本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，具體涉及一種利用抑菌培養(yǎng)基培育甜椒的組培方法，屬生物
技術領域：
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背景技術：
：甜椒(CapsicumannuumL.)是茄科辣椒屬辣椒的一個變種，俗稱燈籠椒、柿子椒，有紅色、綠色、橙色、黃色、紫色等多種顏色，又稱五彩甜椒。甜椒是非常適合生吃的蔬菜，含豐富維他命C和B及胡蘿卜素。甜椒還可以解熱、鎮(zhèn)痛、防癌、增加食欲、幫助消化、降脂、減肥等。由于它翠綠鮮艷，因此不但能自成一菜，還被廣泛用于配菜。甜椒組織培養(yǎng)既可以加快分子育種中抗性選育進程和提高種苗的繁殖速度，有利于促進甜椒品種選育和降低種苗成本，又可以結(jié)合低溫、超低溫冷凍儲藏技術用來保存甜椒種質(zhì)資源，有利于種質(zhì)交換和轉(zhuǎn)移，對甜椒種質(zhì)資源的保護和利用具有重要的應用價值和意義。甜椒組織培養(yǎng)的成本主要包括組培苗生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基、設施設備、供電成本、耗材和人工成本。常規(guī)的甜椒組織培養(yǎng)方法要求外植體接種在高溫高壓滅菌后的無菌培養(yǎng)基中才能正常生長，耗能大，人工操作成本高。如果能通過抑菌的方法來改造培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基在不需要進行高溫高壓滅菌，就能夠獲得甜椒的正常生長。這樣，一方面可以降低甜椒組織培養(yǎng)對設施設備的要求，尤其不需要高溫高壓滅菌所需配置的高壓鍋設備，縮減了投資成本，電能消耗也將大幅度降低；另一方面，采用這種培養(yǎng)基開展甜椒組織培養(yǎng)，組培環(huán)節(jié)大為簡化，人工操作的速度大幅提高，從而降低了人工成本。此外，由于改造后的培養(yǎng)基自身具有殺菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制組織培養(yǎng)過程中的污染問題，又不會對甜椒生長產(chǎn)生毒害或抑制，即不影響甜椒的正常生長，從根本上簡化了甜椒組織培養(yǎng)。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種利用抑菌培養(yǎng)基培育甜椒的組培方法。本發(fā)明的目的是通過以下方法實現(xiàn)的。本發(fā)明的一種利用抑菌培養(yǎng)基培育甜椒的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：1.培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?.培養(yǎng)基配制：誘導培養(yǎng)基為MS+0.5～1.0mg/L6-BA+0.1～0.3mg/LIAA+40～100mg/L次氯酸鈉+50～100mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；增殖培養(yǎng)基為：MS+0.1～1.0mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LKT+0.05～0.2mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸鈉+50～100mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1～0.5mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸鈉+50～100mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；所述MS，為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述6-BA，指6-芐氨基嘌呤；所述IAA，指吲哚乙酸；所述KT，指6－糠氨基嘌呤；所述NAA，指α-萘乙酸；配制培養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；3.無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；4.誘導培養(yǎng)：剪取無病蟲害生長健壯的甜椒枝條，剪去葉片后，剪成2～3cm長的帶腋芽莖段，用清水沖洗3h，濾紙吸干枝條表面殘留水分，然后用體積比為75％酒精消毒25s，再用重量體積比為0.1％升汞浸泡消毒8min，無菌水反復沖洗3次以上。消毒后的莖段在無菌條件下接種于誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20～30d后長出新芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1500Lx；5.增殖培養(yǎng)：將誘導出的甜椒新芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，25d后逐步誘導出叢生芽，將叢生芽切開，接種到增殖培養(yǎng)基上；每25d轉(zhuǎn)接一次，可獲得大量幼芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1800Lx；6.生根培養(yǎng)：取高度為3～5cm芽苗，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d后成為完整植株；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1800Lx；7.瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡20min后，移栽至透水性好的基質(zhì)上，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃；所述透水性好的基質(zhì)，如珍珠巖:泥炭:耕作土＝1:1:1。