專(zhuān)利名稱：組織培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合高效率培育水稻多倍體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效率形成水稻多倍體的技術(shù)方法，根本點(diǎn)在于利用種子、幼穗和莖段三個(gè)不同層次的外植體，發(fā)揮組織培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，高效率高質(zhì)量地培育水稻多倍體。
背景資料在環(huán)境不斷惡化，人口持續(xù)增長(zhǎng)，土地急劇減少，糧食短缺潛在危機(jī)的緊迫形勢(shì)下，世界水稻育種界正在進(jìn)行超級(jí)稻和超級(jí)雜交稻育種，其中中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)的00114471.5號(hào)專(zhuān)利申請(qǐng)中提出的“利用遠(yuǎn)緣雜交和多倍體雙重優(yōu)勢(shì)選育超級(jí)稻”是一個(gè)新的育種思路，正日益引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。要實(shí)現(xiàn)多倍體水稻育種，首先就要解決如何獲得多倍體的問(wèn)題。長(zhǎng)期以來(lái)，獲得水稻多倍體的方法主要有兩種，一種是用秋水仙素處理浸泡的種子或者發(fā)芽的種子；另一種是利用秋水仙素處理發(fā)育中的秧苗。這兩種方法存在著兩個(gè)主要問(wèn)題一是加倍形成多倍體水稻的頻率低，一般在5～10％左右；二是產(chǎn)生嵌合體，即同一個(gè)水稻植株上，有的穗子上結(jié)二倍體種子，有的穗子上結(jié)多倍體種子，還有的穗子上既結(jié)二倍體種子，也結(jié)多倍體種子。這樣大大影響了多倍體水稻育種的效率，尤其是對(duì)于難以獲得的少數(shù)幾粒雜交種子是難于用它進(jìn)行加倍處理的。盡管范昆華等(1991)，黃慧君等(1995)也應(yīng)用組織培養(yǎng)進(jìn)行水稻多倍體研究，但所用外植體、培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)頻率等方面仍然存在一些問(wèn)題。因此，自從1951年鮑文奎開(kāi)始水稻多倍體研究以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要局限于亞洲栽培稻品種，品種間或秈粳亞種間雜種的同源多倍體的研究，而對(duì)非洲栽培稻以及眾多野生稻，尤其是非A基因組野生稻沒(méi)有進(jìn)行多倍體加倍研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免上述多倍體誘導(dǎo)形成中存在的應(yīng)用材料單一、應(yīng)用范圍窄、誘導(dǎo)效率不高，易產(chǎn)生嵌合體等不足，提供一種全程應(yīng)用水稻發(fā)育階段為組織培養(yǎng)的試材，優(yōu)化組織培養(yǎng)技術(shù)，高效率、高質(zhì)量地誘導(dǎo)水稻多倍體的方法。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到
一種組織培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合高效率高質(zhì)量培育水稻多倍體的方法，包括全程應(yīng)用水稻試材、優(yōu)化愈傷組織培養(yǎng)方法、結(jié)合組織培養(yǎng)和秋水仙素處理誘導(dǎo)形成多倍體、多倍體植株的獲得、多倍體植株的鑒定和培育。
下面是詳細(xì)培育步驟當(dāng)采用水稻種子和幼穗作外植體時(shí)，需經(jīng)過(guò)以下七個(gè)培養(yǎng)階段a、愈傷組織誘導(dǎo)，b、秋水仙素液體培養(yǎng)加倍，c、繼代培養(yǎng)，d、分化出芽培養(yǎng)，e、生根培養(yǎng)，f、壯苗培養(yǎng)，g、育苗成熟及多倍體植株鑒定。
當(dāng)采用水稻莖段(帶節(jié)含有潛伏芽)為外植體時(shí)，需經(jīng)過(guò)以下七個(gè)培養(yǎng)階段a、叢芽誘導(dǎo)和增殖，b、秋水仙素液體培養(yǎng)加倍，c、繼代培養(yǎng)，d、叢芽生長(zhǎng)，e、生根培養(yǎng)，f、壯苗培養(yǎng)，g、育苗成熟及多倍體植株鑒定。
具體操作過(guò)程為一、當(dāng)采用水稻種子和幼穗作外植體時(shí)。
