本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細(xì)胞胚胎的方法。
背景技術(shù)：
胡椒(Piper nigrum L.)為胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)多年生木質(zhì)藤本植物，其果實(shí)具有辛辣香氣，素有“香料之王”的美譽(yù)，是世界重要的香辛料作物，也是人們喜愛的調(diào)味品。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，胡椒可被用作健胃劑、解熱劑和支氣管粘膜刺激劑等。在食品工業(yè)上，可被用作抗氧化劑、防腐劑和保鮮劑等。作為一種深受人們喜愛的調(diào)味品和具有眾多用途的熱帶農(nóng)產(chǎn)品，胡椒已遍及亞州、非州、拉丁美洲三大洲近20個(gè)國家和地區(qū)。其中我國主要分布在海南、云南、廣東、福建等地，種植面積近3×104hm2、年產(chǎn)量超過3.6×105t，居世界第五位。我國胡椒市場長期存在供不應(yīng)求的局面，每年需進(jìn)口約1.0×104t滿足內(nèi)需。隨著我國人民生活水平的不斷提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，胡椒消費(fèi)量還將大幅增加。市場需求的不斷擴(kuò)大給胡椒產(chǎn)業(yè)提供了廣闊的發(fā)展前景。
胡椒為多年生藤本植物，生產(chǎn)上胡椒種苗繁育以插條苗為主，該方法具有種苗與母本性狀一致、后代發(fā)病率低等優(yōu)點(diǎn)，但它對苗圃規(guī)劃、母株選擇、苗期培育等環(huán)節(jié)有著嚴(yán)格的要求，成本較高，且無法滿足產(chǎn)業(yè)快速推進(jìn)高通量種苗培育的要求，高通量種苗培育技術(shù)的缺乏限制了產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。體細(xì)胞再生是基于細(xì)胞全能型理論、以母本組織為外植體，在體外環(huán)境下通過愈傷誘導(dǎo)、分化等一系列過程獲得組培苗的技術(shù)體系。胡椒體細(xì)胞再生體系的建立可以為種苗的高通量、規(guī)模化、商業(yè)化生產(chǎn)以及種植業(yè)的快速推廣提供技術(shù)支撐。
盡管體細(xì)胞再生技術(shù)已廣泛應(yīng)用于種苗培育、轉(zhuǎn)基因育種等領(lǐng)域，但不同作物的再生體系與外植體選擇、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)環(huán)境等因素密切相關(guān)。現(xiàn)有研究《胡椒組織培養(yǎng)研究》以胡椒實(shí)生苗芽尖、胚軸、葉片為外植體開展了胡椒體細(xì)胞再生研究，并提供了種子滅菌、體細(xì)胞再生培養(yǎng)方法，但其文獻(xiàn)公布的方法種子萌發(fā)污染率高達(dá)30％-60％，而體細(xì)胞分化率不到1％(劉進(jìn)平等，熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,22(3):18-22.)。目前胡椒生產(chǎn)上還未有一種適合于胡椒體細(xì)胞胚胎發(fā)生的培育方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細(xì)胞胚胎的方法，使得所述方法能夠顯著提高胡椒體細(xì)胞胚胎的分化率。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細(xì)胞胚胎的方法，使得所述方法能夠顯著降低種子萌發(fā)污染率。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細(xì)胞胚胎的方法，包括：
步驟1、將成熟胡椒種子滅菌，然后培養(yǎng)成胡椒幼苗，從幼苗子葉處分離出外種皮；
步驟2、將外種皮進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，包含活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和2,4-D；
步驟3、將愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚胎分化培養(yǎng)，獲得胡椒體細(xì)胞胚胎，分化培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，包含活性炭和聚乙烯吡咯烷酮。
針對現(xiàn)有胡椒組織培養(yǎng)方法中種子萌發(fā)污染率較高以及分化率較低的問題，本發(fā)明從外植體的選擇和培養(yǎng)基配方調(diào)整兩個(gè)方面入手，實(shí)現(xiàn)了較高體細(xì)胞分化率的目的，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行適宜的消毒措施，降低了種子萌發(fā)的污染率。
作為優(yōu)選，步驟1為：
將成熟胡椒種子滅菌，然后置于無菌培養(yǎng)基中，28±2℃、避光培養(yǎng)至胡椒幼苗長出，子葉完全展開后，將外種皮從子葉頂端剝離，無菌培養(yǎng)基配方為1/2MS+2g/L活性炭。
其中，所述滅菌具體為：
將完整的成熟胡椒種子在75％酒精中浸泡2分鐘，然后無菌水清洗5次；在超凈臺無菌環(huán)境下去除果肉，將去除果肉的種子在75％酒精中浸泡2分鐘，然后無菌水清洗5次，接著將去除果肉的種子置于0.1％的升汞中浸泡10分鐘滅菌，最后轉(zhuǎn)移至新的無菌容器中，無菌水清洗5次。
作為優(yōu)選，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中活性炭濃度為2g/L、聚乙烯吡咯烷酮濃度為1g/L，2,4-D濃度為0.5mg/L；所述分化培養(yǎng)基中活性炭濃度為2g/L、聚乙烯吡咯烷酮濃度為1g/L。在本發(fā)明具體實(shí)施中，所述聚乙烯吡咯烷酮為聚乙烯吡咯烷酮40(PVP-40)。
作為優(yōu)選，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)和分化培養(yǎng)均在28±2℃下避光培養(yǎng)90天，每隔30天更換新培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，本發(fā)明方法中的成熟胡椒種子以成熟的熱引1號(Piper nigrumc.v.Reyin-1)種子為材料，選擇的種子完全成熟且無病蟲害和機(jī)械損傷。
