本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種涉及蘋(píng)果砧木初代培養(yǎng)防褐變的方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用階段，廣泛應(yīng)用于花卉、果樹(shù)苗木的大規(guī)模離體快繁。植物組培脫毒快繁在人工控制條件下一年四季生產(chǎn)，并可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量組培脫毒苗木。但一些優(yōu)良的蘋(píng)果砧木組培苗由于在組培初代培養(yǎng)過(guò)程中極易發(fā)生褐變，使得初代培養(yǎng)成活率極低，從而限制了蘋(píng)果優(yōu)良砧木組培苗的大量繁殖和生產(chǎn)，制約了蘋(píng)果優(yōu)良砧木規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中蘋(píng)果優(yōu)良砧木初代培養(yǎng)易褐變，且引種困難，限制了蘋(píng)果優(yōu)良砧木的大量繁殖和生產(chǎn)，制約了蘋(píng)果優(yōu)良砧木規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和推廣的問(wèn)題，提供的一種蘋(píng)果優(yōu)良砧木組培初代培養(yǎng)防褐變方法。該方法大幅度降低了蘋(píng)果優(yōu)良砧木組培初代培養(yǎng)中出現(xiàn)的褐變問(wèn)題，提高了初代培養(yǎng)成活率。

為解決本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案：

一種蘋(píng)果砧木組培初代培養(yǎng)防褐變的方法，具體步驟如下：

a、初代培養(yǎng)材料的剪?。?-6月份，選連續(xù)晴天的第3或第4天的早晨，選取蘋(píng)果砧木1-2年生、健壯的春梢頂芽和頂芽下面的第一側(cè)芽，切取1.2-1.5 cm長(zhǎng)的帶芽莖段，剪去葉子，放入盛有無(wú)菌水的密閉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，備用；

b、材料的清洗和殺菌：將帶芽莖段在2‰的84消毒液中浸泡5-10分鐘后在流水下沖洗2-5 min，放入洗潔精稀釋液中清洗5-10 min，后放入脫脂紗布在流水中沖洗下沖洗1.5-2 h，控干水分后裝入干凈的燒杯，在超凈工作臺(tái)上用酒精浸泡20-22ms后無(wú)菌水沖洗2-3次，然后在汞溶液中處理4-5min，處理時(shí)不斷攪動(dòng)使藥液均勻浸到處理材料表面，處理完成后移到無(wú)菌水中沖洗4-5次，然后在無(wú)菌培養(yǎng)皿中切0.4-0.5cm帶芽莖段，將做好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶中，每瓶25-30ml，滅菌，每瓶接2個(gè)芽，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)；

c、培養(yǎng)室溫濕度管理：移入培養(yǎng)室的初代培養(yǎng)瓶苗先進(jìn)行暗培養(yǎng)，用遮光布遮光，溫度21-23℃，濕度70％-75％，暗培養(yǎng)5-7天后去掉遮光布，在1500-1800Lx的光照下培養(yǎng)，溫度21-23℃，新芽萌發(fā)長(zhǎng)到0.5-0.8cm時(shí)剪取新芽0.4-0.6cm轉(zhuǎn)接，每瓶接2個(gè)芽，轉(zhuǎn)接后光照增加到2200-2500Lx，溫度21-23℃，20-25天后等新芽基部長(zhǎng)出從生芽時(shí)進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)繁轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。

所述步驟b中防褐變培養(yǎng)基的配方為：MS+BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VC80mg/L+白砂糖30g/L+瓊脂4.5g/L,pH為5.8。