a、愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程為，將栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種種子或幼穗經(jīng)消毒處理后接種于N6(或MS)+2，4-D 1～2.5mg/l+NAA 1～2mg/l+6BA(或KT)0.1～0.5mg/l+蔗糖5～6％+水解酪蛋白5～150mg/l+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25～30℃、黑暗或光照800～10001x下培養(yǎng)25～45天而形成愈傷組織；b、秋水仙素液體培養(yǎng)加倍過(guò)程為，將在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中形成的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的愈傷組織轉(zhuǎn)入到N6(或MS)+2，4-D1～2.5mg/l+NAA 1～2mg/l+6BA(或KT)0.1-0.5mg/l+秋水仙素500-700mg/l+蔗糖3～5％+水解酪蛋白100mg/l、pH5.8～6.2的加倍培養(yǎng)基中，在20～22℃、95～105rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)40～48小時(shí)；c、繼代培養(yǎng)過(guò)程為，將加倍處理的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的愈傷組織經(jīng)無(wú)菌水充分洗滌后轉(zhuǎn)入與上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，溫度25～30℃、黑暗或光照600～1000 1x下繼代培養(yǎng)7-10天；d、分化出芽培養(yǎng)過(guò)程為，將繼代后的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的愈傷組織轉(zhuǎn)入到MS+6BA 1～2mg/l+KT 2～3mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+水解酪蛋白100～200mg/l+蔗糖3％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的分化培養(yǎng)基中，在25～30℃、光照1500～2000 1x下分化培養(yǎng)20～45天，分化出水稻芽苗；e、生根培養(yǎng)過(guò)程為，將經(jīng)愈傷組織分化培養(yǎng)出的水稻芽苗轉(zhuǎn)入1/2MS+6BA 0.1～0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+IAA 0.5～1mg/l+水解酪蛋白100mg/l+活性碳0.03％+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的生根培養(yǎng)基中生根，長(zhǎng)出完整小植株；
f、壯苗培養(yǎng)過(guò)程為，將來(lái)源于愈傷組織分化形成的水稻完整小植株轉(zhuǎn)入1/2 MS+6BA 0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+多效唑2～3mg/l+水解酪蛋白100～200mg/l+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的壯苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)成健壯的小植株；g、育苗成熟及多倍體植株鑒定過(guò)程為，將壯苗培養(yǎng)生長(zhǎng)的健壯小植株，移植到由2/3砂和1/3腐熟細(xì)土組成培養(yǎng)土的栽培容器中，移植成活并培育植株至成熟，在生長(zhǎng)過(guò)程中，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征(有芒、大粒、葉增大厚、莖桿變粗)和細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)(葉片氣孔增大、根尖染色體成倍增加)鑒別多倍體水稻植株。
二、當(dāng)采用水稻莖段(帶節(jié)含有潛伏芽)為外植體時(shí)。
a、叢芽誘導(dǎo)和增殖過(guò)程為，將栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種植株的莖段經(jīng)消毒處理后接種到2/3MS+6BA 1～3mg/l+KT 2～3mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+多效唑3～5mg/l+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的誘導(dǎo)多叢芽培養(yǎng)基中，在25～30℃、光照1500～2000 1x下培養(yǎng)10～30天而形成多叢芽；b、秋水仙素液體培養(yǎng)加倍過(guò)程為，將形成的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的多叢芽轉(zhuǎn)入到1/2MS+6BA 1～2mg/l+KT 