本發(fā)明以不同外植體和培養(yǎng)基作為對照方法，與本發(fā)明方法在相同環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，本發(fā)明方法的種子萌發(fā)污染率僅為5％左右，而文獻(xiàn)《胡椒組織培養(yǎng)研究》中的方法的污染率高達(dá)50％以上；在愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞分化率方面，本發(fā)明的效果也是顯著高于各對照方法。
由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述方法選擇外種皮作為外植體，調(diào)整愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基的配方，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和2,4-D等成分，實(shí)現(xiàn)了高達(dá)20％的胡椒體細(xì)胞胚胎分化率，對高通量胡椒種苗繁育研究及轉(zhuǎn)基因育種體系建立具有重要意義。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明公開了一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細(xì)胞胚胎的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
以下就本發(fā)明所提供的一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細(xì)胞胚胎的方法做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1：本發(fā)明所述方法
取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實(shí)；將種子從果穗剝離，無菌環(huán)境下75％(V/V)酒精中浸泡2分鐘，然后無菌水清洗5次；在無菌環(huán)境下去除果肉，將去除果肉的種子在75％酒精中浸泡2分鐘，然后無菌水清洗5次，再將種子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分鐘滅菌，最后將種子轉(zhuǎn)移至新的無菌容器中，無菌水清洗5次，獲得無菌種子。
無菌環(huán)境下，將無菌種子置于無菌培養(yǎng)基中萌發(fā)，(28±2)℃、避光培養(yǎng)60天。培養(yǎng)基配方為1/2MS+2g/LAC(活性炭)。待胡椒幼苗完全長出后，將外種皮從子葉頂端剝離。
將外種皮置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，(28±2)℃、避光培養(yǎng)90天。培養(yǎng)基配方為MS+2g/L AC+1g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)+0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。培養(yǎng)期間，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，90天后可誘導(dǎo)出愈傷組織。
將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，(28±2)℃、避光培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為MS+2g/LAC+1g/L PVP-40，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼帶培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)90天后可得到胡椒體細(xì)胞胚胎。
實(shí)施例2：對照方法1(以葉片、胚軸為外植體采用實(shí)施例1中培養(yǎng)方法)
取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實(shí)；將果實(shí)從果穗剝離，無菌環(huán)境下75％(V/V)酒精中浸泡2分鐘，然后無菌水清洗5次；在無菌環(huán)境下去除果肉，將去除果肉的種子在75％酒精中浸泡2分鐘，然后無菌水清洗5次，再將種子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分鐘滅菌，最后將胡椒種子轉(zhuǎn)移至新的無菌容器中，無菌水清洗5次，獲得無菌種子。
無菌環(huán)境下，將無菌種子置于無菌培養(yǎng)基中萌發(fā)，(28±2)℃、避光培養(yǎng)60天。培養(yǎng)基配方為1/2MS+2g/L AC。待胡椒幼苗完全長出后，切取無菌實(shí)生苗的胚軸(1.5厘米長)、葉片為外植體。
將胚軸、葉片置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，(28±2)℃、避光培養(yǎng)90天。培養(yǎng)基配方為MS+2g/LAC+1g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)+0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。培養(yǎng)期間，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，90天后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率。
將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，(28±2)℃、避光培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為MS+2g/LAC+1g/L PVP-40，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)90天后可得到胡椒體細(xì)胞胚胎。
