本發(fā)明屬于植物遠緣雜交育種方法領(lǐng)域，具體涉及利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法。

背景技術(shù)：

作物近緣野生種具有許多可以供栽培作物利用的優(yōu)良基因及特性，如抗病蟲性，抗逆性，高品質(zhì)等。但是由于生殖隔離，那些優(yōu)良基因和特性難以直接為栽培作物利用，為將這些外源基因?qū)氲皆耘嘧魑镏?，育成一系列的附加系，代換系或易位系是豐富作物遺傳資源的一種重要手段。異源附加系是指物種原基因組中附加了外源種屬染色體的非整倍體材料。依據(jù)附加的染色體的數(shù)目及種類，異源附加系可分為：單體異源附加系、二體異源附加系、雙單體附加系、雙二體附加系和多重附加系等。其中最具有研究和使用價值的是單體異源附加系與二體異源附加系。單體異源附加系可以精確高通量地將標記分配到單個外源染色體上，并且每個單體異源附加系可以被看作是相應(yīng)一個外源染色體文庫，可以比較外源染色體與各自的同源受體染色體之間的標記位置，也便于研究同源染色體的滲入機制和配對狀態(tài)(譚光軒.HEREDITAS(Beijing)，2008,30(1):35-45)。目前已經(jīng)創(chuàng)制了許多植物的異源附加系，如洋蔥染色體導(dǎo)入到大蔥中(Masayoshi Shigyo*YT等.Genes Genet Sys.1996,71:363–371)；藥用野生稻染色體導(dǎo)入到水稻中(Tan G等.Theoretical and applied genetics.2005,111(8):1585-1595)；擬斯卑爾脫山羊草染色體導(dǎo)入到小麥中(Friebe B等.Theoretical and Applied Genetics.2000,101(1-2):51-58)；玉米染色體導(dǎo)入到燕麥中(Kynast RG等.Plant physiology.2001，125(3):1216-1227)。此外，在蕓薹屬物種間雜交過程中也獲得了大量的附加系(Struss D等,PlantBreeding.1991,106(3):209-214)。

普通栽培玉米(Zea mays L.)與其近緣物種之間由于生殖隔離造成遠緣雜交比較困難，因而難以將近緣物種的有益基因?qū)氲狡胀ㄔ耘嘤衩字小angelsdof等將二倍體或四倍體指狀摩擦禾與玉米的花粉混合后通過剪短花絲授在玉米雌穗上，所得到的雜種籽粒進行胚的培養(yǎng)，于1929年在世界上第一次成功獲得玉米-摩擦禾雜種F_l(Mangelsdorf PC等.Journal of Heredity.1931,22(11):329-343)。其后許多學(xué)者進行了摩擦禾染色體導(dǎo)入到玉米中的研究，其后代基本上都是通過胚拯救和誘導(dǎo)體細胞形成獲得(Molina MdC等.Electronic Journal of Biotechnology.2006,9(3):276-280)。因此，生殖隔離是造成玉米難以利用其近緣物種有益基因的主要因素。

MTF-1(Tripsazea creammaize T.2n＝76.)是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)通過遠緣雜交育成的包含全套玉米染色體組(20條)、鴨茅狀摩擦禾染色體組(36條)和四倍體多年生類玉米染色體組(20條)的玉米異源六倍體(蘇月貴.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)，是一個自然界不存在的新物種。因MTF-1具有玉米、四倍體多年生類玉米和摩擦禾的全套染色體、且具有雌性可育的特性，使MTF-1能與玉米、四倍體多年生類玉米或摩擦禾雜交結(jié)實，產(chǎn)生少量可育的雜交后代。利用MTF-1的這種特性，以MTF-1為橋梁材料與栽培玉米等雜交，可以克服遠緣雜交障礙，從而將玉米近緣種屬的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到栽培玉米中。