2～3mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+多效唑3～5mg/l+秋水仙素500-700mg/l+蔗糖2～3％、pH5.8-6.2的培養(yǎng)基中，在光照500～800 1x、溫度20～22℃、轉(zhuǎn)速95～105rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)18～24小時(shí)；c、繼代培養(yǎng)過(guò)程為，將叢芽加倍處理的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的多叢芽經(jīng)無(wú)菌水充分洗滌后轉(zhuǎn)入與上述誘導(dǎo)多叢芽培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，在溫度25～30℃、光照1500～2000 1x下繼代培養(yǎng)7～10天；d、叢芽生長(zhǎng)過(guò)程為，將繼代培養(yǎng)的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的多叢芽經(jīng)無(wú)菌水充分洗滌后轉(zhuǎn)入到1/2MS+6BA 1-2mg/l+KT 2-3mg/l+NAA 0.2-0.5mg/l+多效唑3-5mg/L+水解酪蛋白100-200mg/l+蔗糖2％+瓊脂0.65-0.75％、pH5.8-6.2的培養(yǎng)基中，在光照1500-2000 1x、溫度25-30℃下培養(yǎng)出多叢芽苗；e、生根培養(yǎng)過(guò)程為，將栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的多叢芽苗轉(zhuǎn)入1/2MS+6BA 0.1～0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+IAA 0.5～1mg/l+水解酪蛋白100mg/l+活性碳0.03％+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的生根培養(yǎng)基中生根，長(zhǎng)出完整小植株；f、壯苗培養(yǎng)過(guò)程為，將來(lái)源于多叢芽增殖形成的水稻小植株轉(zhuǎn)入1/2MS+6BA 0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+多效唑2～3mg/l+水解酪蛋白100～200mg/l+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的壯苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)成健壯的小植株；
g、育苗成熟及多倍體植株鑒定過(guò)程為，將壯苗培養(yǎng)生長(zhǎng)的健壯小植株，移植到由2/3砂和1/3腐熟細(xì)土組成培養(yǎng)土的栽培容器中，移植成活并培育植株至成熟，在生長(zhǎng)過(guò)程中根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)鑒別多倍體水稻植株。
從上面看出，本發(fā)明應(yīng)用試驗(yàn)材料與以往的多倍體水稻研究有明顯不同(1)應(yīng)用未成熟或成熟的種子、生長(zhǎng)發(fā)育中的幼穗和抽穗后帶節(jié)的莖段為材料，突破了通常水稻多倍體誘導(dǎo)主要用分蘗期幼苗的局限，拓寬了應(yīng)用材料的類(lèi)型，在水稻從種子發(fā)育、小苗生長(zhǎng)至抽穗開(kāi)花的全生育過(guò)程中都可以作為試材，經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)和秋水仙素處理而形成多倍體植株，即在第一階段(種子)未加倍成功的情況下，可在第二階段(幼穗)進(jìn)行處理，在第一、第二階段未成功的情況下用第三階段(莖段)處理，確保少數(shù)種源能夠加倍形成多倍體；(2)擴(kuò)大應(yīng)用的范圍。改變了原來(lái)多倍體誘導(dǎo)僅在亞洲栽培稻中應(yīng)用的狀態(tài)，把該方法應(yīng)用于亞洲栽培稻的秈稻、粳稻和爪哇稻品種、秈粳亞種雜種、非洲栽培稻品種、亞洲栽培稻與非洲栽培稻種間雜種、非洲野生稻等A基因組野生稻及其它非A基因組的野生稻物種、以及栽培稻與野生稻雜種的多倍體誘導(dǎo)形成。(3)同時(shí)也可以看出，本發(fā)明優(yōu)化了組織培養(yǎng)方法。
