本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以葉片為外植體的紅椿再生方法。

背景技術(shù)：

紅椿(Toona ciliata Roem.)，又名紅楝子，隸屬楝科(Meliaceae)香椿屬(Toona)。在我國，紅椿主要分布在華南、華中、華東及西南地區(qū)，天然居群具有零星分布特點(diǎn)，印度、老撾、緬甸、巴基斯坦、澳大利亞東海岸也有分布。紅椿材質(zhì)好，素有“中國桃花心木”之稱，是優(yōu)良的家具用材。它具有早期速生性狀明顯、生長快等特點(diǎn)，生長量均超過一般人工栽培的常綠闊葉樹種，在我國南方地區(qū)已成為重點(diǎn)開發(fā)利用的優(yōu)質(zhì)速生用材樹種。由于環(huán)境的變化、天然更新能力較差及過度的采伐破壞，紅椿目前已成為瀕危樹種，是1999年經(jīng)國務(wù)院批準(zhǔn)的國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，并列入《中國主要栽培珍貴樹種參考名錄》。紅椿材質(zhì)細(xì)密，紋理通直，花紋美麗，芯材呈深紅褐色，被廣泛應(yīng)用在家具設(shè)計(jì)、車船制造及室內(nèi)裝飾領(lǐng)域；其樹形美觀，也可以作為行道樹栽種。

目前紅椿的研究主要側(cè)重于引種、繁育等常規(guī)育種。其繁殖方式多采用種子繁殖，但由于種子的保存能力有限，子代家系并不能完全保存親代優(yōu)良的遺傳性狀，故紅椿的扦插、嫁接及組織培養(yǎng)技術(shù)得到越來越多的關(guān)注。扦插及嫁接繁殖對(duì)紅椿的嫩枝要求較高，采穗圃的構(gòu)建同樣需要大量人力物力。在短時(shí)間內(nèi)，傳統(tǒng)的種子繁殖和扦插繁殖不能及時(shí)滿足種苗市場(chǎng)需求，此時(shí)，可通過組織培養(yǎng)技術(shù)解決種苗快速且大量繁殖問題。此外，構(gòu)建成熟高效的再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化成功的基礎(chǔ)，并為轉(zhuǎn)入目的基因獲得更加優(yōu)質(zhì)的紅椿品種奠定基礎(chǔ)，有效解決紅椿幼樹致命蟲害等諸多問題，高效推進(jìn)紅椿的定向遺傳改良。

國外紅椿組織培養(yǎng)技術(shù)研究報(bào)道較少，主要從成年大樹上采集外植體進(jìn)行離體繁殖，所獲得的腋芽誘導(dǎo)率均較低，且生根培養(yǎng)并不成功。國內(nèi)紅椿組織培養(yǎng)主要以種子及成年大樹帶芽莖段作為外植體建立組培體系，但增殖情況并不理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種以紅椿葉片為外植體的操作更簡(jiǎn)便、取材更廣泛的高效的紅椿再生方法，利用該方法能夠在短期內(nèi)快速獲得大量優(yōu)質(zhì)的紅椿種苗。本發(fā)明以紅椿葉片為材料，獲得健康的愈傷組織，系統(tǒng)研究紅椿的再生體系，旨在解決葉片再生問題，提高紅椿再生能力，為工廠化生產(chǎn)種苗、種質(zhì)資源保護(hù)和基因工程研究提供有效的參考價(jià)值。

本發(fā)明的以葉片為外植體的紅椿再生方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、外植體的獲得：將紅椿種子去掉雙側(cè)翅，在水中浸泡3～5h，經(jīng)消毒后將種子播種于固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到無菌苗，切取無菌苗的小葉作為外植體；培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d；

B、芽的誘導(dǎo)及伸長：將小葉接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，接種時(shí)小葉遠(yuǎn)軸面朝上；培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d；培養(yǎng)至外植體上分化出芽點(diǎn)時(shí)，將長芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基上在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽伸長；