經(jīng)檢索，沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前玉米與其近緣屬種材料遠緣雜交成功率低，其近緣物種的種質(zhì)難以利用等問題，本發(fā)明目的在于提供玉米異源多倍體在培育玉米-大芻草單體附加系上的用途。

本發(fā)明另一目的在于提供一種利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法。

實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

玉米異源多倍體在培育玉米-大芻草單體附加系上的應(yīng)用。

所述的玉米異源多倍體是指玉米異源六倍體MTF-1(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)或其衍生系。

所述的MTF-1(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)通過遠緣雜交育成的含有玉米(Zea mays L.)、四倍體多年生類玉米(Zea perennis)和摩擦禾(Tripsacum dactyloides L.)的全套染色體的玉米異源六倍體材料(蘇月貴.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)。

所述的衍生系是指以MTF-1為母本，以玉米(Zea mays L.)、四倍體多年生類玉米(Zea perennis)或摩擦禾(Tripsacum dactyloides L.)為父本雜交，選擇包含玉米、四倍體多年生類玉米和摩擦禾三個物種全套染色體的后代(2n＝76)，所得的新的異源六倍體即為MTF-1的衍生系。

所述的玉米-大芻草單體附加系的染色體組成包括20條玉米染色體和1條大芻草染色體。

利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法，包括以玉米異源六倍體(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)為母本，以玉米(Zea mays L.)為父本雜交，收獲結(jié)實籽粒，得F₁代；然后對F₁代的染色體組成進行鑒定，選擇染色體總數(shù)為45～55條、且大芻草染色體數(shù)為1～20條的植株；再以所選的植株為母本，以玉米為父本回交，獲得BC₁代；對BC₁代進行染色體組成進行鑒定，然后選擇染色體總數(shù)為21～39條、且大芻草染色體數(shù)為1～5條的后代為母本，以玉米為父本繼續(xù)回交，得BC₂代；選擇BC₂代中染色體總數(shù)為21，其中玉米染色體為20條、大芻草染色體數(shù)為1條的材料，即為玉米-大芻草單體附加系。

上述方法中所述的玉米異源六倍體是指MTF-1(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)或其衍生系。

上述利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法，其具體步驟如下：

(1)、從三月下旬開始，分10批種植玉米(Zea mays L.，2n＝20)，每批20株，每批間隔3天；四月上旬將玉米異源六倍體(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)種植于花盆內(nèi)；

(2)、在吐絲前將玉米異源六倍體雌穗套袋，并在授粉前將其花絲剪短至2～3cm，然后以玉米為父本給玉米異源六倍體雌穗授粉，每個雌穗至少重復(fù)授粉3次，每次授粉后都在套袋上作標記，成熟時收獲種子，獲得F₁代；

(3)、次年4月，將步驟(2)所得的F₁代種子種植在人工氣候箱的營養(yǎng)缽中，在28℃、濕度為70％的條件下催芽，植株生長至2葉1心時移栽至花盆中種植；待植株株高≥30cm時，在晴天上午10：00～12:00、且氣溫高于25℃時，取根尖，采用染色體壓片技術(shù)鑒定體細胞染色體數(shù)目，利用原位雜交技術(shù)鑒定染色體組成，每個單株至少統(tǒng)計50個細胞；選擇染色體數(shù)為45～55條、且大芻草染色體數(shù)為1～20條的植株做母本，在雌穗吐絲前套袋，吐絲后剪短花絲至1～2cm，以玉米為父本進行授粉，在第1次授粉后隔2天重復(fù)授粉1次，每個雌穗至少重復(fù)授粉3次，成熟時收獲種子，得BC₁代；其中所述的玉米與步驟(1)一樣進行分期種植；

(4)、按照步驟(3)中所述的方法種植所得的BC₁代，并按照步驟(3)中所述的方法采用染色體壓片和原位雜交技術(shù)對BC₁代根尖染色體數(shù)目和組成進行鑒定；選擇BC₁代中染色體總數(shù)為21～39條且大芻草染色體數(shù)為1～5條的植株；用玉米作為父本給所選的BC₁代植株授粉，收獲得BC₂代；