稻屬不同物種的組織培養(yǎng)反應(yīng)存在著明顯的差異性。一般講，栽培稻比野生稻更易組織培養(yǎng)，A基因組野生稻比非A基因組野生稻較易培養(yǎng)，從而在培養(yǎng)容易程度上表現(xiàn)出一個(gè)基本趨勢(shì)，即粳稻＞爪哇稻＞秈稻＞A基因組野生稻＞非A基因組野生稻。由于以前的研究?jī)H針對(duì)秈稻、粳稻的組織培養(yǎng)的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)基已不能適應(yīng)于更多種類(lèi)稻種的組織培養(yǎng)和多倍體誘導(dǎo)形成。所以在以種子和幼穗作外植體時(shí)，采用愈傷組織誘導(dǎo)，秋水仙素液體培養(yǎng)加倍，繼代培養(yǎng)，分化出芽培養(yǎng)，生根培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)等六個(gè)培養(yǎng)階段；在以莖段為外植體時(shí)，采用叢芽誘導(dǎo)和增殖，秋水仙素液體培養(yǎng)加倍，繼代培養(yǎng)，叢芽生長(zhǎng)、生根培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)六個(gè)培養(yǎng)階段。誘導(dǎo)形成愈傷組織的種子可以是未成熟種子，也可以是成熟種子，幼穗以第二次枝梗至雌雄蕊形成時(shí)期為佳，莖段必須帶節(jié)，即含有潛伏芽的下部節(jié)段。
誘導(dǎo)種子或幼穗形成愈傷組織的培養(yǎng)基是N6(MS)+2，4-D 1～2.5mg/l+NAA 1～2mg/l+6BA(KT)0.1～0.5mg/l+蔗糖5～6％+水解酪蛋白50～150mg/l+瓊脂0.65-0.75％，pH5.8-6.2。較易培養(yǎng)的粳稻、秈稻品種和雜種采用濃度較低的含量，而較難培養(yǎng)的野生稻采用較高濃度的組合，在25-30℃、黑暗或800-10001x下培養(yǎng)25-45天形成愈傷組織。兩種類(lèi)型的生長(zhǎng)素類(lèi)組合更有利于愈傷組織的形成，而低濃度的細(xì)胞分裂素的添加使愈傷組織生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)更有利于后續(xù)的分化培養(yǎng)。
多叢芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是2/3 MS+6BA 1-3mg/l+KT 2-3mg/l+NAA0.2-0.5mg/l+多效唑3-5mg/l+蔗糖2％+瓊脂0.65-0.75％，pH5.8-6.2。
在秋水仙素處理誘導(dǎo)形成多倍體中，本發(fā)明采用液體振蕩持續(xù)培養(yǎng)是將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷組織和多叢芽轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞染色體加倍，增加了秋水仙素進(jìn)入細(xì)胞中的機(jī)會(huì)，提高多倍體形成頻率。既提高了加倍效果，又減少了秋水仙素用量。
本發(fā)明與以前的活體(即自然條件下的完整植株)多倍體水稻誘導(dǎo)技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1.拓寬了試驗(yàn)材料，使水稻發(fā)育的全過(guò)程中的重要器官----種子、幼穗和莖段(包含有潛伏芽)都可以用作誘導(dǎo)多倍體的材料，從三個(gè)層次上保證用少數(shù)材料就能夠誘導(dǎo)出多倍體。
2.根據(jù)不同水稻材料的特點(diǎn)，在培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式等方面優(yōu)化培養(yǎng)技術(shù)，不僅使栽培稻品種和雜種能夠用于多倍體誘導(dǎo)，而且野生稻、栽培稻x野生稻雜種也能夠用于多倍體誘導(dǎo)，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。
3.采用組織培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合的技術(shù)，發(fā)揮了組織培養(yǎng)大量增殖細(xì)胞增殖芽的優(yōu)勢(shì)，以及在液體培養(yǎng)基中添加秋水仙素在持續(xù)培養(yǎng)中進(jìn)行加倍處理，既使秋水仙素能夠充分地與細(xì)胞相接觸發(fā)揮效用，提高了形成多倍體的頻率，由活體處理的5-10％的加倍頻率，提高到46.7％，最高達(dá)75.0％；而且降低了秋水仙素的濃度。本發(fā)明僅用0.05-0.07％的秋水仙素，而以前大多數(shù)多倍體植株誘導(dǎo)使用濃度為0.2-0.3％。
4.在常規(guī)條件下的秋水仙素處理后的水稻種苗成活率低是活體植物誘導(dǎo)多倍體的主要問(wèn)題之一。本發(fā)明采用無(wú)菌條件下的誘導(dǎo)、分化、生根、壯苗培養(yǎng)等系列培養(yǎng)措施，不僅使水稻小苗加倍的效率提高，而且使已加倍的小植株能夠在試管中健壯成長(zhǎng)，并能夠高成活率地移植到培養(yǎng)容器中，直至長(zhǎng)成成熟水稻植株。
