本發(fā)明屬于甘草組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種篩選促進(jìn)甘草愈傷組織增殖培養(yǎng)條件的方法。
背景技術(shù)：
甘草，（學(xué)名：Glycyrrhiza uralensis Fisch）別名：國(guó)老、甜草、烏拉爾甘草、甜根子。豆科、甘草屬多年生草本，根與根狀莖粗壯，是一種補(bǔ)益中草藥。對(duì)人體很好的一種藥，藥用部位是根及根莖，藥材性狀根呈圓柱形，長(zhǎng)25～100厘米，直徑0.6～3.5厘米。外皮松緊不一，表面紅棕色或灰棕色。根莖呈圓柱形，表面有芽痕，斷面中部有髓。氣微，味甜而特殊。功能主治清熱解毒、祛痰止咳、脘腹等。喜陰暗潮濕，日照長(zhǎng)氣溫低的干燥氣候。甘草多生長(zhǎng)在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠邊緣和黃土丘陵地帶。根和根狀莖供藥用。傳統(tǒng)的甘草獲取方法是采挖葉生植物資源，造成水土流失和嚴(yán)重土壤沙漠化。另外，甘草種子主要來(lái)自野生甘草，其品種混雜，種子稀缺，發(fā)芽率極低，野生資源不適應(yīng)規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的需要。同時(shí)由于人們破壞性地對(duì)葉生甘草采挖，使野生植物幾乎滅絕，對(duì)甘草的保護(hù)性利用迫在眉睫，但由于甘草種植發(fā)芽率不高和人們對(duì)其此生代謝物的需求，從而使甘草的組織培養(yǎng)對(duì)研究和生產(chǎn)具有重要作用，然而現(xiàn)有的甘草培養(yǎng)基中極少有通過(guò)增強(qiáng)光源調(diào)節(jié)甘草生長(zhǎng)的技術(shù)。
綠色植物是一部以光為動(dòng)力的機(jī)器，許多生理生化過(guò)程受光的調(diào)節(jié)控制，形態(tài)構(gòu)建受光作用的誘導(dǎo)。不同光質(zhì)對(duì)植物的光形態(tài)建成、生理生化過(guò)程的調(diào)節(jié)已有報(bào)道。在日光燈光照條件下，輔助不同光質(zhì)的光照，對(duì)甘草組培誘導(dǎo)生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)整，提高甘草組織培養(yǎng)的生產(chǎn)效率。
鈰是周期系第ΙΙΙ族副族鑭系元素，一種稀土元素。原子序數(shù)58。穩(wěn)定同位素：136、138、140、142?；疑饘?，有展性。密度：正方晶體6.9，立方晶體6.7。熔點(diǎn)799℃，沸點(diǎn)3426℃。鈰是一種銀灰色的活潑金屬，粉末在空氣中易自燃，易溶于酸。鈰的名稱(chēng)來(lái)源于小行星谷神星的英文名。鈰在地殼中的含量約0.0046%，是稀土元素中豐度最高的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于現(xiàn)有技術(shù)存在上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種篩選促進(jìn)甘草愈傷組織增殖培養(yǎng)條件的方法，通過(guò)使用單一變量法調(diào)整測(cè)試增強(qiáng)光源的波長(zhǎng)對(duì)甘草組織培養(yǎng)苗的生理影響，確定最適增強(qiáng)光源波長(zhǎng)，并根據(jù)不同波長(zhǎng)光源對(duì)甘草組培苗的影響，確定不同波長(zhǎng)光源出組合，并通過(guò)保持增強(qiáng)光源不變反向確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時(shí)引入組培苗的實(shí)際增殖系數(shù)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，更加適合商業(yè)工廠化生產(chǎn)。
一種篩選促進(jìn)甘草愈傷組織增殖培養(yǎng)條件的方法，其包括以下步驟：
步驟S10確定初步篩選范圍，檢索查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)比其他植物物種組培增殖過(guò)程中添加增強(qiáng)光源的種類(lèi)并確定光源波長(zhǎng)，初步篩選范圍；
步驟S20選擇外植體，選擇健康、生長(zhǎng)環(huán)境一致并且生長(zhǎng)狀態(tài)相似的甘草愈傷組織，將愈傷組織切割成0.5cm3大小的組織塊；
步驟S30對(duì)照培養(yǎng)，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加TDZ（噻苯?。┑臐舛葹?.06mg/L、NAA（萘乙酸）的濃度為2.5 mg/L、活性炭的濃度為0.15 mg/L、硝酸鈰的濃度為3g/L，維生素C的濃度為0.3mg/L，瓊脂粉的濃度為10g/L、白砂糖的濃度為7g/L，配制成測(cè)試用培養(yǎng)基，分別接種相同量的甘草愈傷組織，并進(jìn)行常規(guī)增殖組織培養(yǎng)作為對(duì)照組，在常規(guī)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上添加不同波段增強(qiáng)增強(qiáng)光源作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都設(shè)置多個(gè)平行組；
步驟S40記錄檢測(cè)參數(shù)，培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)每個(gè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的褐化的數(shù)量，并計(jì)算褐化率；
步驟S50生長(zhǎng)量計(jì)算，分別將相同實(shí)驗(yàn)組或者對(duì)照組的愈傷組織取出，用清水沖洗干凈，擦干表面水分并對(duì)愈傷組織進(jìn)行稱(chēng)重，記錄重量；
步驟S60計(jì)算評(píng)估因數(shù)，將愈傷組織培養(yǎng)后的重量減去褐化的重量，再除以培養(yǎng)前的重量，計(jì)算出實(shí)際增殖系數(shù)，將實(shí)際增殖系數(shù)減去褐化率得出評(píng)估因數(shù)，對(duì)比不同濃度梯度的評(píng)估因數(shù)，挑選出數(shù)值最大的評(píng)估因數(shù)對(duì)應(yīng)的增強(qiáng)光源波長(zhǎng)；