(5)、按照步驟(3)中所述的方法種植BC₂代，采用染色體壓片技術(shù)對根尖染色體數(shù)目進行鑒定，BC₂代材料染色體總數(shù)只有20條和21條的兩種類型；

(6)、利用火焰干燥法對步驟(5)中染色體數(shù)目為21條的植株剩余根尖進行染色體制片，選擇染色體處于中期且分散度較高的根尖燃片進行雙色基因組原位雜交，分別用地高辛和生物素標記玉米和大芻草總基因組DNA，鑒定染色體組成；選擇根尖細胞染色體數(shù)目為21條，且其中含有20條玉米染色體和1條大芻草染色體的材料，即為玉米-大芻草單體附加系。

上述方法所述的種植的地點為四川或與四川相似的生態(tài)區(qū)。

上述方法步驟(1)或(2)中所述的玉米異源六倍體是指MTF-1(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)或其衍生系。

所述的MTF-1(Tripsazea creammaize T.2n＝76.)是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的一個包含全套玉米染色體組(20條)、鴨茅狀摩擦禾染色體組(36條)和四倍體多年生類玉米染色體組(20條)的玉米異源六倍體，是一個自然界不存在的新物種。MTF-1是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)以引自美國的四倍體玉米(Zea mays L.4n＝40)和四倍體鴨茅狀摩擦禾(或稱指狀摩擦禾，Tripsacum dactyloidesL.，2n＝72)之間的屬間雜種F₁為母本，以四倍體多年生類玉米(Zea perennis，2n＝40)為父本雜交育成的屬間雜種(蘇月貴.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)。

MTF-1(Tripsazea creammaize T.)為多年生，無性繁殖，植株茁壯，直立叢生，根系發(fā)達，植株抗寒性強。

MTF-1主要通過分兜繁殖、莖稈扦插或其他無性繁殖方式等無性繁殖方法進行繁殖。

所述的衍生系是指以MTF-1為母本，以玉米(Zea mays L.)、四倍體多年生類玉米或摩擦禾為父本雜交，選擇包含玉米、四倍體多年生類玉米和摩擦禾三個物種全套染色體的后代(2n＝76)，所得的新的異源六倍體即為其衍生系。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)保證自本發(fā)明申請之日起二十年內(nèi)，向公眾提供MTF-1(Tripsazea creammaize T.2n＝76)的繁殖材料，公眾可從四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得該生物材料。

上述方法中所述的玉米是指普通栽培玉米(Zea mays L.)，所述的玉米可以是雜交種、自交系、地方品種或綜合種等。

上述方法步驟(1)或(3)中所述的花盆的規(guī)格為口徑40cm，高35cm。

上述方法步驟(3)中所述的染色體數(shù)優(yōu)選為45～50條。

上述方法步驟(3)中所述的大芻草染色體數(shù)優(yōu)選為1～10條。

上述方法步驟(3)、(4)或(5)中所述的染色體壓片的方法為：在晴天上午10：00～12:00、且氣溫高于25℃時，取根尖，并用α-溴萘飽和水溶液預(yù)處理3h，將預(yù)處理后的根尖在室溫下用雙蒸水低滲30min，然后用新鮮固定液(甲醇：冰乙酸＝3：1)固定12h以上。再將固定后的根尖置于70％無水乙醇中，保存在4℃中過夜：用雙蒸水洗凈根尖上的固定液，用等量混合的6％纖維素酶(Yakult)與1％果膠酶(Yakult)，在37℃酶解根尖2.5h，酶解后的根尖用改良后的卡寶品紅染色進行壓片，顯微照相并統(tǒng)計染色體數(shù)目。

上述方法步驟(3)、(4)或(5)中所述的染色體壓片、原位雜交等方法可參見蘇月貴的碩士論文(蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)。