5.克服了活體植株多倍體誘導(dǎo)主要產(chǎn)生多倍體和二倍體嵌合水稻植株的缺點(diǎn)。由于活體植株多倍體誘導(dǎo)應(yīng)用的主要是發(fā)芽中的種苗，或者分蘗秧苗，其生長(zhǎng)點(diǎn)部位有正在分裂的細(xì)胞和未分裂的細(xì)胞，分裂的細(xì)胞受秋水仙素抑制而形成多倍體細(xì)胞，它與未發(fā)生改變的二倍體細(xì)胞一起發(fā)育而形成嵌合體植株，而且往往是二倍體占優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明利用秋水仙素處理旺盛發(fā)育中的愈傷組織和多叢芽原基與完整植株有明顯不同。愈傷組織中的許多細(xì)胞加倍后可以以單個(gè)細(xì)胞起源的方式獨(dú)立地分化出芽、生長(zhǎng)成完整的多倍體水稻，很少有嵌合體現(xiàn)象；多叢芽原基中的生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞在持續(xù)液體培養(yǎng)處理下，絕大多數(shù)細(xì)胞被加倍成四倍體了，因而在隨后的增殖生長(zhǎng)中形成完整的多倍體植株，也很少有嵌合體現(xiàn)象。
具體實(shí)施例方式
應(yīng)用本發(fā)明方法，我們已經(jīng)成功地將亞洲栽培稻，包括秈稻、粳稻、爪哇稻品種以及它們之間的雜種，尤其包括二系不育系和恢復(fù)系，帶廣親和基因品種，帶對(duì)除草劑敏感基因的二系不育系品系，非洲栽培稻，非洲野生稻，以及亞洲栽培稻與非洲野生稻雜種、亞洲栽培稻與藥用野生稻雜種(AACC)、亞洲栽培稻與小粒野生稻雜種(AABBCC)、亞洲栽培稻與疣粒野生稻雜種(AAGG)等誘導(dǎo)加倍形成多倍體。使加倍的水稻品系、品種、雜種、野生稻物種及雜種等已達(dá)152多個(gè)，實(shí)現(xiàn)了栽培稻品種間、亞種間、種間、栽培稻野生稻種間、栽培稻野生稻基因組間雜種多倍體的成龍配套，為進(jìn)行水稻基因組進(jìn)化與遺傳的理論研究和進(jìn)行超級(jí)稻和超級(jí)雜交稻育種奠定了堅(jiān)實(shí)的材料基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例及效果見(jiàn)附表。
附表應(yīng)用“組織培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合高效率培育水稻多倍體”實(shí)施例及技術(shù)效果。



*利用此技術(shù)已獲得152個(gè)多倍體品種、物種和雜種，在一些僅有1-2個(gè)再生植株的未統(tǒng)計(jì)在此表中。此表共列出73個(gè)品種、物種和雜種，其中二系雜交稻的不育系16個(gè)、秈稻12、粳稻6個(gè)、爪哇稻2個(gè)、非洲稻1個(gè)、非洲野生稻1個(gè)、秈稻品種間雜種1個(gè)、粳稻品種間雜種1個(gè)、秈粳亞種間雜種14個(gè)、爪粳亞種雜種1個(gè)、栽培稻/A基因組野生稻種間雜種9個(gè)、A基因組野生稻種間雜種1個(gè)、非A基因組野生稻5個(gè)、栽培稻/非A基因組間雜種3個(gè)；外植體是種子的18個(gè)、幼穗49個(gè)、莖節(jié)6個(gè)。
注①對(duì)除草劑苯達(dá)松敏感型；②典型秈稻和粳稻測(cè)試品種；③廣親和品種。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)組織培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合，高效率培育多倍體水稻的方法，采用水稻種子和幼穗作外植體，其特征在于需經(jīng)過(guò)以下七個(gè)培養(yǎng)階段a、愈傷組織誘導(dǎo)，b、秋水仙素液體培養(yǎng)基加倍，c、繼代培養(yǎng)，d、分化出芽培養(yǎng)，e、生根培養(yǎng)，f、壯苗培養(yǎng)，g、育苗成熟及多倍體植株鑒定。
2.一種通過(guò)組織培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合，高效率培育多倍體水稻的方法，采用水稻莖段(帶節(jié)含有潛伏芽)為外植體，其特征在于需經(jīng)過(guò)以下七個(gè)培養(yǎng)階段a、叢芽誘導(dǎo)和增殖，b、秋水仙素液體培養(yǎng)加倍，c、繼代培養(yǎng)，d、叢芽生長(zhǎng)，e、生根培養(yǎng)，f、壯苗培養(yǎng)，g、育苗成熟及多倍體植株鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率培育多倍體水稻的方法，其特征在于a、愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程為，將栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種種子或幼穗經(jīng)消毒處理后接種于N6(或MS)+2，4-D 1～2.5mg/l+NAA 1～2mg/l+6BA(或KT)0.1～0.5mg/l+蔗糖5～6％+水解酪蛋白50～150mg/l+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25～30℃、黑暗或光照800～10001x下培養(yǎng)25～45天而形成愈傷組織；b、秋水仙素液體培養(yǎng)基加倍過(guò)程為，將在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中形成的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的愈傷組織轉(zhuǎn)入到N6(或MS)+2，4-D 