一種篤斯越桔組培快繁的方法及其培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種篤斯越桔組培快繁的方法及其培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的用于獲得篤斯越桔再生植株的培養(yǎng)基，由以下成分組成：NH4NO3、Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、NaMoO4·2H2O、肌醇、維生素B1、煙酸、維生素B6、甘氨酸、Na2?EDTA、FeSO4·7H2O、吲哚丁酸、矮壯素、蔗糖和蒸餾水。針對篤斯越桔組培苗木細(xì)弱現(xiàn)象，本發(fā)明首次提出了將矮壯素加入培養(yǎng)基，配合植物激素，促進(jìn)篤斯越桔組培苗復(fù)壯的方法，該方法可以通過增強(qiáng)組培苗木質(zhì)化程度，增強(qiáng)其抗逆能力，以提高苗木移栽后的成活率。同時(shí)，本方法提出了用育苗袋輔助移栽，該方法使篤斯越桔組培苗的移栽成活率達(dá)到100％。
【專利說明】
一種篤斯越桔組培快繁的方法及其培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)，特別涉及一種篤斯越桔組培快繁的方法及其培養(yǎng) 基。
【背景技術(shù)】
[0002] 篤斯越桔（Vaccinium ul iginosum)，又名都柿、甸果等，是一種杜鵲花科 (Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)的可食用的有色衆(zhòng)果，其果實(shí)深藍(lán)，口感細(xì)膩，果香怡人。 研究表明，篤斯越桔具有抗氧化、抗衰老、抗癌、預(yù)防心血管疾病、保護(hù)視力等功效，具有極 佳的保健功效。在我國，篤斯越桔集中分布在大小興安嶺及長白山地區(qū)，其中大興安嶺地區(qū) 為其最大的天然分布區(qū)。調(diào)查顯示，大興安嶺地區(qū)篤斯越桔的天然分布面積有15萬公頃以 上，年儲(chǔ)量約2萬噸。但是，在利益的驅(qū)動(dòng)下，我國的野生篤斯越桔遭到了破壞式的開發(fā)。人 類往往以折枝擼葉的方式破壞性的采收篤斯越桔果實(shí)，對其自然生境造成了不可逆的損 傷。據(jù)報(bào)道，我國野生篤斯越桔已過早地出現(xiàn)了資源退化、種群面積縮小的現(xiàn)象，篤斯越桔 已可列入瀕危植物類群。因此，有必要采取措施，建立篤斯越桔資源保護(hù)體系。其中，可實(shí)施 性強(qiáng)、見效快的保護(hù)措施就是建立篤斯越桔資源回植項(xiàng)目，即人工培育篤斯越桔苗木，并將 其回植到資源遭到破壞的相應(yīng)原產(chǎn)區(qū)，以保證資源開發(fā)的可持續(xù)性，保護(hù)森林生態(tài)結(jié)構(gòu)。
[0003] 目前，已有研究報(bào)道篤斯越桔再生體系的建立，現(xiàn)有體系可以實(shí)現(xiàn)篤斯越桔的再 生。但是，由于篤斯越桔組培苗莖桿普遍纖細(xì)，且其瓶內(nèi)生根較為困難，生根耗時(shí)長(通常為 40-90天），且根較細(xì)弱。同時(shí)，篤斯越桔組培苗移栽相關(guān)研究較為欠缺，成活率較低。該現(xiàn)狀 無形增加了篤斯越桔育苗成本，極大地限制了篤斯越桔工廠化育苗的進(jìn)程，制約了篤斯越 桔資源保護(hù)成效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補(bǔ)以上領(lǐng)域的不足，本發(fā)明提供了一種篤斯越桔組培快繁的方法及其培養(yǎng) 基。
[0005] 本發(fā)明所提供的用于獲得篤斯越桔再生植株的培養(yǎng)基，由以下成分組成：
[0006] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN03、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H2〇、MnS〇4 · 4H2〇、ZnS〇4 · 7H2〇、 H3B03、CuS〇4 · 5H2〇、NaMo〇4 · 2H2〇、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2_EDTA、 FeS04 · 7H20、吲哚丁酸、矮壯素、蔗糖和蒸餾水；
[0007] 以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為：
[0008] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H2〇 0.684g/L、KN03 〇· 19g/L、KH2P〇4 〇· 17g/L、 MgS〇4.7H2〇 0.37g/L、MnS〇4.4H2〇 22.3mg/L、ZnS〇4.7H2〇 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H2〇 0.25mg/L、NaMo〇4.2H2〇 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 B1 0.1mg/L、煙酸 0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2_EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L、 吲噪丁酸〇 · lmg/L-0 · 5mg/L、矮壯素 Omg/L-lOmg/L和鹿糖20g/L。
