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一種改良的白及組培苗生產(chǎn)方法與流程

文檔序號:12667204閱讀:314來源:國知局

本發(fā)明屬于植物組培技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及通過改良白及組培培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成份,生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)白及組培苗的方法。



背景技術(shù):

蘭科植物白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)被收入中國藥典(2000年版1部),其功能與主治為收斂止血,消腫生肌。用于咳血吐血,外傷出血,瘡瘍腫毒,皮膚皸裂;肺結(jié)核咳血,潰瘍病出血。

近年研究發(fā)現(xiàn)白及多糖膠具有特殊的黏度,可作為混懸劑及乳化劑用于食品及化工領(lǐng)域?,F(xiàn)代藥理研究表明白及多糖膠對葡萄球菌、鏈球菌、結(jié)核桿菌等有抑制作用,具有保護皮膚和延緩衰老等功能,是安全性高的醫(yī)藥原料,市場需求量急劇增長。

白及種子萌發(fā)困難,生長緩慢。目前國內(nèi)也有組培室開展白及組培苗生產(chǎn),但普遍現(xiàn)象是種苗較細弱,形成的假鱗莖直徑較小,組培苗馴化成活率不高,組培時間較長。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供一種改良的白及組培苗生產(chǎn)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:

1.一種改良的白及組培苗生產(chǎn)方法,包括以下步驟:

(1)白及蒴果滅菌及瓶內(nèi)播種培養(yǎng)

用75%的酒精擦拭成熟的白及蒴果表面,再用3%洗衣粉水清洗白及蒴果表面,然后置超凈工作臺上用0.2%氯化汞溶液消毒15min,再用無菌水沖洗3~5次,用滅菌的濾紙吸干白及蒴果表面水分后,用手術(shù)刀切去白及蒴果頂部,再從白及蒴果中部縱向剖開,將種子取出均勻撒播到盛有種子播種培養(yǎng)基的瓶內(nèi),然后將瓶置于28℃,光照強度1500~1800lx,光照時間12小時的條件下培養(yǎng)至幼苗株高為1cm以上;所述種子播種培養(yǎng)基為:改良的MS+檸檬酸100mg/L+AgNO3 0.1mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.02mg/L+復硝酚鈉0.1mg/L+氯化膽堿50mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L,pH值5.5~5.8,所述改良的MS由以下大量元素、微量元素、鐵鹽和有機物組成:

大量元素為:KNO3 2930mg/L,(NH4)2SO4 463g/L,KH2PO4 400mg/L,MgSO4·7H2O 185mg/L,CaCl2·2H2O 166mg/L;

微量元素為:KI 0.83mg/L,H3BO3 6.2mg/L,MnSO4·4H2O 22.3mg/L,ZnSO4·7H2O 8.6mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L,CuSO4·5H2O 0.25mg/L,CoCl2·6H2O 0.025mg/L;

鐵鹽為:Na2·EDTA 37.25mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 27.85mg/L;

有機物為:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,鹽酸硫胺素50mg/L,鹽酸吡哆醇1mg/L,煙酸0.5mg/L;

(2)壯苗培養(yǎng)

轉(zhuǎn)接步驟(1)培養(yǎng)的植株高為1cm以上的幼苗到盛有壯苗及生根培養(yǎng)基的瓶內(nèi),然后將瓶置于28℃,光照強度為2000~2500lx,光照時間12小時的條件下培養(yǎng),待幼苗長成3~5片葉片,苗高3cm以上,植株基部膨大呈球形假鱗莖的小苗時進行如下生根培養(yǎng);所述壯苗及生根培養(yǎng)基為:改良的MS+檸檬酸300mg/L+AgNO3 0.2mg/L+6-BA 0.02~0.1mg/L+NAA 0.2mg/L~0.5mg/L+復硝酚鈉0.1mg/L+氯化膽堿150mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L,PH值5.5~5.8,所述改良的MS與步驟(1)中所述的種子播種培養(yǎng)基中所述的改良的MS相同。

(3)生根培養(yǎng)

將步驟(2)培養(yǎng)的小苗轉(zhuǎn)接到盛有新的步驟(2)中所述的壯苗及生根培養(yǎng)基的瓶內(nèi),然后將瓶置于28℃,光照強度為2000~2500lx,光照時間12小時的條件下培養(yǎng)培養(yǎng)45~50天,苗高5cm以上、假鱗莖的大小在5mm以上;

(4)曬苗培養(yǎng)

將步驟(3)經(jīng)過生根培養(yǎng)的組培瓶置入大棚內(nèi),在自然光下曬苗培養(yǎng)20天~25天即得出瓶移栽的白及組培苗。

2.根據(jù)技術(shù)方案1所述的一種改良的白及組培苗生產(chǎn)方法,步驟(1)中將種子取出均勻撒播到盛有種子播種培養(yǎng)基的瓶內(nèi)采用稀播,每個白及蒴果播種50-80瓶。

與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的創(chuàng)新點和有益效果如下:

本發(fā)明結(jié)合白及假鱗莖形成的生理生化特性,改良基本培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成份,降低激素濃度使用,結(jié)合光溫條件的調(diào)控,不需誘導分化及繼代培養(yǎng)步驟,白及組培苗從播種到出瓶,生產(chǎn)周期縮短到170~180天,比現(xiàn)有技術(shù)縮短生產(chǎn)周期40天~60天;且組培苗生長健壯,形成的假鱗莖達到0.8cm以上,比現(xiàn)有技術(shù)的假鱗莖增大0.4cm左右,白及組培苗的移栽成活率明顯提高,達到90%以上,提高12.5%~28.6%以上,產(chǎn)生了預料不到的技術(shù)效果,解決了白及組培中存在的種苗較細弱,形成的假鱗莖直徑較小,組培苗馴化成活率不高,組培時間較長的生產(chǎn)實際難題。

具體改良措施主要有:

1.改良MS基本培養(yǎng)基,以常用培養(yǎng)基MS為對照,提高大量元素中的磷、鉀用量,減少氮和鈣、鎂用量。硝酸鉀用量從1900mg/L提高到2930mg/L;磷酸二氫鉀用量從170mg/L提高到400mg/L;硝酸銨用量1650mg/L改用為硫酸銨463mg/L;氯化鈣用量從440mg/L減少為166mg/L;硫酸鎂用量從370mg/L減少為185mg/L。微量元素和鐵鹽的用量同MS。

2.增加B族維生素用量即鹽酸硫胺素用量從0.1mg/L提高到50mg/L;鹽酸吡哆醇用量從0.5mg/L提高到1mg/L。

3.新增氯化膽堿50mg/L~150mg/L;抗氧化劑AgNO3 0.1~0.2mg/L;檸檬酸100mg/L~300mg/L;復硝酚鈉0.1mg/L。同時添加蔗糖30g/L;香蕉30g/L。

在白及組培苗的整個生長發(fā)育期,增加B族維生素用量對白及胚狀體、莖、葉、假鱗莖的發(fā)育和增殖起到重要作用,其數(shù)據(jù)見表1。

檸檬酸作為抗褐化劑,抑制白及組培過程中酚類物質(zhì)產(chǎn)生,減少幼小原球莖死亡,提高了成苗率;AgNO3作為抗衰老劑,有效地防止了乙烯對白及組培苗生長的影響。

4.采用低濃度植物激素6-BA 0.02-0.2mg/L;NAA 0.02mg/L~0.5mg/L。低濃度植物激素提高了植株的正常苗比率。

5.提高培養(yǎng)室溫度及后期組培苗培養(yǎng)的光照強度。調(diào)節(jié)培養(yǎng)室溫度到28℃;光照強度播種期1500lux-1800lux,壯苗及生根期2200lux-2500lux,光照時間12小時。適當提高培養(yǎng)室溫度及壯苗及生根期光照強度,增加了光合作用,促進了植株生長旺盛。

6.采用“種子播種→壯苗培養(yǎng)→生根培養(yǎng)→曬苗培養(yǎng)”四步法生產(chǎn)白及種苗,省略了誘導分化、繼代培養(yǎng)步驟,縮短了白及組培苗培養(yǎng)周期,現(xiàn)有技術(shù)白及組培的培養(yǎng)周期210~240天,本發(fā)明生產(chǎn)周期縮短到170~180天,白及組培苗生產(chǎn)周期縮短40~60天。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例中按常規(guī)植物組織培養(yǎng)的要求對培養(yǎng)基配制和滅菌,在常規(guī)的植物組培無菌條件下進行,無特殊說明的均為常規(guī)方法。

實施例1本發(fā)明方法,包括以下步驟:

(1)白及蒴果滅菌及瓶內(nèi)播種培養(yǎng)

用體積分數(shù)為75%的酒精擦拭成熟的白及蒴果表面,所述成熟的白及蒴果為.蒴果生長周期達到22周的果實,再用質(zhì)量分數(shù)為3%的洗衣粉水清洗所述成熟的白及蒴果表面,然后置超凈工作臺上用質(zhì)量分數(shù)為0.2%氯化汞溶液消毒15min,再用無菌水沖洗3~5次,用滅菌的濾紙吸干白及蒴果表面水分后,用手術(shù)刀切去白及蒴果頂部,再從白及蒴果中部縱向剖開,將種子取出均勻撒播到盛有種子播種培養(yǎng)基的瓶內(nèi),采用稀播,播種量為一個白及蒴果播種60瓶,所述瓶為常規(guī)的植物組培瓶,瓶內(nèi)徑為8cm,瓶高10cm。播種采用稀播有利于種子萌發(fā)后幼苗的生長,播得太密,小苗生長纖弱,不利于后期培養(yǎng)。然后將瓶置于在28℃,光照強度1500~1800lx,光照時間12小時的條件下培養(yǎng)至幼苗株高為1cm以上;所述種子播種培養(yǎng)基為:改良的MS+檸檬酸100mg/L+AgNO3 0.1mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.02mg/L+復硝酚鈉0.1mg/L+氯化膽堿50mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L,PH值5.5~5.8,所述改良的MS由以下大量元素、微量元素、鐵鹽和有機物組成:

大量元素為:KNO3 2930mg/L,(NH4)2SO4 463g/L,KH2PO4 400mg/L,MgSO4·7H2O 185mg/L,CaCl2·2H2O 166mg/L;

微量元素為:KI 0.83mg/L,H3BO3 6.2mg/L,MnSO4·4H2O 22.3mg/L,ZnSO4·7H2O 8.6mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L,CuSO4·5H2O 0.25mg/L,CoCl2·6H2O 0.025mg/L;

鐵鹽為:Na2·EDTA 37.25mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 27.85mg/L;

有機物為:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,鹽酸硫胺素50mg/L,鹽酸吡哆醇1mg/L,煙酸0.5mg/L;

以上從播種起培養(yǎng)5天后種子萌發(fā)形成原球莖,從播種起培養(yǎng)20天后長出第1片真葉,再培養(yǎng)30天,植株高1cm~1.2cm,從播種起至植株高1cm以上共50天。

(2)壯苗培養(yǎng)

轉(zhuǎn)接步驟(1)培養(yǎng)的植株高為1cm以上的幼苗到盛有壯苗及生根培養(yǎng)基的瓶內(nèi),然后將瓶置于28℃,光照強度為2000~2500lx,光照時間12小時的條件下培養(yǎng),待幼苗長成3~5片葉片,苗高3cm以上,植株基部膨大呈球形假鱗莖的小苗時進行如下生根培養(yǎng);所述壯苗及生根培養(yǎng)基為:改良的MS+檸檬酸300mg/L+AgNO3 0.2mg/L+6-BA 0.02mg/L+NAA 0.3mg/L+復硝酚鈉0.1mg/L+氯化膽堿150mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L,pH值5.5~5.8,壯苗及生根培養(yǎng)基中所述改良的MS與步驟(1)中所述種子播種培養(yǎng)基中的改良的MS相同。

壯苗培養(yǎng)50天,幼苗長成3-5片葉片,苗高3cm以上,植株基部膨大呈球形假鱗莖的健壯小苗。

(3)生根培養(yǎng)

將步驟(2)培養(yǎng)的小苗轉(zhuǎn)接到盛有新的步驟(2)中所述的壯苗及生根培養(yǎng)基的瓶內(nèi)(即生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基與壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基是相同的),然后將瓶置于28℃,光照強度為2000~2500lx,光照時間12小時的條件下培養(yǎng)50天,苗高5cm以上、植株根系發(fā)達,莖桿粗壯、葉片舒展寬大,假鱗莖的大小在5mm以上。

(4)曬苗培養(yǎng)

將步驟(3)經(jīng)過生根培養(yǎng)的組培瓶苗(瓶蓋不打開)置入大棚內(nèi),在自然光下曬苗培養(yǎng)20天即得可出瓶移栽的白及組培苗。在大棚內(nèi)自然光下曬過的瓶苗,苗的高度提高,葉片舒展厚度增加,葉綠素含量大幅提高,假鱗莖增大到8mm以上,這些白及組培苗因健壯出瓶移栽成活率達90%以上。而現(xiàn)有技術(shù)組培的白及組培苗出瓶移栽的成活率在70-80%。

以上實施例表明:采用本發(fā)明方法,白及種子播種培養(yǎng)僅50天,不需誘導分化就長出幼苗,壯苗培養(yǎng)50天幼苗即長成3-5片葉片,苗高3cm以上,植株基部膨大呈球形假鱗莖的健壯小苗。生根培養(yǎng)50天,苗高5cm以上、植株根系發(fā)達,莖桿粗壯、葉片舒展寬大,假鱗莖在5mm以上,加上大棚自然光曬苗培養(yǎng)20天,整個白及組培苗培養(yǎng)周期僅170天,而現(xiàn)有技術(shù)白及組培的培養(yǎng)周期需210~240天,本發(fā)明生產(chǎn)周期縮短40~70天,白及組培苗出瓶移栽成活率提高12.5%~28.57%以上,產(chǎn)生了預料不到的技術(shù)效果。

表1是在上述實施例步驟(3)生根培養(yǎng)中,采用本發(fā)明生根培養(yǎng)所用的壯苗及生根培養(yǎng)基,與對照的生根培養(yǎng)基的對比,培養(yǎng)條件相同。對照的生根培養(yǎng)基與本發(fā)明的生根培養(yǎng)所用的壯苗及生根培養(yǎng)基的區(qū)別僅在于MS培養(yǎng)基:本發(fā)明的生根培養(yǎng)采用的壯苗及生根培養(yǎng)基中是本發(fā)明改良的MS培養(yǎng)基,而對照的生根培養(yǎng)基中的MS是現(xiàn)有的MS培養(yǎng)基,表1的調(diào)查數(shù)據(jù)表明:本發(fā)明改良的MS培養(yǎng)基增加B族維生素用量對白及胚狀體、莖、葉、假鱗莖的發(fā)育和增殖起到重要作用。

表1本發(fā)明改良的MS與現(xiàn)有的MS對白及組培苗生長的影響

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