利用龍眼鐵氧還蛋白基因轉化蘭科植物提高抗病力的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用龍眼鐵氧還蛋白基因轉化蘭科植物提高抗病力的方法,屬于基因工程【技術領域】。利用轉基因技術將龍眼鐵氧還蛋白基因Dlfd3(登錄號:JF733784)導入蘭科植物文心蘭,所獲轉化植株表現更高的移栽成活率和對抗病害的能力。與野生型植株相比,轉基因植株抵抗軟腐病能力提高,由高感軟腐病(Di=100)提升為中抗軟腐病(Di=27.5),移栽成活率由79.3%提高至95.7%,均達極顯著差異水平。
【專利說明】利用龍眼鐵氧還蛋白基因轉化蘭科植物提高抗病力的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】,涉及一種利用龍眼鐵氧還蛋白基因轉化蘭科植物提高抗病力的方法,具體涉及龍眼鐵氧還蛋白基因的應用及蘭花育種。
【背景技術】
[0002]文心蘭又名舞女蘭、金蝶蘭、瘤瓣蘭等,是重要的盆切花經濟栽培品種。文心蘭易患軟腐病(Soft rot),在組培苗的移栽階段,軟腐病更能帶來毀來性的打擊。目前,該病沒有特別有效的防治方法,因此選育抗軟腐病文心蘭品種的是文心蘭育種的重要課題。文心蘭可以進行廣泛的屬內雜交和屬間雜交,但無論屬內雜交還是屬間雜交其親和力都差,在自然條件下結果較為罕見,難以利用傳統(tǒng)的育種方法改變某些品種的單一性狀,因而利用轉基因技術快速提升文心蘭經濟栽培性狀成為文心蘭育種的重要手段。
[0003]鐵氧還蛋白基因(ferredoxin, fd)基因作為一個大的基因家族在植物中普遍存在,植物FD蛋白多為[2Fe-2S]類型,在光合作用PSI系統(tǒng)中參與電子傳遞,作為Ferredoxin-NAD(P) (+) oxidoreductase (FNR)的電子供體參與NADP的再生,與植株體內活性氧(reactive oxygen species, R0S)的累積密切相關。由于ROS在植物抗性的產生中起信號傳導和超敏反應(hypersensitive response,HR)及細胞程序性死亡(programmedcell death,P⑶)能源來源的雙重作用,現已證實源自甜椒(Capsicum annuum)的類鐵氧還蛋白基因(/7/7/7)可幫助水稻、煙草、擬南芥以及文心蘭在內的許多植物獲得廣譜抗性,但轉化定位不同亞細胞器Λ/基因對植株能否產生抗病性有重要影響。
[0004]此前,我們以龍眼胚性愈傷組織轉錄組數據為基礎,分離克隆6個不同類型鐵氧還蛋白 NCBI GenBank 基因登錄號分別為 JF733781、JF733783、JF733784、JF733785、JF733787、JF733788、JX996183,其中,獲得 cDNA 全長的為 JF733784、JF957855、JF957858、JF957857,分別命名為 Dlfd1、D1MFDX\ ,Dlfdc 1、D1MFDX2。進化樹分析顯示,Dlfdi ,Dlfdc I與甜椒/7/7/7基因有一定的同源性,可能在提高植物抗病性方面具有生理作用。此前,有關類鐵氧還蛋白基因提高植物抗病性方面僅見源自甜椒的類鐵氧還蛋白被報道,源自其他物種的不同類型的Λ/基因是否且有提高抗病性功能仍未知。本發(fā)明通過將源自龍眼的兩個鐵氧還蛋白基因利用農桿菌介導技術導入文心蘭切花栽培種南茜Gower TfeffisejO原球莖(protocorm-like body, PLB),成功獲得了轉化植株,經軟腐病(soft rot)接菌試驗,發(fā)現轉化/7/Λ/3基因文心蘭植物可以顯著提高文心蘭種苗抗軟腐病能力。
[0005]
【發(fā)明內容】
:
本發(fā)明的目的是提供一種利用龍眼鐵氧還蛋白基因轉化蘭科植物提高抗病力的方法,利用轉基因技術將龍眼鐵氧還蛋白基因07Λ/3導入蘭科植物,提高轉化植株對抗病害的能力。其中所述的蘭科植物為文心蘭或石斛蘭,優(yōu)選文心蘭。所抵抗病害為軟腐病。
[0006]為實現上述目的,本發(fā)明采用如下技術方案:
一種利用龍眼鐵氧還蛋白基因轉化蘭科植物提高抗病力的方法,利用轉基因技術將龍眼鐵氧還蛋白基因NCBI GenBank基因登錄號:JF733784,導入蘭科植物,獲得具有抗病害能力的轉化植株。
[0007]所述的蘭科植物為文心蘭或石斛蘭。
[0008]所述抗病害為軟腐病。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明通過系統(tǒng)研究,首次克隆了龍眼鐵氧還蛋白基因及CDNA全長。
[0010]2、利用轉基因技術將龍眼鐵氧還蛋白導入蘭科植物,可以顯著提高蘭科植物的移栽成活率。
[0011]3、利用轉基因技術將龍眼鐵氧還蛋白導入蘭科植物,可以顯著提高蘭科植物的抵抗軟腐病的能力。
[0012]【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1載體結構圖。
[0013]圖2轉化似/?/ Dlfdcl植株的PCR鑒定。其中,A為轉化Dlfdcl植株,B為轉\tDlfd3植株;取篩選培養(yǎng)后的生根苗葉片進行轉化后PCR鑒定。在500bp左右呈現陽性條帶的為整合外源基因植株。
[0014]圖3轉化植株移栽對比試驗。生根苗生長至6 cm以上進行移栽,每個處理移栽128株,重復3次,移栽2個月后統(tǒng)計成活率。MmkDlfd3陽性植株移栽成活率顯著高于野生型。其中WT:野生型,E2:超表達似Λ/ci陽性植株,E3:超表達似Λ/J陽性植株。
[0015]圖4轉化Dlfd3/ Dlfdcl植株移栽抗軟腐病能力試驗。超表達Dlfd3陽性植株移栽抗軟腐病能力顯著高于野生型。其中WT:野生型,E2:超表達似陽性植株,E3:超mkDlfd3陽性植株。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
I,Dlfd3/ Dlfdc超表達載體構建
利用Trizol?試劑盒(Ivitrogen)提取龍眼胚性愈傷組織RNA,利用RevertAidTMFirst-Strand Synthesis System (Fermantas)合成 cDNA 第一鏈。
[0017]根據龍眼鐵氧還蛋白基因D1M3、Dlfdcl設計帶限制性內切酶位點Bgl I1、Spe I 的上下游相應引物似Λ/J F: 5’ -GA AGATC TATGGCAACT GTGACCCTTAG-3J, DlfdSR: 5’ -GG ACTAGT GTAAAGTTCG CCTTCCTTGTG-3’ -,DlfcIcl F: 5’ -GA AGATCT ATGGCAACACTTCACTTCAG-3’,似R: 5’ -GG ACTAGT ATCATCAGCA GTTGCCAGTTG-3’。25 μ LPCR 反應體系:10 X PCR buffer ( plus Mg 2+) 2.5 μ L, dNTPs ( 2.5 mmol.L-1) 0.5μ L,正向引物(10 μ mo I.L—1) I μ L,反向引物(10 μ mo I.L—1 ) I μ L, Taq ( 5 U?μ L-1) 0.2 μ L,ddH20 18.8 μ L0 PCR 反應程序:94 °C 預變性 4 min, 94 °C 變性 45 s,54 °C退火45 s,72 °C延伸40 s,設35個循環(huán),最后72 °C延伸10 min。1.0% (W/V)瓊脂糖電泳檢測PCR產物,回收500 bp左右條帶,導入PMD18-T (TAKARA)構建PMD18-T質粒。利用 Fermentas FastDigest (Thermo Fisher Scientific)限制性內切酶兔1./ I1、Spe I雙酶切pCAMBIA1302及Vmi^-rX-Dlfd3/Dlfdel質粒,回收酶切質粒及500bp左右小片段,利用 T4 連接酶將龍眼似基因導入 pCAMBIA1302 (pl302),構建 pl302: \Dlfd?>/Dlfdcl質粒,構建好的質粒經PCR檢測,導入大腸桿菌感受態(tài)DH5 a (TIANGEN),于含安芐青霉素50 mg.L^1 LB固體培養(yǎng)基涂板,陽性菌株送華大基因測序,檢測剪接正確性,完成雙元表達載體P1302::似Λ/3/似/而7的構建(見圖1)。