[0009] 所述用于獲得篤斯越桔再生植株的培養(yǎng)基由以下成分組成：
[0010] NH4N〇3、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H2〇、MnS〇4 · 4H2〇、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20、吲哚丁酸、矮壯素、蔗糖和蒸餾水；
[0011]以上成分在所述用于獲得篤斯越桔再生植株的培養(yǎng)基中濃度分別為：
[0012] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0· 19g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 B1 0.1mg/L、煙酸 0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L、 吲噪丁酸〇 · 5mg/L、矮壯素5mg/L和鹿糖20g/L。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種用于獲得篤斯越桔再生植株的固體培養(yǎng)基，是由凝固劑和所 述用于獲得篤斯越桔再生植株的培養(yǎng)基配成的固體培養(yǎng)基。
[0014] 所述凝固劑在所述固體培養(yǎng)基中的濃度為9g/L;
[0015] 所述凝固劑為瓊脂。
[0016]所述培養(yǎng)基的pH值為5.4。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種獲得篤斯越桔再生植株的方法，包括如下步驟：
[0018] 將篤斯越桔再生苗接種到所述用于獲得篤斯越桔再生植株的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行 生根誘導(dǎo)，即得到篤斯越桔再生植株。
[0019] 所述方法還包括將所述篤斯越桔再生植株移栽至裝有栽培基質(zhì)苗盆中，用育苗袋 輔助移栽的步驟。
[0020] 所述育苗袋是上部帶有自封條，下部開口的透明、硬質(zhì)塑料口袋，其下部開口與苗 盆口徑大小一致；
[0021] 所述用育苗袋輔助移栽是用育苗袋套住苗盆，密封育苗袋上部的自封條，并用橡 皮筋扎住育苗袋下部，保證該栽培環(huán)境的密封性；
[0022]所述栽培基質(zhì)為體積比為3:1的草炭土:蛭石。
[0023]所述篤斯越桔再生苗是通過包括以下步驟的方法得到的：
[0024]用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)篤斯越桔無菌苗分化，培養(yǎng)得到篤斯越桔再生苗；
[0025] 所述分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成：
[0026] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和蒸餾水；
[0027] 以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為：
[0028] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0· 19g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 B1 0.1mg/L、煙酸 0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L、 玉米素 1 · Omg/L-2 · 5mg/L、吲噪丁酸 Omg/L-O · 5mg/L 和鹿糖 20g/L。
[0029] 所述分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成：
[0030] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和蒸餾水；
[0031] 以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為：
[0032] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0· 19g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 B1 0.1mg/L、煙酸 0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L、 玉米素1 · Omg/L、吲哚丁酸0 · lmg/L和蔗糖20g/L。
[0033] 通常矮壯素可外施以限制作物瘋長，有促進(jìn)坐果的功效。針對篤斯越桔苗木細(xì)弱 現(xiàn)象，本發(fā)明首次提出了將矮壯素加入培養(yǎng)基，配合植物激素，促進(jìn)篤斯越桔組培苗復(fù)壯的 方法，該方法可以通過增強(qiáng)組培苗木質(zhì)化程度，增強(qiáng)其抗逆能力，以提高苗木移栽后的成活 率。