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：每升含有6-BA 1.8～3.2mg、KT 0.5～1.5mg、NAA 0.03～0.15mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0；

所述的芽伸長培養(yǎng)基：每升含有6-BA0.05～0.3mg、NAA 0.1～0.3mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0；

C、生根培養(yǎng)：待不定芽伸長到3～5cm時(shí)，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，得到生根苗；培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d；

所述的生根培養(yǎng)基：每升含有NAA0.1～0.3mg、蔗糖15g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8～6.0；

D、煉苗及移栽：將生根苗煉苗后從培養(yǎng)瓶中挖出，洗凈根上的培養(yǎng)基，將生根苗在自來水中浸泡1h，移栽到泥炭土上，進(jìn)行栽培管理，得到紅椿植株。

優(yōu)選，所述的步驟A的消毒是將紅椿種子用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇水溶液滅菌1min，無菌水沖洗1次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％次氯酸鈉水溶液滅菌15～20min，無菌水沖洗3～5次。

優(yōu)選，所述的步驟D的煉苗是打開培養(yǎng)瓶蓋讓生根苗適應(yīng)2d。

優(yōu)選，所述的步驟D的泥炭土是高溫滅菌過的泥炭土。

所述的步驟A的固體MS培養(yǎng)基：每升含有蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0。

所述的MS培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，其成份和配置方法見Murashige T,Skoog F(1962)A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures.Physiol Plant 15:473–497。

本發(fā)明的以葉片為外植體的紅椿高效組織培養(yǎng)和植株再生方法，可擺脫外界條件的影響，規(guī)模化和工廠化生產(chǎn)出健壯、整齊一致的紅椿組培幼苗；與已經(jīng)報(bào)道的以紅椿大樹莖段作為外植體構(gòu)建再生體系相比，具有操作方便、取材廣泛、可重復(fù)性強(qiáng)及效率高等優(yōu)勢(shì)。該方法可滿足市場(chǎng)對(duì)種苗的需求，為紅椿種質(zhì)資源可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為種子培養(yǎng)35d得到的無菌苗，用于切取葉片。

圖2為芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d的小葉外植體上的芽點(diǎn)。

圖3為在芽伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d伸長的不定芽。

圖4為不定芽在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d后誘導(dǎo)出的根。

圖5為移栽成活的紅椿植株。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

A、外植體的獲得：將紅椿種子去掉雙側(cè)翅，在水中浸泡4h；在無菌超凈臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇水溶液滅菌1min，無菌水沖洗1次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％次氯酸鈉水溶液滅菌18min，無菌水徹底沖洗4次，然后將種子播種于固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d。種子培養(yǎng)3d左右開始萌芽，35d后，無菌苗(如圖1所示)復(fù)葉長出，切取其上的單個(gè)小葉作為外植體。所述固體MS培養(yǎng)基每升含有蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。

B、芽的誘導(dǎo)及伸長：將小葉接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，接種時(shí)小葉遠(yuǎn)軸面朝上；培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d。外植體上開始有愈傷出現(xiàn)，在培養(yǎng)30d后，逐漸分化為芽點(diǎn)(如圖2所示)，將長芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基上在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽伸長。培養(yǎng)30d后伸長的不定芽如圖3所示。所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：每升含有6-BA 2.5mg、KT 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。所述的芽伸長培養(yǎng)基：每升含有6-BA0.15mg、NAA 0.2mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。

C、生根培養(yǎng)：待不定芽伸長到4cm時(shí)，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d。生根培養(yǎng)30d后，不定芽長出多條根得到生根苗，生根情況如圖4所示。所述的生根培養(yǎng)基：每升含有NAA0.2mg、蔗糖15g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。

D、煉苗及移栽：打開培養(yǎng)瓶蓋讓生根苗適應(yīng)2d，然后小心將生根苗從培養(yǎng)瓶中挖出，洗凈根上的培養(yǎng)基，將生根苗在自來水中浸泡1h，移栽到裝在營養(yǎng)杯中的高溫滅菌過的泥炭土上，在營養(yǎng)杯上套上塑料袋保濕，3d后慢慢地移開塑料袋，按生長需求澆水。移栽成活的紅椿植株如圖5所示。