所述步驟b中滅菌為將做好的培養(yǎng)基放置高壓鍋中在137-140MPa大氣壓下滅菌20-25分鐘，取出放置2-3天接種。

所述步驟b中每個(gè)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基為每瓶25-30ml。

所述步驟a中用消過(guò)毒的手術(shù)刀片切取1.2-1.5 cm長(zhǎng)的帶芽莖段。

所述步驟b中洗潔精稀釋液為1L水加入2-3ml洗潔精。

所述步驟b中流水的流速均為0.66-0.7米/秒。

所述步驟b中酒精的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75％。

所述步驟b中汞溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％。

本發(fā)明提供的一種蘋(píng)果砧木初代培養(yǎng)防褐變方法,大幅度降低蘋(píng)果優(yōu)良砧木初代培養(yǎng)中出現(xiàn)的褐變問(wèn)題，可使蘋(píng)果砧木初代培養(yǎng)的褐變率減少到5%以下，同時(shí)提高了初代培養(yǎng)成活率,使成活率提高到90%，且操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本降低，出苗率提高，短期內(nèi)可獲得大量材料，在生產(chǎn)上體現(xiàn)為直接的經(jīng)濟(jì)效益。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種蘋(píng)果砧木組培初代培養(yǎng)防褐變的方法，包括初代培養(yǎng)材料的剪取、材料的清洗、殺菌、防褐變培養(yǎng)基的配置、培養(yǎng)室溫濕度管理、轉(zhuǎn)接等方法，具體步驟如下：

1、初代培養(yǎng)材料的剪取5-6月份，選連續(xù)晴天的第3的早晨，選取蘋(píng)果砧木1年生、健壯的春梢頂芽和頂芽下面的第一側(cè)芽，用消過(guò)毒的手術(shù)刀片切取1.5 cm長(zhǎng)的帶芽莖段，剪去葉子，放入盛有無(wú)菌水的密閉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，備用；

2、材料的清洗和殺菌：將帶芽莖段在2‰的84消毒液中浸泡5分鐘后在流速為0.66米/秒的流水中沖洗2 min，放入洗潔精稀釋液中清洗5 min，其中洗潔精稀釋液為1L水加入2ml洗潔精，然后放入脫脂紗布在流速為0.66米/秒的流水下沖洗3h，控干水分后裝入干凈的燒杯，在超凈工作臺(tái)上用濃度為75％的酒精浸泡20ms，無(wú)菌水沖洗2次，然后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的汞溶液中處理5min，處理時(shí)不斷攪動(dòng)使藥液均勻浸到處理材料表面，處理完成后移到無(wú)菌水中沖洗4次，然后在無(wú)菌培養(yǎng)皿中切0.5cm帶芽莖段，接入抗褐變培養(yǎng)基，每瓶接2個(gè)芽，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)。

3、防褐變培養(yǎng)基的配置

a、培養(yǎng)基配方：MS+BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VC80mg/L+白砂糖30g/L+瓊脂4.5g/L,pH為5.8。

b、培養(yǎng)基分裝：將做好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶中，每瓶25ml

c、滅菌：做好的培養(yǎng)基放置高壓鍋中在137MPa大氣壓下滅菌20分鐘，取出放置2天接種。

4、培養(yǎng)室溫濕度管理：移入培養(yǎng)室的初代培養(yǎng)瓶苗先進(jìn)行暗培養(yǎng)，用黑色棉布遮光，溫度23℃，濕度72％，暗培養(yǎng)5天后去掉棉布，再在1500Lx的光照下培養(yǎng)，溫濕度不變，等新芽萌發(fā)長(zhǎng)到0.5cm時(shí)剪取新芽0.4cm轉(zhuǎn)接，每瓶接2個(gè)芽，二次轉(zhuǎn)接后光照增加到2500Lx，溫濕度不變，20天后等新芽基部長(zhǎng)出從生芽時(shí)進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)繁轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。

實(shí)施例2

一種蘋(píng)果砧木組培初代培養(yǎng)防褐變的方法，包括初代培養(yǎng)材料的剪取、材料的清洗、殺菌、防褐變培養(yǎng)基的配置、培養(yǎng)室溫濕度管理、轉(zhuǎn)接等方法，具體步驟如下：

1、初代培養(yǎng)材料的剪?。?～6月份，選連續(xù)晴天的第4的早晨，選取蘋(píng)果砧木2年生、健壯的春梢頂芽和頂芽下面的第一側(cè)芽，用消過(guò)毒的手術(shù)刀片切取1.5 cm長(zhǎng)的帶芽莖段，剪去葉子，放入盛有無(wú)菌水的密閉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室備用；