[0034] 另外，由于篤斯越桔組培苗移栽初期，其根系及枝葉仍處于恢復(fù)、適應(yīng)期，其對外 界的防御力較弱，特別是水分保持能力較差。因此，有必要提供空氣濕度較高、空氣流動(dòng)較 少的穩(wěn)定環(huán)境以保證篤斯越桔組培苗移栽成活。介于上述背景，本發(fā)明提出了一種低成本、 可重復(fù)使用且操作方便的育苗袋的制作和使用（圖3)。該育苗袋可以保證篤斯越桔組培苗 移栽環(huán)境的氣流及濕度的穩(wěn)定，配合本發(fā)明提出的篤斯越桔瓶內(nèi)生根、壯苗方法，可使篤斯 越桔組培苗移栽成活率達(dá)100 %。
【附圖說明】
[0035] 圖1為不同培養(yǎng)基對篤斯越桔組培苗的分化誘導(dǎo)情況。
[0036]圖2為不同培養(yǎng)基對篤斯越桔組培苗的生根誘導(dǎo)情況；其中A為對照；B為添加 IBA 0· lmg/L ;C為添加 IBA 0.5mg/L;D為添加 IBA 0.5mg/L+矮壯素5mg/L。
[0037] 圖3為本發(fā)明提出的育苗袋及其育苗效果；其中，A為移栽后用育苗袋扣盆培養(yǎng);B 為培養(yǎng)2個(gè)月后的生長狀態(tài)。
[0038] 圖4為篤斯越桔組培苗移栽2個(gè)月后的生長情況;其中，A為未進(jìn)行瓶內(nèi)生根即覆膜 移栽;B為瓶內(nèi)生根后覆膜移栽;C為瓶內(nèi)生根后用育苗袋輔助移栽。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 儀器及試劑:超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾），IBA(吲噪丁酸，Beta-indolebutyric acid)，ZT(玉米素，Zeatin)、2,4D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)、TDZ(噻苯隆， Thidiazuron)、NAA(萘乙酉愛，1-Naphthaleneacetic acid)、6BA(6_Benzylaminopurine)、矮 壯素、瓊脂粉、蔗糖均購自北京科創(chuàng)欣達(dá)科技有限公司，其余未特別標(biāo)明的試劑都購自北京 化工公司。
[0040] 實(shí)驗(yàn)材料:篤斯越桔無菌苗。野生篤斯越桔采自大興安嶺地區(qū)，以其強(qiáng)壯枝條的當(dāng) 年生嫩莖為外植體，借助組織培養(yǎng)技術(shù)，誘導(dǎo)腋芽再生，獲得無菌的組培苗用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 該無菌苗可從中國科學(xué)院植物研究所花卉生理與遺傳育種研究組獲得。記載過篤斯越桔 (大興安嶺區(qū)野生種)的非專利文獻(xiàn)是:顧姻，賀善安，於虹，王傳永，吳文龍(2001)藍(lán)漿果與 蔓越桔(第1版）.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.PP. 25-33，142-187。
[0041] 實(shí)施例1、篤斯越桔高效組培快繁及移栽的方法
[0042] -、配制篤斯越桔誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基
[0043] 1、配制改良WPMo基礎(chǔ)培養(yǎng)基：
[0044] 量取50mL改良WPM大量元素母液、5mL改良WPM微量元素母液、5mL改良WPM有機(jī)物母 液、5mL改良WPM鐵鹽母液、20mg蔗糖，混勻，用硫酸或者磷酸調(diào)節(jié)pH至5.4，并定容終體積至 1000ml;添加9g瓊脂，121°C高溫滅菌20min，放涼至65°C左右，備用。
[0045] 本實(shí)施例所配制的改良WPM母液配方如表1所示：
[0046] 表1本實(shí)施例所配制的改良WPM母液配方
[0049] 備注:所有的試劑配好后都置于4°C冰箱保存。
[0050] 2、配制用于篤斯越桔分化誘導(dǎo)和生根誘導(dǎo)的激素
[0051] 分別稱取 10mg ZT(玉米素，Zeatin)、IBA(吲噪丁酸，Beta-indolebutyric acid)、 2，4D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)、TDZ(噻苯隆，Thidiazuron)、NAA(萘乙酸，1-Naphthaleneacetic acid)、6BA(6_Benzylaminopurine)粉末，并分別用純乙醇定容至 10ml;稱取10mg矮壯素粉末，用蒸餾水定容至10ml;將上述激素在超凈臺(tái)中，用0.22μηι濾頭 過濾滅菌。滅菌后的激素置于4°C貯存，備用。此后的所有操作均在超凈臺(tái)中進(jìn)行，所用工具 均為121°C，滅菌20min后的物品。
[0052] 3、制備用于篤斯越桔分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)基
[0053] (1)在超凈臺(tái)中將滅過菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基改良WPMo混勻后分裝至組培瓶中，每瓶約 50ml ；
[0054] (2)依照表2,向分裝好的培養(yǎng)基中加入相應(yīng)激素，混勻后，靜置，待其凝固后使用； 每種培養(yǎng)基制備至少3瓶；