步驟S70縮小篩選范圍，使用步驟S60中挑選出的增強(qiáng)光源波長(zhǎng)范圍重復(fù)進(jìn)行步驟S10-S60縮小篩選范圍或者確定最適波長(zhǎng)范圍；
步驟S80反向篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用步驟S70確定的最適波長(zhǎng)范圍搭配不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重復(fù)步驟S40和步驟S50，并使用步驟S60的計(jì)算方法計(jì)算評(píng)估因數(shù)，確定最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
步驟S90不同波長(zhǎng)組合篩選，通過(guò)單一因數(shù)確定不同波長(zhǎng)對(duì)甘草愈傷組織增殖的生理參數(shù)影響，調(diào)整最適合波長(zhǎng)組合。
優(yōu)選地，所述的步驟S30中每個(gè)實(shí)驗(yàn)組或者對(duì)照組設(shè)置5-15個(gè)平行組。
優(yōu)選地，所述的步驟S70中重復(fù)的次數(shù)是2-3次。
優(yōu)選地，所述的步驟S80中不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、Nitsh培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基和Miller培養(yǎng)基。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
一種篩選促進(jìn)甘草愈傷組織增殖培養(yǎng)條件的方法，其包括以下步驟：
步驟S10確定初步篩選范圍，檢索查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)比其他植物物種組培增殖過(guò)程中添加增強(qiáng)光源的種類(lèi)并確定光源波長(zhǎng)，初步篩選范圍；
步驟S20選擇外植體，選擇健康、生長(zhǎng)環(huán)境一致并且生長(zhǎng)狀態(tài)相似的甘草愈傷組織，將愈傷組織切割成0.5cm3大小的組織塊；
步驟S30對(duì)照培養(yǎng)，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加TDZ（噻苯?。┑臐舛葹?.06mg/L、NAA（萘乙酸）的濃度為2.5 mg/L、活性炭的濃度為0.15 mg/L、硝酸鈰的濃度為3g/L，維生素C的濃度為0.3mg/L，瓊脂粉的濃度為10g/L、白砂糖的濃度為7g/L，配制成測(cè)試用培養(yǎng)基，分別接種相同量的甘草愈傷組織，并進(jìn)行常規(guī)增殖組織培養(yǎng)作為對(duì)照組，在常規(guī)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上添加不同波段增強(qiáng)增強(qiáng)光源作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都設(shè)置多個(gè)平行組；
步驟S40記錄檢測(cè)參數(shù)，培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)每個(gè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的褐化的數(shù)量，并計(jì)算褐化率；
步驟S50生長(zhǎng)量計(jì)算，分別將相同實(shí)驗(yàn)組或者對(duì)照組的愈傷組織取出，用清水沖洗干凈，擦干表面水分并對(duì)愈傷組織進(jìn)行稱(chēng)重，記錄重量；
步驟S60計(jì)算評(píng)估因數(shù)，將愈傷組織培養(yǎng)后的重量減去褐化的重量，再除以培養(yǎng)前的重量，計(jì)算出實(shí)際增殖系數(shù)，將實(shí)際增殖系數(shù)減去褐化率得出評(píng)估因數(shù)，對(duì)比不同濃度梯度的評(píng)估因數(shù)，挑選出數(shù)值最大的評(píng)估因數(shù)對(duì)應(yīng)的增強(qiáng)光源波長(zhǎng)；
步驟S70縮小篩選范圍，使用步驟S60中挑選出的增強(qiáng)光源波長(zhǎng)范圍重復(fù)進(jìn)行步驟S10-S60縮小篩選范圍或者確定最適波長(zhǎng)范圍；
步驟S80反向篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用步驟S70確定的最適波長(zhǎng)范圍搭配不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重復(fù)步驟S40和步驟S50，并使用步驟S60的計(jì)算方法計(jì)算評(píng)估因數(shù)，確定最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
步驟S90不同波長(zhǎng)組合篩選，通過(guò)單一因數(shù)確定不同波長(zhǎng)對(duì)甘草愈傷組織增殖的生理參數(shù)影響，調(diào)整最適合波長(zhǎng)組合。
作為優(yōu)選實(shí)施例，所述的步驟S30中每個(gè)實(shí)驗(yàn)組或者對(duì)照組設(shè)置10個(gè)平行組。
作為優(yōu)選實(shí)施例，所述的步驟S70中重復(fù)的次數(shù)是3次。
作為優(yōu)選實(shí)施例，所述的步驟S80中不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、Nitsh培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基和Miller培養(yǎng)基。
經(jīng)過(guò)篩選確定如下增強(qiáng)光源具有比更高的實(shí)際增殖系數(shù)：使用白光、藍(lán)光增強(qiáng)光源和綠光增強(qiáng)光源照射愈傷組織，綠色光源是波段為550nm-580nm的綠光，藍(lán)色光源是波段為450nm-470nm的藍(lán)光，光照時(shí)間為光照12小時(shí)/黑暗12小時(shí)。