1～2.5mg/l+NAA 1～2mg/l+6BA(或KT)0.1-0.5mg/l+秋水仙素500-700mg/l+蔗糖3～5％+水解酪蛋白100mg/l、pH5.8～6.2的加倍培養(yǎng)基中，在20～22℃、95～105rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)40～48小時(shí)；c、繼代培養(yǎng)過(guò)程為，將加倍處理的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的愈傷組織經(jīng)無(wú)菌水充分洗滌后轉(zhuǎn)入與上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，在溫度25～30℃、黑暗或光照600～1000 1x下繼代培養(yǎng)7-10天；d、分化出芽培養(yǎng)過(guò)程為，將繼代后的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的愈傷組織轉(zhuǎn)入到MS+6BA1～2mg/l+KT 2～3mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+水解酪蛋白100～200mg/l+蔗糖3％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的分化培養(yǎng)基中，在25～30℃、光照1500～2000 1x下分化培養(yǎng)20～45天，分化出水稻芽苗；e、生根培養(yǎng)過(guò)程為，將經(jīng)愈傷組織分化培養(yǎng)出的水稻芽苗轉(zhuǎn)入1/2MS+6BA 0.1～0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～03mg/l+IAA 0.5～1mg/l+水解酪蛋白100mg/l+活性碳0.03％+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的生根培養(yǎng)基中生根，長(zhǎng)出完整小植株；f、壯苗培養(yǎng)過(guò)程為，將水稻完整小植株轉(zhuǎn)入1/2 MS+6BA 0.5mg/l+KT0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+多效唑3～5mg/l+水解酪蛋白100～200mg/l+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的壯苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)成健壯的小植株；g、育苗成熟及多倍體植株鑒定過(guò)程為，將壯苗培養(yǎng)生長(zhǎng)的健壯小植株，移植到由2/3砂和1/3腐熟細(xì)土組成培養(yǎng)土栽培容器中，移植成活并培育植株至成熟，在生長(zhǎng)過(guò)程中，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征(有芒、大粒、葉增大厚、莖桿變粗)和細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)(葉片氣孔增大、根尖染色體成倍增加)鑒別多倍體水稻植株。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效率培育多倍體水稻的方法，其特征在于a、叢芽誘導(dǎo)和增殖過(guò)程為，將栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種植株的莖段經(jīng)消毒處理后接種到2/3MS+6BA 1～3mg/l+KT 2～3mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+多效唑3～5mg/l+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的誘導(dǎo)多叢芽培養(yǎng)基中，在25～30℃、光照1500～2000 1x下培養(yǎng)10～30天而形成多叢芽；b、秋水仙素液體培養(yǎng)加倍過(guò)程為，將形成的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的多叢芽轉(zhuǎn)入到1/2MS+6BA 1～2mg/l+KT 2～3mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+多效唑3～5mg/l+秋水仙素500-700mg/l+蔗糖2～3％、pH5.8-6.2的加倍培養(yǎng)基中，光照500～800 