[0055] 表2本實(shí)施例所配制的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方
[0058] 改良WPMo基礎(chǔ)培養(yǎng)基由以下成分組成：
[0059] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20；
[0060] 以上成分在改良WPMo基礎(chǔ)培養(yǎng)基中濃度分別為：
[0061] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0· 19g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 B1 0.1mg/L、煙酸 0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4*7H20 27.8mg/L。 [0062] 4、制備用于篤斯越桔生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基
[0063] (1)在超凈臺(tái)中將滅過菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基改良WPMo混勻后分裝至組培瓶中，每瓶約 50ml ；
[0064] (2)依照表3,向分裝好的培養(yǎng)基中加入相應(yīng)激素，混勻后，靜置，待其凝固后使用； 每種培養(yǎng)基制備至少3瓶；
[0065] 表3本實(shí)施例所配制的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方
[0068] 改良WPMo基礎(chǔ)培養(yǎng)基由以下成分組成：
[0069] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20；
[0070] 以上成分在改良WPMo基礎(chǔ)培養(yǎng)基中濃度分別為：
[0071] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0·19g/L、KH2P〇4 0·17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 B1 0.1mg/L、煙酸 0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4*7H20 27.8mg/L。
[0072] 二、篤斯越桔的分化誘導(dǎo)
[0073] (1)待分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基冷卻、凝固后，切取篤斯越桔無菌苗，分別接入表2的篤斯越 桔分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
[0074] (2)將組培苗放置于20(±5)°(：，120011，光照周期1611/(1條件下培養(yǎng)30-40(1，誘導(dǎo) 其分化，得到篤斯越桔再生組培苗。
[0075]三、篤斯越桔組培苗的生根培養(yǎng)
[0076] (1)用鋒利的剪刀將高度約3-4cm的篤斯越桔再生組培苗剪下，豎直插入篤斯越桔 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接入30株；
[0077] (2)將接種后的組培瓶置于20(±5)°(：，120011，光照周期1611/(1條件下培養(yǎng)30-40(1 后統(tǒng)計(jì)并分析數(shù)據(jù)。
[0078]四、篤斯越桔生根苗的移栽
[0079] (1)取出已生根的篤斯越桔組培苗，用流水洗凈其根部的培養(yǎng)基(注意該清洗步驟 需輕緩操作，以免洗斷根）；
[0080] (2)將洗凈的篤斯越桔生根苗移栽至栽培基質(zhì)為草炭土:蛭石= 3:1的苗盆中（提 前將栽培基質(zhì)澆透水），按表4進(jìn)行相應(yīng)的覆膜或套育苗袋處理，每種處理至少包含100株 苗;將定植后的苗木置于20(±5)°(：，120011，光照周期1611/(1條件下培養(yǎng)30-40(1后統(tǒng)計(jì)并分 析數(shù)據(jù)。
[0081 ]表4本實(shí)施例所進(jìn)行的移栽管護(hù)方法
[0083]五、結(jié)果
[0084] (1)由于篤斯越桔葉片薄且小，其在操作過程中很容易褐化、干枯，因此相比于葉 片，篤斯越桔的嫩莖更適于用作外植體，誘導(dǎo)不定芽再生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1，表5)表明，對于篤 斯越桔的分化誘導(dǎo)，TDZ及玉米素(ZT)具有重要作用，而2,4D無效。向含有2.0mg/L TDZ的培 養(yǎng)基中添加低濃度的NAA或者IBA可有效促進(jìn)篤斯越桔分化。本發(fā)明表明同時(shí)加有TDZ及IBA 的培養(yǎng)基DSF1能夠促進(jìn)培養(yǎng)物高效分化，其中篤斯越桔外植體的切口處及任何與培養(yǎng)基接 觸的葉尖部分均有遍布紅色芽點(diǎn)的愈傷組織生成，且外植體的腋芽處也萌生了大量再生 芽。同時(shí)加有TDZ及NAA的培養(yǎng)基DSF2也可誘導(dǎo)大量愈傷組織生成，但是該愈傷大多僅在切 口處產(chǎn)生，分化再生效果不及DSF1。但DSF1及DSF2培養(yǎng)基中的再生苗都存在生長緩慢，伸長 難的問題，需要及時(shí)更換能夠促進(jìn)苗木伸長的繼代培養(yǎng)基。而對于枸杞等植物具有較好分 化誘導(dǎo)效果的2,4D則不適用于篤斯越桔，接于該培養(yǎng)基上的外植體無法分化產(chǎn)生再生芽， 也無法萌生腋芽，多數(shù)逐漸老化、干枯死亡。
