本發(fā)明屬于藻類組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種銅藻種質(zhì)資源的離體保存方法。
背景技術(shù)：
：銅藻sargassumhorneri(turner)c.agardh隸屬于馬尾藻屬(sargassum)，是近海海洋生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，不僅可為經(jīng)濟(jì)魚類提供覓食和棲息場(chǎng)所，還可吸附海水中的富營(yíng)養(yǎng)化物質(zhì)和重金屬等，作為修復(fù)近海生態(tài)環(huán)境的工具海藻，是一類重要的經(jīng)濟(jì)褐藻。近年來，隨著人們對(duì)其研究的逐漸深入，銅藻中富含的褐藻膠、巖藻黃素、膳食纖維、多糖等生物活性物質(zhì)引起了國(guó)內(nèi)外的普遍關(guān)注，被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、飼料和有機(jī)肥料等方面。隨著銅藻資源的開發(fā)利用，加上受近岸海域開發(fā)和污染的影響，造成其資源量不斷下降，因此在保護(hù)現(xiàn)有野生資源的同時(shí)，利用藻類組織培養(yǎng)方法對(duì)具有優(yōu)良性狀的銅藻種質(zhì)資源進(jìn)行離體保存對(duì)開展它的人工苗種繁育和海區(qū)增殖都有重要的意義。離體培養(yǎng)保存正日益成為大型經(jīng)濟(jì)海藻種質(zhì)資源保存的常用手段，但普遍存在的問題就是繼代頻繁，每一次繼代都可能造成交叉污染，而當(dāng)保存量較大時(shí)，繼代培養(yǎng)所消耗的人力和物力成本很高。另外，銅藻藻體較大，生長(zhǎng)速度快，在實(shí)驗(yàn)室不易長(zhǎng)時(shí)間保持其藻體的正?；钚裕o銅藻種質(zhì)資源的離體保存帶來很大困難。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)銅藻的研究主要集中在生態(tài)學(xué)、人工增養(yǎng)殖和繁殖生物學(xué)等方面，但有關(guān)其種質(zhì)資源保存的研究還比較少。中國(guó)發(fā)明專利“一種利用低溫保存銅藻受精卵的方法”(公布號(hào)為cn104145946a的)中公開了利用低溫保存銅藻受精卵的方法，該方法是將受精卵于4-8℃下保存，使其在假根伸長(zhǎng)之前完成異地跨地區(qū)運(yùn)輸從而進(jìn)行苗種培育，而對(duì)于銅藻種質(zhì)的室內(nèi)離體培養(yǎng)保存目前尚無有效的保存方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)的不足而提供一種銅藻種質(zhì)資源離體保存的方法，從而有效的進(jìn)行銅藻種質(zhì)資源的離體保存。本發(fā)明的銅藻種質(zhì)資源離體保存的方法，包括如下的步驟：1)將要進(jìn)行保存的銅藻種質(zhì)資源進(jìn)行清洗；2)將清洗好的銅藻取藻株主枝用體積濃度75％的酒精浸泡25～30s，然后用消毒海水快速?zèng)_洗3～4次，沖洗后滅菌條件下切取藻株主枝尖端作為離體保存的對(duì)象；所述的藻株主枝尖端，其長(zhǎng)度優(yōu)選為8～12cm3)將切取的藻株主枝尖端放入保存培養(yǎng)基中，在5～8℃、光照強(qiáng)度為2000～2500lx，光周期為10l:14d，充氣條件下進(jìn)行保存；定期更換培養(yǎng)基所述的述的種質(zhì)保存培養(yǎng)液是在滅菌海水中加入0.1mol/l的nano3，0.1mol/l的nah2po4和1mg/l烯效唑；所述的培養(yǎng)液優(yōu)選每10天更換一次；所述的光照由白色熒光燈提供；4)待保存的藻株主枝生長(zhǎng)到長(zhǎng)度不短于15厘米時(shí)，去掉藻株主枝的基部，將保留的藻株尖端繼續(xù)放入種質(zhì)保存培養(yǎng)液中進(jìn)行種質(zhì)保存培養(yǎng)。(5)所述保存后恢復(fù)生長(zhǎng)步驟為：取出離體保存6個(gè)月的藻體，轉(zhuǎn)入外尺寸為長(zhǎng)80cm×寬45cm×高40cm的循環(huán)水箱中，培養(yǎng)液為正常海水。培養(yǎng)條件為：溫度10～15℃，光照強(qiáng)度4000～5000lx，光周期12l:12d，充氣量較大，使藻體上下翻滾，每7天換水量為總水體的50％，藻體保持旺盛生長(zhǎng)，經(jīng)過約15～20天的培養(yǎng)，藻體長(zhǎng)至20厘米以上，即可用于后續(xù)育苗使用。本發(fā)明所提供的方法進(jìn)行銅藻離體保存，可大大延長(zhǎng)了銅藻藻株主枝的保存時(shí)間。