上述方法步驟(6)中所述的火焰干燥法參見蘇月貴的碩士論文(蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)。

本申請中所述的四倍體多年生類玉米和大芻草是同一物種的不同名稱，都是指Zea perennis。

本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果：(1)、本發(fā)明克服了玉米遠緣雜交的生殖障礙，為將大芻草中的優(yōu)良基因?qū)氲接衩字刑峁┝艘环N有效途徑，擴大了玉米遺傳種質(zhì)基礎(chǔ)，有利于選育突破性的玉米品種。(2)、本發(fā)明玉米-大芻草單體附加系為基因功能研究提供了良好的材料。(3)、利用本發(fā)明方法育成的玉米-大芻草單體附加系染色體穩(wěn)定性好，可以穩(wěn)定地遺傳給后代，為長期有效利用提供了保證。(4)、本發(fā)明以玉米異源六倍體為橋梁材料選育玉米-大芻草單體附加系比利用傳統(tǒng)的遠緣雜交等方法簡單，時間短、效率高、工作量小。

附圖說明

圖1、MTF-1的植株照片。

圖2、玉米與MTF-1的F₁代體細胞染色體原位雜交圖譜；其中藍色為摩擦禾染色體，淺綠色為玉米染色體，淺粉紅色為大芻草染色體。

圖3、玉米與MTF-1的BC₁代體細胞染色體原位雜交圖譜；其中箭頭所示為大芻草染色體。

圖4、玉米與MTF-1的BC₂代普通玉米染色體(2n＝20)顯微照片。

圖5、玉米與MTF-1的BC₂代中玉米-大芻草單體附加系染色體(2n＝20+1)顯微照片。

圖6、玉米與MTF-1的BC₂代中玉米-大芻草單體附加系(2n＝20+1)體細胞原位雜交圖譜；其中箭頭及白色線框內(nèi)所示為大芻草染色體。

圖7、玉米與MTF-1的BC₃代中普通玉米染色體(2n＝20)顯微照片。

圖8、玉米與MTF-1的BC₃代中玉米-大芻草單體附加系染色體(2n＝20+1)顯微照片。

具體實施方式

實施例1：玉米-大芻草單體附加系的培育

按照如下方法進行：

(1)、2012年4月上旬在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)將MTF-1(Tripsazea creammaize T.2n＝76；蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)(見圖1)種植于花盆(花盆規(guī)格為口徑40cm，高35cm)內(nèi)；從3月下旬開始，分10批，每批間隔3天種植玉米自交系Mo17(Zea mays L.，2n＝20)，每批種植20株。

(2)、在吐絲前將MTF-1雌穗套袋，并在MTF-1雌穗吐絲后將MTF-1花絲剪短至2～3cm，然后以Mo17為父本給MTF-1授粉，每個雌穗至少重復(fù)授粉3次，每次授粉后都在套袋上作標記，成熟時收獲種子，獲得F₁代。

(3)、2013年4月，將步驟(2)得到的F₁代種子種植在人工氣候箱的營養(yǎng)缽中，在28℃，濕度為70％的條件下催芽，植株生長至2葉1心時移栽至花盆(花盆規(guī)格為口徑40cm，高35cm)中種植，最終得到30株F₁代植株；待植株株高≥30cm時，在晴天上午10：00～12:00、且氣溫高于25℃時，取根尖，采用染色體壓片和原位雜交技術(shù)(染色體壓片和原位雜交技術(shù)參見蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009，以下同)鑒定細胞染色體數(shù)目和組成(所述的染色體壓片的方法為：將根尖用α-溴萘飽和水溶液預(yù)處理3h，將預(yù)處理后的根尖在室溫下用雙蒸水低滲30min，然后用新鮮固定液(甲醇：冰乙酸＝3：1)固定12h以上。再將固定后的根尖置于70％無水乙醇中，保存在4℃中過夜：用雙蒸水洗凈根尖上的固定液，用等量混合的6％纖維素酶(Yakult)與1％果膠酶(Yakult)，在37℃酶解根尖2.5h，酶解后的根尖用改良后的卡寶品紅染色進行壓片)，顯微照相并統(tǒng)計染色體數(shù)目，每個單株至少統(tǒng)計50個細胞，選擇染色體數(shù)目為45條(見圖2)、其染色體組成為16T+11P+18M(1MP)的植株(T、P、M分別表示摩擦禾染色體、大芻草染色體、玉米染色體，MP表示玉米與大芻草易位染色體)；在所選的BC₁代植株雌穗吐絲前套袋，吐絲后剪短花絲至1～2cm，以Mo17為父本(和步驟(1)一樣分批種植Mo17)給所選的F₁代植株授粉，在第1次授粉后隔2天重復(fù)授粉，共計授粉3次，每次授粉后都在套袋上作標記，成熟時收獲種子，得BC₁代。