[0085]表5篤斯越桔分化誘導(dǎo)結(jié)果
[0086]
[0087] ZT具有高效的分化誘導(dǎo)作用，常被用于難分化的植物的分化誘導(dǎo)。本研究表明隨 著ΖΤ濃度從0.5-2.5mg/L變化，篤斯越桔的分化率也隨之增高。較低濃度的玉米素（彡 〇. 5mg/L)能夠很好地促進(jìn)外植體腋芽萌發(fā)，且其伸長速度較快，外植體與培養(yǎng)基接觸處可 形成少量愈傷組織;較高濃度的玉米素（1 -2.5mg/L)能夠刺激外植體高水平地分化，在ZT終 濃度為2.5mg/L的培養(yǎng)基中，延長培養(yǎng)時(shí)間，篤斯越桔的分化率可超100。但是，隨著分化水 平的提高，分化苗出現(xiàn)玻璃化的幾率也在增加，且高濃度玉米素分化得到的組培苗莖桿過 于纖細(xì)，不易移栽成活。因此，l.〇mg/L的玉米素是誘導(dǎo)篤斯越桔分化的最佳濃度，且向其中 添加低濃度的IBA(0.1 -0.5mg/L)有一定的壯苗作用，可減少苗木纖細(xì)程度，但高濃度的IBA 會(huì)抑制外植體分化及伸長。另外，與加有TDZ的培養(yǎng)基相比，加有ZT的培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)篤斯 越桔高效分化產(chǎn)生大量再生芽，且該再生芽可同時(shí)快速伸長。因此加有ZT的培養(yǎng)基可同時(shí) 用以繼代培養(yǎng)，減少培養(yǎng)基配制工作的繁復(fù)度，縮短篤斯越桔組培育苗周期。綜上，添加有 ZT 1 .Omg/L及IBA 0. lmg/L的改良WPMo培養(yǎng)基（即培養(yǎng)基DSF9)為篤斯越桔最佳分化誘導(dǎo)培 養(yǎng)基。
[0088] (2)低濃度的IBA(0.1-0.5mg/L)能夠有效促進(jìn)篤斯越桔組培苗進(jìn)行瓶內(nèi)生根，高 濃度的IBA(1.0-2.0mg/L)對其生根具有明顯抑制作用，且IBA濃度越高，抑制作用越明顯 (圖2,表6)。此外，由于篤斯越桔組培苗通常較為纖細(xì)，抗逆水平較差，為增加其移栽時(shí)的成 活率，本研究在其生根培養(yǎng)基中添加了一定劑量的矮壯素，輔助壯苗，減少苗木瘋長，促進(jìn) 其莖桿粗壯。結(jié)果表明在IBA濃度水平較低時(shí)(O.lmg/L)，同時(shí)添加矮壯素會(huì)顯著抑制生根， 使生根率降低了50 %以上;在IBA濃度水平較高時(shí)（1. Omg/L)，同時(shí)添加矮壯素的抑制效果 則不會(huì)過于明顯；而在IBA水平適中（0.5mg/L)時(shí)，添加低劑量的矮壯素可以促進(jìn)生根，且能 夠有效促進(jìn)組培苗木質(zhì)化程度的增加。因此本研究篩選出改良WPMo基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加 IBA 0.5mg/L+矮壯素5mg/L為其最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SG8)，生根率為81.47 ± 3.48 %。
[0089]表6篤斯越桔組培苗生根誘導(dǎo)結(jié)果
[0091] (3)本研究以未進(jìn)行瓶內(nèi)生根、壯苗的篤斯越桔組培苗直接進(jìn)行移栽的移栽成活 率作為對照，分別對比瓶內(nèi)生根后覆膜移栽和用育苗袋（圖3)輔助移栽的移栽效果。移栽30 天后統(tǒng)計(jì)成活率，結(jié)果（圖4)表明，未進(jìn)行瓶內(nèi)生根、壯苗的篤斯越桔組培苗其移栽成活率 可達(dá)69.37±4.95%，瓶內(nèi)生根后覆膜移栽的組培苗成活率為73.79±3.00%，而用育苗袋 輔助移栽的苗木成活率可達(dá)100%。
[0092] 值得注意的是，移栽60天后再次觀察苗木生長狀況，發(fā)現(xiàn)未進(jìn)行瓶內(nèi)生根的組培 苗其成活率下降為54.89±4.01%，比移栽后1各月的數(shù)據(jù)下降了近15%，且植株高度變化 很少，幾乎未增加，但瓶內(nèi)生根后的組培苗表現(xiàn)為穩(wěn)定生長。同時(shí)，本研究提出的用于輔助 移栽的育苗袋可以在很大程度上維持組培苗生長環(huán)境的穩(wěn)定性，包括空氣濕度、溫度及空 氣流動(dòng)性，這有利于組培苗出瓶后逐漸適應(yīng)外界生長環(huán)境，提供了較好的過渡空間，極大地 提高了苗木成活率，且植株生長速度較快。本研究中，用所述育苗袋輔助移栽法移栽了 150 余株篤斯越桔組培苗，均已成活，且長勢喜人。