經(jīng)保存的材料可快速恢復(fù)生長(zhǎng)，并能進(jìn)行大量繁殖，大量繁殖所獲得的種苗與未經(jīng)保存過的種苗相比，其形態(tài)特征和長(zhǎng)勢(shì)無明顯差異。本發(fā)明的方法可在短期內(nèi)提供大量的銅藻優(yōu)質(zhì)種苗，有效解決了銅藻種質(zhì)資源保存及規(guī)?；鐔栴}，具有廣泛的應(yīng)用前景。附圖說明圖1：添加不同濃度烯效唑的培養(yǎng)液對(duì)葉綠素a含量的影響圖；圖2：添加不同濃度烯效唑的培養(yǎng)液對(duì)類胡蘿卜素含量的影響圖。具體實(shí)施方式申請(qǐng)人研究中發(fā)現(xiàn)，用滅菌海水對(duì)銅藻主枝尖端進(jìn)行培養(yǎng)保存，30d時(shí)即出現(xiàn)藻體顏色明顯變淺，尖端發(fā)白等表觀性狀，通過對(duì)其葉綠素a和類胡蘿卜素含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)均明顯降低。所以，本申請(qǐng)配制保存培養(yǎng)基的目的就是為了在保存過程增加藻體的干重，并保持葉綠素a和類胡蘿卜素的含量。下面對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例1本實(shí)施例所配制的種質(zhì)保存培養(yǎng)液，其組分如下：加入0.1mol/lnano3，0.1mol/lnah2po4，1mg/l烯效唑的滅菌海水。上述組分及配比，既可以延緩銅藻保存時(shí)的生長(zhǎng)速度，又不影響其保存后的恢復(fù)生長(zhǎng)。對(duì)銅藻的保存步驟如下：(1)選擇具有優(yōu)良性狀的銅藻種質(zhì)，用毛刷和鑷子清除表面的附著生物，然后用海水反復(fù)清洗去除泥沙及雜質(zhì)；(2)將處理好的銅藻放在超凈工作臺(tái)上，取藻體主枝用體積濃度75％的酒精浸泡25～30s，然后用大量消毒海水快速?zèng)_洗3～4次，用滅菌的解剖刀切取藻體主枝尖端10厘米的片段作為離體保存的對(duì)象；(3)種質(zhì)保存的條件為：在容積為1000ml的三角瓶中進(jìn)行，每個(gè)三角瓶裝800ml培養(yǎng)液，放置兩株藻體，微量充氣，使培養(yǎng)液表面有小氣泡冒出；保存溫度為5～8℃，光照強(qiáng)度為2000～2500lx，光周期為10l:14d，由白色熒光燈提供。(4)定期觀察保存藻體的生長(zhǎng)情況，與對(duì)照(正常滅菌海水中培養(yǎng))相比，藻體生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)度明顯縮短，主枝明顯增粗，約30天左右，藻體長(zhǎng)度長(zhǎng)至15厘米左右，用解剖刀剪去基部，僅保留尖端10厘米的藻體片段，再繼續(xù)放入種質(zhì)保存培養(yǎng)液中進(jìn)行種質(zhì)保存培養(yǎng)。不同培養(yǎng)液、溫度、光照強(qiáng)度、充氣大小對(duì)保存效果的影響如下所示，測(cè)定的生長(zhǎng)指標(biāo)包括藻體的鮮質(zhì)量(freshweight,fw)、藻體長(zhǎng)度以及表觀癥狀等，其中鮮質(zhì)量的增加量以比生長(zhǎng)速率(relativegrowthrate,rgr)表示，計(jì)算公式如下：rgr＝[(wt/w0)1/t-1]×10式中wt為實(shí)驗(yàn)中期或結(jié)束時(shí)藻體鮮重(g)，w0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)藻體鮮重(g)，t為培養(yǎng)時(shí)間(d)。(1)培養(yǎng)液對(duì)銅藻離體保存的影響將試驗(yàn)材料放入不同濃度烯效唑的培養(yǎng)液中保存，每組處理三個(gè)平行，保存條件：溫度10℃，光照強(qiáng)度2500lx，光周期12l:12d，微量充氣。結(jié)果表明，銅藻在烯效唑濃度為1.0mg/l保存時(shí)間最長(zhǎng)，為182天，具體情況見表1。表1不同培養(yǎng)液對(duì)銅藻種質(zhì)資源保存效果(2)溫度對(duì)銅藻離體保存的影響將試驗(yàn)材料放入本發(fā)明的保存培養(yǎng)基中，分別放置于溫度5℃，8℃，10℃，15℃的光照培養(yǎng)箱保存，每組處理三個(gè)平行，其他保存條件：光照強(qiáng)度2500lx，光周期12l:12d，微量充氣。結(jié)果表明，銅藻在溫度為5℃培養(yǎng)箱中保存時(shí)間最長(zhǎng)，為187天。具體情況見表2。表2不同溫度對(duì)銅藻種質(zhì)資源保存效果(3)光照強(qiáng)度對(duì)銅藻離體保存的影響將試驗(yàn)材料放入本發(fā)明的保存培養(yǎng)基中，分別放置于1000lx，1500lx，2000lx，2500lx，3000lx的光照強(qiáng)度下保存，每組處理三個(gè)平行，其他保存條件：溫度10℃，光周期12l:12d，微量充氣。