餾水內(nèi)，加入白糖和瓊脂，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤胝麴s水定容至所需的體積；然后用1 mol/L 的NaOH 或1 mol/L 的HCl 調(diào)節(jié)pH 值至5.8；用移液器量取10ml配好的培養(yǎng)液分裝到各個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)；最后在1.1 kg/cm2 壓力下滅菌30 分鐘，出鍋冷卻培養(yǎng)基凝固后即為莖尖培養(yǎng)基。
（4）莖尖接種：在超凈工作臺(tái)上將甘蔗腋芽苗一層層地剝?nèi)ネ獠咳~鞘，直至露出生長點(diǎn)，切取生長點(diǎn)下2-3mm的位置，接種到莖尖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
（5）培養(yǎng)管理：每星期轉(zhuǎn)接一次新的培養(yǎng)基，直至莖尖長出新的側(cè)芽為止。
本實(shí)施例所述培養(yǎng)方法中，莖尖成活率為20%，培養(yǎng)周期為70天。
由本對(duì)比例可知，當(dāng)所述步驟(1)中使用甘蔗腋芽催苗作為外植體，步驟（3）培養(yǎng)基配方內(nèi)沒有添加抗壞血酸和核黃素時(shí)，培養(yǎng)瓶內(nèi)未放入濾紙，步驟（4）切下的莖尖葉原基未在滅菌的MS培養(yǎng)基中浸泡再接種。莖尖在培養(yǎng)一周后，慢慢變褐，死亡，只有少數(shù)生長力比較旺盛的莖尖可以成活，培養(yǎng)成活率比本發(fā)明方法低50%；甘蔗腋芽培養(yǎng)需要15天，加上莖尖生長速度慢，整個(gè)莖尖培養(yǎng)周期會(huì)多出20-30天作用；在腋芽培養(yǎng)和外植體準(zhǔn)備的過程中，多出許多工序，花費(fèi)了更多的人力物力，促使組培苗成本增高。