[0093]結(jié)果表明，本發(fā)明提出的篤斯越桔分化培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)組培苗高效分化，且本發(fā) 明提出的在培養(yǎng)基中添加矮壯素及IBA的篤斯越桔組培苗瓶內(nèi)生根方法在促進(jìn)篤斯越桔瓶 內(nèi)生根的同時(shí)（生根率可達(dá)80%以上），可以實(shí)現(xiàn)壯苗，大幅提高篤斯越桔組培苗的木質(zhì)化 程度，能夠有效增加篤斯越桔組培苗移栽時(shí)的抗逆能力，且該方法操作簡單，應(yīng)用性強(qiáng)。同 時(shí)，本發(fā)明方法提出了育苗袋輔助組培苗移栽的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)篤斯越桔組培苗 100 %的移栽成活率，若用于工廠化育苗，可大幅提高企業(yè)成苗率，減少企業(yè)成本，具有好的 應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，該育苗袋設(shè)計(jì)簡單，操作方便，且可以重復(fù)利用。此外，該育苗袋適用于各 種形狀的苗盆器具，也可以用于其他珍稀材料的培育，具有較好的推廣價(jià)值。概括而言，本 發(fā)明將篤斯越桔組培苗的出苗移栽周期從60d以上縮短至30-40d(從生根培養(yǎng)算起），且在 誘導(dǎo)組培苗生根的同時(shí)完成了壯苗過程，配合使用育苗袋使得篤斯越桔組培苗移栽成活率 提高至100%，所以，本方法對于篤斯越桔工廠化育苗及其它組培苗木細(xì)弱、生根困難及移 栽難活等植物的培育具有重要意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于獲得篤斯越桔再生植株的培養(yǎng)基，由以下成分組成： NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7Η20、Η3Β〇3、 CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、FeS〇4 · 7H20、吲哚丁酸、矮壯素、蔗糖和蒸餾水； 以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為： NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2.4H2〇 0.684g/L、KN03 (hl9g/L、KH2P〇4 0.17g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4*4H20 22.3mg/L、ZnS〇4*7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS〇4*5H20 0.25mg/L、NaMo〇4· 2H2O 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 BI 0.1mg/L、煙酸0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4*7H20 27.8mg/L、吲哚丁酸O.lmg/ L-O · 5mg/L、矮壯素 Omg/L-lOmg/L 和鹿糖 20g/L。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于獲得篤斯越桔再生植株的培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng) 基由以下成分組成： NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7Η20、Η3Β〇3、 CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、FeS04 · 7H20、吲哚丁酸、矮壯素、蔗糖和蒸餾水； 以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為： NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2.4H2〇 0.684g/L、KN03 (hl9g/L、KH2P〇4 0.17g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4*4H20 22.3mg/L、ZnS〇4*7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS〇4*5H20 0.25mg/L、NaMo〇4· 2H2O 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 BI 0.1mg/L、煙酸0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H20 27.8mg/L、吲哚丁酸0.5mg/ L、矮壯素5mg/L和鹿糖20g/L。3. -種用于獲得篤斯越桔再生植株的固體培養(yǎng)基，是由凝固劑和權(quán)利要求1或2所述的 培養(yǎng)基配成的固體培養(yǎng)基。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于： 所述凝固劑在所述固體培養(yǎng)基中的濃度為9g/L; 所述凝固劑為瓊脂。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于： 所述培養(yǎng)基的pH值為5.4。