結(jié)果表明，銅藻在光照強(qiáng)度為2000lx保存時(shí)間最長(zhǎng)，為187天，具體見表3。表3不同光照強(qiáng)度對(duì)銅藻種質(zhì)資源保存效果(4)充氣量對(duì)銅藻離體保存的影響將試驗(yàn)材料分別放置于不充氣，微量充氣(培養(yǎng)液表面有小氣泡冒出)，充氣量大(藻體上下翻滾)下保存培養(yǎng)，溫度10℃，光照強(qiáng)度2500lx，光周期12l:12d。結(jié)果表明，銅藻在充氣量較小的條件下保存時(shí)間最長(zhǎng)，為157天，具體見表4。表4充氣大小對(duì)銅藻種質(zhì)資源保存效果(5)培養(yǎng)液對(duì)銅藻主要光合色素含量的影響葉綠素a和類胡蘿卜素含量的測(cè)定方法如下：取0.1g新鮮藻體研磨成勻漿狀，加入8ml80％丙酮置于4℃黑暗處抽提24h。4000r/min，4℃離心10min棄沉淀，上清用80％丙酮定容至10ml。以80％丙酮作為空白對(duì)照，測(cè)定665、652、510、480nm波長(zhǎng)處的吸光值。重復(fù)3次以上，計(jì)算平均值。葉綠素a的含量按照公式w(chl-a)＝(16.29od665－8.54od652)×v/w/1000計(jì)算，類胡蘿卜素的含量按照公式w(car)＝7.6×(od480－1.49×od510)×v/w/1000，式中v為浸提丙酮的體積(ml)，w為藻體質(zhì)量(g)，單位為mg/g。將試驗(yàn)材料放入不同濃度烯效唑的培養(yǎng)液中保存30d，分別測(cè)定葉綠素a和類胡蘿卜素的含量，以保存材料第0天的值作為對(duì)照。結(jié)果表明，在自然滅菌海水中培養(yǎng)30d，葉綠素a和類胡蘿卜素的含量顯著下降至對(duì)照的58.43％和73.36，用添加了不同質(zhì)量濃度(0.1～2.0mg/l)烯效唑的培養(yǎng)液培養(yǎng)30d后銅藻主要光合色素含量的差異見附圖。由圖1可見，在0.1～2.0mg/l質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨烯效唑質(zhì)量濃度的提高,銅藻藻體的葉綠素a含量逐漸增高。其中,0.1和0.5mg/l實(shí)驗(yàn)組藻體葉綠素a含量顯著低于對(duì)照,較對(duì)照分別降低了29.4％和6.5％，而1.0和2.0mg/l的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照無顯著差異。類胡蘿卜素的含量也是0.1和0.5mg/l實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照；1.0mg/l實(shí)驗(yàn)組的類胡羅素含量最高，為0.092±0.007mg/g鮮重，略高于對(duì)照組(0.090±0.002mg/g鮮重)；2.0mg/l的實(shí)驗(yàn)組的類胡羅素含量為0.090±0.008，與對(duì)照無顯著差異。可見,在培養(yǎng)液中添加適量的烯效唑能夠顯著提高銅藻藻體的葉綠素a和類胡羅素的含量，且以1.0mg/l質(zhì)量濃度下最利于葉綠素a和類胡羅素的合成與積累。上述結(jié)果表明本發(fā)明的培養(yǎng)液能有效的進(jìn)行銅藻離體的長(zhǎng)期保存。(6)離體保存的銅藻生長(zhǎng)恢復(fù)情況將具有優(yōu)良性狀的銅藻種質(zhì)在本發(fā)明的培養(yǎng)液中保存182天后取出進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)，所述保存后恢復(fù)生長(zhǎng)步驟如下：取出離體保存的藻體，轉(zhuǎn)入外尺寸為長(zhǎng)80cm×寬45cm×高40cm的循環(huán)水箱中，培養(yǎng)液為正常海水。培養(yǎng)條件為：溫度10～15℃，光照強(qiáng)度4000～5000lx，光周期12l:12d，充氣量較大，使藻體上下翻滾，每7天換水量為總水體的50％。表5離體保存后恢復(fù)的銅藻和保存前銅藻生長(zhǎng)30d的比較材料比生長(zhǎng)速率長(zhǎng)度(cm)保存前2.43±0.0525.11±1.03保存后2.41±0.1624.89±1.77保存材料經(jīng)培養(yǎng)后，生長(zhǎng)旺盛，顏色正常，經(jīng)生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定顯示保存后銅藻的生長(zhǎng)沒有因長(zhǎng)期保存而受到不良影響。經(jīng)過約15～20天的培養(yǎng)，藻體即可長(zhǎng)至20厘米以上，即可用于后續(xù)育苗使用。當(dāng)前第1頁12