實(shí)施例2

A、外植體的獲得：將紅椿種子去掉雙側(cè)翅，在水中浸泡3h；在無菌超凈臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇水溶液滅菌1min，無菌水沖洗1次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％次氯酸鈉水溶液滅菌15min，無菌水徹底沖洗3次，然后將種子播種于固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d。種子培養(yǎng)3d左右開始萌芽，30d后，無菌苗復(fù)葉長出，切取其上的單個(gè)小葉作為外植體。所述固體MS培養(yǎng)基每升含有蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。

B、芽的誘導(dǎo)及伸長：將小葉接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，接種時(shí)小葉遠(yuǎn)軸面朝上；培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d。外植體上開始有愈傷出現(xiàn)，在培養(yǎng)25d后，逐漸分化為芽點(diǎn)，將長芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基上在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽伸長。所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：每升含有6-BA 1.8mg、KT 0.5mg、NAA 0.03mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。所述的芽伸長培養(yǎng)基：每升含有6-BA0.05mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。

C、生根培養(yǎng)：待不定芽伸長到3cm時(shí)，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d。生根培養(yǎng)30d后，不定芽長出多條根得到生根苗。所述的生根培養(yǎng)基：每升含有NAA0.1mg、蔗糖15g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。

D、煉苗及移栽：打開培養(yǎng)瓶蓋讓生根苗適應(yīng)2d，然后小心將生根苗從培養(yǎng)瓶中挖出，洗凈根上的培養(yǎng)基，將生根苗在自來水中浸泡1h，移栽到裝在營養(yǎng)杯中的高溫滅菌過的泥炭土上，在營養(yǎng)杯上套上塑料袋保濕，3d后慢慢地移開塑料袋，按生長需求澆水。由此得到移栽成活的紅椿植株。

實(shí)施例3

A、外植體的獲得：將紅椿種子去掉雙側(cè)翅，在水中浸泡5h；在無菌超凈臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇水溶液滅菌1min，無菌水沖洗1次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％次氯酸鈉水溶液滅菌20min，無菌水徹底沖洗5次，然后將種子播種于固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d。種子培養(yǎng)3d左右開始萌芽，40d后，無菌苗復(fù)葉長出，切取其上的單個(gè)小葉作為外植體。所述固體MS培養(yǎng)基每升含有蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH6.0；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。

B、芽的誘導(dǎo)及伸長：將小葉接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，接種時(shí)小葉遠(yuǎn)軸面朝上；培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d。外植體上開始有愈傷出現(xiàn)，在培養(yǎng)35d后，逐漸分化為芽點(diǎn)，將長芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基上在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽伸長。所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：每升含有6-BA 3.2mg、KT 1.5mg、NAA 0.15mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH6.0；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。所述的芽伸長培養(yǎng)基：每升含有6-BA 0.3mg、NAA 0.3mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH6.0；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。

C、生根培養(yǎng)：待不定芽伸長到5cm時(shí)，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d。生根培養(yǎng)30d后，不定芽長出多條根得到生根苗。所述的生根培養(yǎng)基：每升含有NAA0.3mg、蔗糖15g和瓊脂5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH6.0；配制方法是將上述成份混合均勻，調(diào)pH，然后滅菌備用。

D、煉苗及移栽：打開培養(yǎng)瓶蓋讓生根苗適應(yīng)2d，然后小心將生根苗從培養(yǎng)瓶中挖出，洗凈根上的培養(yǎng)基，將生根苗在自來水中浸泡1h，移栽到裝在營養(yǎng)杯中的高溫滅菌過的泥炭土上，在營養(yǎng)杯上套上塑料袋保濕，3d后慢慢地移開塑料袋，按生長需求澆水。由此得到移栽成活的紅椿植株。