6. -種獲得篤斯越桔再生植株的方法，包括如下步驟： 將篤斯越桔再生苗接種到權(quán)利要求3-5中任一所述的培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)，即得到 篤斯越桔再生植株。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于： 所述方法還包括將所述篤斯越桔再生植株移栽至裝有栽培基質(zhì)苗盆中，用育苗袋輔助 移栽的步驟。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于： 所述育苗袋是上部帶有自封條，下部開口的透明、硬質(zhì)塑料口袋，其下部開口與苗盆口 徑大小一致； 所述用育苗袋輔助移栽是用育苗袋套住苗盆，密封育苗袋上部的自封條，并用橡皮筋 扎住育苗袋下部，保證該栽培環(huán)境的密封性； 所述栽培基質(zhì)為體積比為3:1的草炭土:蛭石。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于： 所述篤斯越桔再生苗是通過包括以下步驟的方法得到的： 用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)篤斯越桔無菌苗分化，培養(yǎng)得到篤斯越桔再生苗； 所述分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成： NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7Η20、Η3Β〇3、 CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、FeS〇4 · 7H20、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和蒸餾水； 以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為： NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2.4H2〇 0.684g/L、KN03 (hl9g/L、KH2P〇4 0.17g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4*4H20 22.3mg/L、ZnS〇4*7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS〇4*5H20 0.25mg/L、NaMo〇4· 2H2O 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 BI 0.1mg/L、煙酸0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H20 27.8mg/L、玉米素 1.0mg/L-2 · 5mg/L、吲噪丁酸 Omg/L-O · 5mg/L 和鹿糖 20g/L。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于： 所述分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成： NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7Η20、Η3Β〇3、 CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、維生素 Bl、煙酸、維生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、FeS〇4 · 7H20、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和蒸餾水； 以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為： NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2.4H2〇 0.684g/L、KN03 (hl9g/L、KH2P〇4 0.17g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4*4H20 22.3mg/L、ZnS〇4*7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS〇4*5H20 0.25mg/L、NaMo〇4· 2H2O 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、維生素 BI O.lmg/L、煙酸0.5mg/L、維生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H20 27.8mg/L、玉米素 1.0mg/L、 吲哚丁酸〇. lmg/L和蔗糖20g/L。
【文檔編號】A01H4/00GK105900843SQ201610306073
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】蘇上, 馮成庸, 王亮生
【申請人】中國科學(xué)院植物研究所