(4)、2014年4月，按照步驟(3)所述的方法種植BC₁代，并采用染色體壓片和原位雜交技術(shù)鑒定細胞染色體數(shù)目和組成，根據(jù)BC₁的染色體分布類型從BC₁家系中選擇染色體條數(shù)趨近于玉米并且只含有大芻草染色體(染色體數(shù)目為22條,19M+3P，M代表玉米染色體，P代表大芻草染色體，見圖3)的個體設(shè)一個小群體，以Mo17為父本給所選植株授粉，成熟時收獲種子，得BC₂代。

(5)、次年按照步驟(3)所述方法種植BC₂代，采用染色體壓片技術(shù)對BC₂代的染色體數(shù)目進行鑒定，結(jié)果顯示BC₂代材料染色體類型只有20條(見圖4)和21條的兩種類型(見圖5)。

(6)、利用火焰干燥法對步驟(5)中染色體條數(shù)為21的植株剩余根尖進行染色體制片，選擇染色體處于中期且分散度較高的根尖燃片進行雙色基因組原位雜交(參見蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)，分別用地高辛和生物素標記玉米和大芻草總基因組DNA，鑒定染色體組成；選擇植株根尖細胞染色體數(shù)目為21條，且其中含有20條玉米染色體、1條大芻草染色體的材料(見圖6)，即為玉米-大芻草單體附加系。

實施例2玉米-大芻草單體附加系遺傳穩(wěn)定性鑒定試驗

(1)、2016年4月下旬，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)將實施例1所得的玉米-大芻草單體附加系(BC₂代)50粒種植在人工氣候箱的營養(yǎng)缽中，在28℃，濕度為70％的條件下催芽，植株生長至2葉1心時移栽至花盆(花盆規(guī)格為口徑40cm，高35cm)中種植，待植株株高≥30cm時，在晴天上午10：00～12:00、且氣溫高于25℃時，取根尖，采用染色體壓片技術(shù)(染色體壓片技術(shù)參見蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)鑒定細胞染色體數(shù)目，每個單株至少統(tǒng)計50個細胞，選擇染色體數(shù)為21條的玉米-大芻草單體附加系植株。同期取30粒玉米自交系Mo17同期分兩批種植于規(guī)格相同的花盆中，每批15粒，間隔7天播種。

(2)、2016年6月，在步驟(1)中所選的玉米-大芻草單體附加系植株吐絲前將雌穗套袋，并在吐絲后剪短花絲至2～3cm，以Mo17為父本給玉米-大芻草單體附加系植株授粉，每個果穗授粉1次，并套袋做標記。種子成熟后，單穗收種并做記錄得BC₃代。

(3)、2016年9月，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)種植步驟(2)所得的BC₃代，采用染色體壓片技術(shù)對BC₃代進行染色體數(shù)目鑒定，結(jié)果BC₃代中也只出現(xiàn)染色體數(shù)目為20條(見圖7)和21條的個體(見圖8)，說明本發(fā)明方法獲得的大芻草附加染色體可以穩(wěn)定地傳遞給后代。