本發(fā)明的應用效果利用化學試劑添加到各種培養(yǎng)基中，達到滅菌或抑菌的作用，配制的培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌。因此，在甜椒誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)各個階段，除了要考慮常用的評價指標外，還要考慮污染率的問題。1.誘導培養(yǎng)：通過實驗證實，本發(fā)明的利用抑菌培養(yǎng)基培育甜椒的組培方法與常規(guī)的甜椒組培方法比較結(jié)果如表1所示，在誘導培養(yǎng)階段的外植體培養(yǎng)的成活率差異不明顯。表1本發(fā)明的抑菌組培方法對甜椒誘導培養(yǎng)的影響組培方式外植體數(shù)外植體污染數(shù)成活率(％)常規(guī)組培方法752665.3抑菌組培方法732467.12.增殖培養(yǎng)：本發(fā)明的抑菌組培方法與常規(guī)組培甜椒的增殖倍數(shù)和污染率的比較，結(jié)果如表2所示，增殖倍數(shù)和污染率二個指標都沒有顯著差異。從瓶苗的生長狀況看，本發(fā)明的抑菌組培方法的培養(yǎng)基由于不經(jīng)過高溫高壓滅菌，激素和營養(yǎng)元素損失較少，甜椒組培苗更壯，葉色更綠。表2本發(fā)明的抑菌組培方法對甜椒增殖倍數(shù)和污染率的影響3.本發(fā)明的抑菌組培方法對甜椒生根率和污染率的影響：在組培苗生根過程中，本發(fā)明的抑菌組培方法與常規(guī)的甜椒組培方法比較，結(jié)果如表3所示，由于不經(jīng)過高溫高壓滅菌，激素和營養(yǎng)元素損失較少，生根效果更好，生根率和污染率的差異不顯著。表3本發(fā)明的抑菌組培方法的甜椒瓶苗生根情況4.成本分析：本發(fā)明的抑菌組培方法與常規(guī)組培的成本分析見表4。本發(fā)明組培省去了高壓滅菌環(huán)節(jié)，簡化了組培程序，提高了工作效率。直接費用計算，每年可以節(jié)約5.5萬元左右(以每天配制50L培養(yǎng)基計算)。常規(guī)組培還需要添置高壓鍋等設備及日常維護，此外，存在實驗室安全等問題。表4本發(fā)明的甜椒簡便組培方法與常規(guī)組培的成本分析表本發(fā)明具有如下有益效果：1.本發(fā)明的甜椒抑菌組培方法中，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基都無需高溫高壓滅菌，減少了工作量和能源消耗，簡化了甜椒組培技術環(huán)節(jié)，降低了甜椒組培成本。2.本發(fā)明的甜椒抑菌組培方法，操作簡單，只需按不同的培養(yǎng)基配方配制后即可，實用性強，推廣性好。3.本發(fā)明的甜椒抑菌組培方法與常規(guī)的甜椒組培方法對比，可以降低成本10％以上。具體實施方式為了進一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實施例加以說明。實施例一：一種利用抑菌培養(yǎng)基培育甜椒的組培方法一種利用抑菌培養(yǎng)基培育甜椒的組培方法，包括以下步驟：1.培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在取100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡10h，保存?zhèn)溆茫?.培養(yǎng)基配制：誘導培養(yǎng)基為MS+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LIAA+60mg/L次氯酸鈉+60mg/L特美汀+30mg/L丙酸鈣+0.1mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；增殖培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LKT+0.1mg/LNAA+60mg/L次氯酸鈉+60mg/L特美汀+30mg/L丙酸鈣+0.1mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3mg/LNAA+60mg/L次氯酸鈉+60mg/L特美汀+30mg/L丙酸鈣+0.1mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；配制培養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；3.無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；4.誘導培養(yǎng)：剪取無病蟲害生長健壯的甜椒枝條，剪去葉片后，剪成2～3cm的帶腋芽莖段，用清水沖洗3h，濾紙吸干枝條表面殘留水分，然后用體積比為75％酒精消毒25s，再用重量體積比為0.1％升汞浸泡消毒8min，無菌水反復沖洗3次，消毒后的莖段在無菌條件下接種于誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d后長出新芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1500Lx；5.增殖培養(yǎng)：將誘導出的甜椒新芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，25d后逐步誘導出叢生芽，將叢生芽切開(或?qū)㈤L的新芽再切成帶腋芽的莖段)接種到增殖培養(yǎng)基上；每25d轉(zhuǎn)接一次，可獲得大量幼芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1800Lx；6.生根培養(yǎng)：取高度為3～5cm芽苗，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d后成為完整植株；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1800Lx；7.瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡20min后，移栽至透水性好的基質(zhì)上(珍珠巖:泥炭:耕作土＝1:1:1)，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃。當前第1頁1 2 3