本發(fā)明屬于植物繁殖技術領域，涉及一種華南錐無性繁殖的方法。
背景技術：
華南錐（Castanopsis concinna (Champ. ex Benth.) A. DC.），殼斗科錐屬，常綠喬木，高10-15米，很少達20米，胸徑達50厘米，當年生枝及花序軸被黃或紅棕色微柔毛及頗厚的細片狀易抹落的蠟鱗層，三年生枝無或幾無毛。分布于中國珠江三角洲以西南至廣西岑溪、防城一帶，北限見于廣東的廣寧縣（越過北回歸線稍北），沿海島嶼只見于香港。生于海拔約500米以下花崗巖風化的紅壤丘陵坡地常綠闊葉林中。種子含淀粉，種仁可作木本糧食，味道能與板栗媲美；木材顏色鮮艷，材質堅重有彈性，耐水濕，是家具、器械、建筑的優(yōu)良用材。是中國國家Ⅱ級重點保護野生植物。
目前，華南錐有性繁殖主要靠雜交授粉完成，即選用不同品種或同品種不同株間相互授粉，然而有性繁殖周期較長。組織培養(yǎng)技術是一種快速無性繁殖技術，選擇華南錐優(yōu)良家系或者無性系為材料，通過組織培養(yǎng)方法繁殖苗木，既可以滿足生產上的數量要求，又可保持母本性狀。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對黃檀組織培養(yǎng)過程中芽增殖系數低，生長緩慢等問題,提供一種生長效果好、擴繁快的黃檀嫩枝組培繁殖方法。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下：
一種華南錐無性繁殖的方法，包括外植體選擇、外植體處理、初始芽誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯芽培養(yǎng)和生根培養(yǎng)工序，采集半木質化、生長健壯的當年生黃檀嫩枝作為外植體，對外植體進行修剪、滅菌消毒處理后接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中獲取初始芽，再將初始芽接種于增殖培養(yǎng)基中經過3-4個周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導生根，具體操作步驟如下：
（1）外植體選擇：采集半木質化、生長健壯的當年生黃檀嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10-15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間15-20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；
（3）初始芽誘導培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，35-40 d轉接一次，循環(huán)往復，經3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導生根；余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復步驟（5），循環(huán)往復，獲得大量壯芽。
以上所述的初始芽誘導培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 4.0-6.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+KT 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+葡萄糖25 g/L。
以上所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良1/2MS培養(yǎng)基+TDZ 6.0-8.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+葡萄糖 30 g/L。
以上所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+TDZ 3.0-4.0 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+葡萄糖 25 g/L。
以上所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 1.5-2.5 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+葡萄糖 30 g/L。
所述的改良MS培養(yǎng)基的配方為：KNO3 874 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 295 mg·L-1；MgSO4·7H2O 318 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4 340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 70 mg·L-1。
以上步驟（3）所述的初始芽誘導培養(yǎng)的培育控制條件為：光培養(yǎng)、光照500-1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃；步驟（4）所述的增殖培養(yǎng)、步驟（5）所述的壯芽培養(yǎng)、步驟（6）所述的生根培養(yǎng)的培育控制條件均為：光培養(yǎng)，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃。
相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果如下：
1、本發(fā)明以黃檀當年生嫩枝作為外植體，經過初始芽培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始芽萌動率90%以上；經過3-4個周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數5/30d-7/30d，再將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導生根，從而縮短了黃檀的育苗周期，節(jié)省育苗材料，克服了傳統(tǒng)育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期長等問題，大大降低了生產成本，提高了生產效率。
2、本發(fā)明將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導生根，余下小芽叢繼續(xù)增殖培養(yǎng)，使得材料能夠多次繼代，實現(xiàn)大量增殖，規(guī)?；a壯芽，實現(xiàn)黃樟油素型樟樹的擴繁。
3、本發(fā)明對MS基本培養(yǎng)基進行了改良，同時重點調整了與黃檀出芽壯芽相關元素，使得培養(yǎng)基更科學，更有針對性，更易促使黃檀芽誘導的發(fā)生、增殖和壯芽，效果顯著。
4、本發(fā)明操作過程簡便，培養(yǎng)周期短，繼代芽產量大,并且質量優(yōu)，增殖系數達到5以上的組培苗產業(yè)化技術要求，具有很好的經濟效益、生態(tài)效益和社會效益。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例1：
（1）外植體選擇：采集半木質化、生長健壯的當年生黃檀嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間15 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；
（3）初始芽誘導培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照500 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 4.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+葡萄糖25 g/L；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉接一次，循環(huán)往復，經3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 6.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+葡萄糖 30 g/L；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+TDZ 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+葡萄糖 25 g/L；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復步驟（5），循環(huán)往復，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導生根，生根率為89%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+葡萄糖 30 g/L。
所述的改良MS培養(yǎng)基的配方為：以上所述改良MS培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：KNO3 874 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 295 mg·L-1；MgSO4·7H2O 318 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4 340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B60.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 70 mg·L-1。
實施例2：
（1）外植體選擇：采集半木質化、生長健壯的當年生黃檀嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；
（3）初始芽誘導培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 5.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+KT 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+葡萄糖25 g/L；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉接一次，循環(huán)往復，經3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 7.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+葡萄糖 30 g/L；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+TDZ 3.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+葡萄糖 25 g/L；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復步驟（5），循環(huán)往復，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導生根，生根率為92%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+葡萄糖 30 g/L。
所述的改良MS培養(yǎng)基的配方為： KNO3 874 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 295 mg·L-1；MgSO4·7H2O 318 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4 340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 70 mg·L-1。
實施例3：
（1）外植體選擇：采集半木質化、生長健壯的當年生黃檀嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；
（3）初始芽誘導培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 6.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+KT 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+葡萄糖25 g/L；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉接一次，循環(huán)往復，經3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 8.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+葡萄糖 30 g/L；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+TDZ 4.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+葡萄糖 25 g/L；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復步驟（5），循環(huán)往復，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導生根，生根率為93%；；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+TDZ 2.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+葡萄糖 30 g/L。
以上所述的改良MS培養(yǎng)基的配方為： KNO3 874 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 295 mg·L-1；MgSO4·7H2O 318 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 70 mg·L-1。