2、材料的清洗和殺菌：將帶芽莖段在2‰的84消毒液中浸泡5分鐘后在流速為0.7米/秒的流水中沖洗5 min，放入洗潔精稀釋液中清洗10 min，洗潔精稀釋液為1L水加入2ml洗潔精，然后放入脫脂紗布在流速為0.66米/秒的流水下沖洗2h，控干水分后裝入干凈的燒杯，在超凈工作臺(tái)上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75％的酒精浸泡22ms，無(wú)菌水沖洗3次，然后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的汞溶液中處理4min，處理時(shí)不斷攪動(dòng)使藥液均勻浸到處理材料表面，處理完成后移到無(wú)菌水中沖洗5次，然后在無(wú)菌培養(yǎng)皿中切0.4cm帶芽莖段，接入抗褐變培養(yǎng)基，每瓶接2個(gè)芽，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)。

3、防褐變培養(yǎng)基的配置

a、培養(yǎng)基配方：MS+BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VC80mg/L+白砂糖30g/L+瓊脂4.5g/L，pH為5.8。

b、培養(yǎng)基分裝：將做好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶中，每瓶30ml

c、滅菌：做好的培養(yǎng)基放置高壓鍋中在137Pa大氣壓下滅菌20分鐘，取出放置3天接種。

4、培養(yǎng)室溫濕度管理：移入培養(yǎng)室的初代培養(yǎng)瓶苗先進(jìn)行暗培養(yǎng)，用黑色棉布遮光，溫度23℃，濕度75％，暗培養(yǎng)5天后去掉棉布，再在1500Lx的光照下培養(yǎng)，溫濕度不變，等新芽萌發(fā)長(zhǎng)到0.8cm時(shí)剪取新芽0.4cm轉(zhuǎn)接，每瓶接2個(gè)芽，二次轉(zhuǎn)接后光照增加到2200Lx，溫濕度不變， 22天后等新芽基部長(zhǎng)出從生芽時(shí)進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)繁轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。

實(shí)施例3

一種蘋(píng)果砧木組培初代培養(yǎng)防褐變的方法，包括初代培養(yǎng)材料的剪取、材料的清洗、殺菌、防褐變培養(yǎng)基的配置、培養(yǎng)室溫濕度管理、轉(zhuǎn)接等方法，具體步驟如下：

1、初代培養(yǎng)材料的剪?。?～6月份，選連續(xù)晴天的第4的早晨，選取蘋(píng)果砧木2年生、健壯的春梢頂芽和頂芽下面的第一側(cè)芽，用消過(guò)毒的手術(shù)刀片切取1.2cm長(zhǎng)的帶芽莖段，剪去葉子，放入盛有無(wú)菌水的密閉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室備用；

2、材料的清洗和殺菌：將將帶芽莖段在2‰的84消毒液中浸泡10分鐘后在流速為0.66米/秒的流水中沖洗2 min，放入洗潔精濃稀釋液中清洗8 min，洗潔精稀釋液為1L水加入2ml洗潔精，然后放入脫脂紗布在流速為0.7米/秒的流水下沖洗2h，控干水分后裝入干凈的燒杯，在超凈工作臺(tái)上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75％的酒精浸泡20ms，無(wú)菌水沖洗2次，然后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的汞溶液中處理5min，處理時(shí)不斷攪動(dòng)使藥液均勻浸到處理材料表面，處理完成后再移到無(wú)菌水中，沖洗5次，然后在無(wú)菌培養(yǎng)皿中切0.5cm帶芽莖段，接入抗褐變培養(yǎng)基，每瓶接2個(gè)芽，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)。

3、防褐變培養(yǎng)基的配置

a、培養(yǎng)基配方：MS+BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VC80mg/L+白砂糖30g/L+瓊脂4.5g/L，pH為5.8。

b、培養(yǎng)基分裝：將做好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶中，每瓶28ml

c、滅菌：做好的培養(yǎng)基放置高壓鍋中在140MPa大氣壓下滅菌25分鐘，取出放置3天接種。

4、培養(yǎng)室溫濕度管理：移入培養(yǎng)室的初代培養(yǎng)瓶苗先進(jìn)行暗培養(yǎng)，用黑色棉布遮光，溫度21℃，濕度70％，暗培養(yǎng)6天后去掉棉布，再在1800Lx的光照下培養(yǎng)，溫濕度不變，等新芽萌發(fā)長(zhǎng)到0.6cm時(shí)剪取新芽0.5cm轉(zhuǎn)接，每瓶接2個(gè)芽，二次轉(zhuǎn)接后光照增加到2500Lx，溫濕度不變，25天后等新芽基部長(zhǎng)出大量從生芽時(shí)進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)繁轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。