實(shí)施例3：對照方法2(將實(shí)施例1中MS培養(yǎng)基更換為無激素SH培養(yǎng)基)
取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實(shí)；將種子從果穗剝離，無菌環(huán)境下75％(V/V)酒精中浸泡2分鐘，然后無菌水清洗5次；在無菌環(huán)境下去除果肉，將去除果肉的種子在75％酒精中浸泡2分鐘，然后無菌水清洗5次，再將種子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分鐘滅菌，最后將種子轉(zhuǎn)移至新的無菌容器中，無菌水清洗5次，獲得無菌種子。
無菌環(huán)境下，將無菌種子置于無菌培養(yǎng)基中萌發(fā)，(28±2)℃、避光培養(yǎng)60天。培養(yǎng)基配方為SH+2g/L AC。待胡椒幼苗完全長出后，將外種皮從子葉頂端剝離。
將外種皮置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，(28±2)℃、避光培養(yǎng)90天。培養(yǎng)基配方為SH+2g/L AC。培養(yǎng)期間，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，90天后可誘導(dǎo)出愈傷組織。
將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，(28±2)℃、避光培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為SH+2g/L AC+1g/L PVP-40，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)90天后可得到胡椒體細(xì)胞胚胎。
實(shí)施例4：對照方法3(文獻(xiàn)《胡椒組織培養(yǎng)研究》中的方法)
取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實(shí)；將果實(shí)從果穗剝離置于飽和洗衣粉溶液中去皮，然后用流水沖洗干凈，再依次用75％的酒精浸泡2分鐘，0.1％的升汞消毒15分鐘，2％的次氯酸鈉消毒10分鐘，無菌水清洗3-5次，然后接種到1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)。種子在(28±2)℃、避光條件下萌發(fā)60天后，切取無菌實(shí)生苗的胚軸、葉片為外植體。
將胚軸、葉片置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為1/2MS+5mg/L萘乙酸(NAA)+2mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)。培養(yǎng)條件為溫度(28±2)℃，光照時(shí)間10小時(shí)/天，連續(xù)培養(yǎng)90天后可誘導(dǎo)出愈傷組織。
將愈傷組織轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞胚胎分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為1/2MS+100mg/L腺嘌呤+3mg/L 6-BA。培養(yǎng)期間，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(28±2)℃，光照時(shí)間10小時(shí)/天，連續(xù)培養(yǎng)90天后統(tǒng)計(jì)胡椒體細(xì)胞胚胎。
實(shí)施例5：對照方法4(文獻(xiàn)《胡椒組織培養(yǎng)研究》中的方法)
取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實(shí)；將果實(shí)從果穗剝離置于飽和洗衣粉溶液中去皮，然后用流水沖洗干凈，再依次用75％的酒精浸泡2分鐘，0.1％的升汞消毒15分鐘，2％的次氯酸鈉消毒10分鐘，無菌水清洗3-5次，然后接種到1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)。種子在(28±2)℃、避光條件下萌發(fā)60天后，切取無菌實(shí)生苗的胚軸、葉片為外植體。
將胚軸、葉片置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為1/2MS+3mg/L 2,4-D+100mg/L腺嘌呤。培養(yǎng)條件為溫度(28±2)℃，光照時(shí)間10小時(shí)/天，連續(xù)培養(yǎng)90天后可誘導(dǎo)出愈傷組織。
將愈傷組織轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞胚胎分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為1/2MS+100mg/L腺嘌呤+3mg/L 6-BA。培養(yǎng)期間，每隔30天將材料轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(28±2)℃，光照時(shí)間10小時(shí)/天，連續(xù)培養(yǎng)90天后統(tǒng)計(jì)胡椒體細(xì)胞胚胎。
實(shí)施例6：對比試驗(yàn)
按照實(shí)施例1-實(shí)施例5的方法進(jìn)行試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)污染率、愈傷組織誘導(dǎo)率以及體細(xì)胞胚胎分化率，結(jié)果見表1。
表1不同培養(yǎng)方法污染率、體細(xì)胞胚胎分化率對比
由表1可以看出，采用本發(fā)明的以外種皮為外植體獲得胡椒體細(xì)胞胚胎的方法，污染率為5％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于現(xiàn)有文獻(xiàn)公布的培育方法。采用本發(fā)明所提供的愈傷誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)基和培育方式，愈傷誘導(dǎo)率在95％以上、體細(xì)胞分化率高達(dá)20％左右，相比其他對照方法，為最優(yōu)的培育方法。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。