1x、溫度20～22℃、轉(zhuǎn)速95～105rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)18～24小時(shí)；c、繼代培養(yǎng)過(guò)程為，將加倍處理的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的多叢芽經(jīng)無(wú)菌水充分洗滌后轉(zhuǎn)入與上述誘導(dǎo)出芽培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，在溫度25～30℃、光照1500～2000 1x下繼代培養(yǎng)7～10天；d、叢芽生長(zhǎng)過(guò)程為，將繼代培養(yǎng)的栽培稻、野生稻、栽培稻×野生稻雜種的多叢芽經(jīng)無(wú)菌水充分洗滌后轉(zhuǎn)入到1/2MS+6BA 1-2mg/l+KT 2-3mg/l+NAA0.2-0.5mg/l+多效唑3-5mg/l+水解酪蛋白100-200mg/l+蔗糖2％+瓊脂0.65-0.75％、pH5.8-6.2的培養(yǎng)基中，在光照1500-2000 1x、溫度25-30℃下培養(yǎng)出多叢芽苗；e、生根培養(yǎng)過(guò)程為，將多叢芽苗轉(zhuǎn)入1/2MS+6BA 0.1～0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+IAA 0.5～1mg/l+水解酪蛋白100mg/l+活性碳0.03％+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的生根培養(yǎng)基中生根，長(zhǎng)出完整小植株；f、壯苗培養(yǎng)過(guò)程為，將來(lái)源于多叢芽增殖形成的水稻完整小植株轉(zhuǎn)入1/2MS+6BA 0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+多效唑2～3mg/l+水解酪蛋白100～200mg/l+蔗糖2％+瓊脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的壯苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)成健壯的小植株；g、育苗成熟及多倍體植株鑒定過(guò)程為，將壯苗培養(yǎng)生長(zhǎng)的健壯小植株移植到由2/3砂和1/3腐熟細(xì)土組成培養(yǎng)土栽培容器中，移植成活并培育植株至成熟，在生長(zhǎng)過(guò)程中，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)鑒別多倍體水稻植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的高效率培育多倍體水稻的方法，其特征在于以栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種的未成熟或成熟的種子作為外植體，或者以栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種植株的第二次枝梗至雌雄蕊形成時(shí)期這個(gè)發(fā)育階段的幼穗作外植體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的高效率培育多倍體水稻的方法，其特征在于以栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻雜種植株已抽穗的莖的下部帶節(jié)的莖段為外植體。
全文摘要
一種組織培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)合高效率高質(zhì)量培育水稻多倍體的方法,包括全程應(yīng)用水稻試材、優(yōu)化愈傷組織培養(yǎng)方法、結(jié)合組織培養(yǎng)和秋水仙素處理誘導(dǎo)形成多倍體、多倍體植株的獲得、多倍體植株的鑒定和多倍體植株的培育。應(yīng)用本發(fā)明方法,已經(jīng)成功地將亞洲栽培稻,包括秈稻、粳稻、爪哇稻品種以及它們之間的雜種,誘導(dǎo)加倍形成多倍體。使加倍的水稻品系、品種、雜種、野生稻物種及雜種等已達(dá)152多個(gè),實(shí)現(xiàn)了栽培稻品種間、亞種間、種間、栽培稻野生稻種間、栽培稻野生稻基因組間雜種多倍體的成龍配套,為進(jìn)行水稻基因組進(jìn)化與遺傳的理論研究和進(jìn)行超級(jí)稻和超級(jí)雜交稻育種奠定了堅(jiān)實(shí)的材料基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1341350SQ01133529
公開(kāi)日2002年3月27日 申請(qǐng)日期2001年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月30日
發(fā)明者蔡得田 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)