[0018]2、農桿菌的 制備
利用小量質粒提取試劑盒(TIANGEN)提取大腸桿菌DH5 α中p1302: -.Dlfd?,/ Dlfdcl質粒,利用鈣通道法將質粒轉化ΕΗΑ105農桿菌感受態(tài),于含卡那霉素及鏈霉素均為75mg/LYEB固體培養(yǎng)基涂板,挑取陽性克隆子,于含卡那霉素及鏈霉素均為75mg/L YEB液體培養(yǎng)基,置于搖床,280C,250rpm,培養(yǎng)至0D600 =0.4,備用。
[0019]3、文心蘭的轉化
以繼代35 d PLB為培養(yǎng)材料,將PLB置于0.5M蔗糖MS液體培養(yǎng)基,置于80 RPM搖床,高滲處理2 h,再通過3 d黑暗條件下預培養(yǎng),將預處理后PLB材料置于以MS液體培養(yǎng)基重懸的濃度為0D600=1.0的EHA105農桿菌菌液進行侵染30min,置于MS培養(yǎng)基黑暗條件下共培養(yǎng)3d,以200 mg/L頭孢(cefatoxime)洗菌20 min,并轉移至含50 mg/L頭孢MS培養(yǎng)基,250C,16h /d光照進行二階共培養(yǎng),30 d后轉入含5 mg .L-1潮霉素篩選培養(yǎng)基,25°C,16h /d光照,培養(yǎng)45d,重復篩選培養(yǎng)3次,將抗性植株轉入普通生根培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d,移栽至水草待測。
[0020]4、轉化后植株PCR檢測
利用CTAB法提取轉化后文心蘭葉片基因組DNA。通過PCR檢測目的基因條帶驗證T-DNA是否導入植株。PCR反應體系及反應條件同上。經檢測,轉^7/而7基因的11株侍測株有7棵植株有陽性條帶,轉基因的11株侍測株有8棵植株有陽性條帶。
[0021]5、轉化后植株的抗病性檢測(見圖2)。
[0022]參照尹俊梅等方法,選取文心蘭軟腐病病葉,75%乙醇表面滅菌后挑取病健結合部組織液于NA固體培養(yǎng)基劃板,挑取的單菌落于NA液體培養(yǎng)基置于搖床,28°C, 250rpm,搖菌過夜,挑取有致病力菌液用于抗病性檢測。利用10 μ L槍頭蘸取菌液,于第二片真葉表面打孔,以不穿透葉片為度,接種10 d后觀察發(fā)病情況。參照尹俊梅等【尹俊梅,任羽,楊光穗,editors (2008)石斛蘭種質資源描述規(guī)范和數據質量控制規(guī)范.北京,統(tǒng)計發(fā)病指數.】方法,統(tǒng)計發(fā)病指數。經對比發(fā)現,與野生型植株相比,轉基因植株抵抗軟腐病能力提高,由高感軟腐病(Di=IOO)提升為中抗軟腐病(Di=27.5)(見圖3,移栽成活率由79.3%提高至95.7% (見圖4),達極顯著差異水平。
[0023]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例,凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾,皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權利要求】
1.一種利用龍眼鐵氧還蛋白基因轉化蘭科植物提高抗病力的方法,其特征在于:利用轉基因技術將龍眼鐵氧還蛋白基因似/必,登錄號:JF733784,導入蘭科植物,獲得具有抗病害能力的轉化植株。
2.根據權利要求1所述的一種利用龍眼鐵氧還蛋白基因轉化蘭科植物提高抗病力的方法,其特征在于:所述的蘭科植物為文心蘭或石斛蘭。
3.根據權利要求1所述的一種利用龍眼鐵氧還蛋白基因轉化蘭科植物提高抗病力的方法,其特征在于:所述抗病害為軟腐病。
【文檔編號】C12N15/84GK103898156SQ201410039383
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權日:2014年1月27日
【發(fā)明者】賴鐘雄, 葉煒, 林玉玲, 匡云波, 江金蘭, 李永清, 雷伏貴, 周建金, 許旭明, 陳裕坤, 劉生財, 張梓浩 申請人:福建農林大學, 三明市農業(yè)科學研究院