專利名稱：秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法涉及一種誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，尤其是將胚性細胞經秋水仙素處理—洗滌—分化生根培養(yǎng)，從而得到突變體的組織培養(yǎng)方法。
背景技術：
秋水仙素是一種微管特異性藥物，由于適宜濃度的秋水仙素，能破壞細胞分裂時紡錘絲的形成，因此可使分生細胞復制的染色體在細胞分裂時不能分向兩極，從而導致新生細胞的染色體加倍或染色體的畸變。因此秋水仙素是有效誘導突變體的化學藥劑。
通過秋水仙素進行誘變，利用組織培養(yǎng)方法選出突變體的技術具有便于操作控制，變異率高，周期短等優(yōu)點。
楊樹是世界上分布最廣、適應性最強的樹種，以它為材料，進行突變體育種，該方法已作為國內外學者研究課題。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種利用秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，其以木本植物愈傷組織胚性細胞為誘變對象，解決木本植物因個體大不易處理和不易大量處理的困難，從而降低誘變所需成本、提高處理的精確性。
本發(fā)明目的通過下述技術方案實現(xiàn)、一種秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，將楊樹的愈傷組織胚性細胞置于秋水仙素誘變液Q-1中進行誘變處理后，置于清洗液中清洗，將清洗過的變異細胞分化壯苗，最后進行生根培養(yǎng)，其中，所述的秋水仙素誘變液Q-1為MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+秋水仙素0.05-0.5％+蔗糖20-30g/L。
在上述方案基礎上，所述的誘變處理是將愈傷組織胚性細胞置于Q-1中振蕩12-72小時，振蕩轉速60-200RPM，處理溫度為25℃±2℃。
在上述方案基礎上，所述的清洗是將秋水仙素處理過的胚性細胞轉入清洗液Q-2中，清洗12-48小時，其中，Q-2為MS+6-BA0.1-0.4mg/L+蔗糖20-30g/L。
將清洗后的胚性細胞置于培養(yǎng)基Y-2中，分化培養(yǎng)20～50天，Y-2為MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+KT 0.05-0.4mg/L+IAA 0.05-0.2mg/L+蔗糖20-30g/L+瓊脂4-8g/L。
所述的生根培養(yǎng)是在生根培養(yǎng)基M5中進行，生根培養(yǎng)20～50天，培養(yǎng)基M5為1/2MS+IBA 0.1-1.0mg/L+蔗糖20-30g/L+瓊脂3-8g/L。
所述的楊樹的愈傷組織胚性細胞的獲得方法是切取1～2mm莖段的楊樹組培苗作為外植體，用培養(yǎng)基Y-2進行分化培養(yǎng)，其中，Y-2為MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+KT 0.05-0.4mg/L+IAA 0.05-0.2mg/L+蔗糖20-30g/L+瓊脂4-8g/L，溫度為25℃±2℃，光照時間為14小時/天，培養(yǎng)1～10天，使其完全進入活躍的胚性狀態(tài)。
所述的楊樹的愈傷組織胚性細胞的獲得方法也可以是包括外植體選擇及處理、脫分化處理、再分化處理，選取楊樹組培苗1～2mm莖段為外植體，經過脫分化處理、再分化處理后，獲得愈傷組織胚性細胞。
其中，所述的脫分化培養(yǎng)基為Y-1，溫度為25℃±2℃，光照時間為14小時/天，培養(yǎng)1～10天，使其完全進入脫分化狀態(tài)。
所述的再分化養(yǎng)基為Y-2，溫度為25℃±2℃，光照時間為14小時/天，培養(yǎng)1～10天，使其完全進入活躍的胚性狀態(tài)。
所述的Y-1培養(yǎng)基為MS+2.4-D0.1-0.5mg/L+KT0.1-0.5mg/L+蔗糖20-30g/L+瓊脂4-8g/L。
本發(fā)明一種秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，是以木本植物愈傷組織胚性細胞為誘變對象，采用秋水仙素進行誘變處理，包括外植體選擇及處理、脫分化處理、采用秋水仙素誘變處理、誘變細胞的分化和生根培養(yǎng)，其中，處理，振蕩洗滌，分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明以木本植物愈傷組織胚性細胞為誘變對象，解決了木本植物因個體大不易處理和不易大量處理的困難，大大降低了誘變所需成本、提高了處理的精確性。便于操作和控制，變異率高，周期短。
具體實施例方式
實施例1秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，以木本植物愈傷組織胚性細胞為誘變對象，包括再分化培養(yǎng)，秋水仙素處理，洗滌，分化生根培養(yǎng)，其中，選取木本植物組培苗為外植體切成1～2mm莖段，經過再分化培養(yǎng)后，愈傷組織胚性細胞置于秋水仙素誘變液中進行誘變處理，接著置于清洗液中洗滌，然后置于分化培養(yǎng)基中分化壯苗，在生根培養(yǎng)基中生根。
具體步驟為第一步選取木本植物組培苗為外植體切成1～2mm莖段。
第二步胚性細胞置于培養(yǎng)基Y-2上，在溫度25℃±2℃，光照時間為14小時/天，培養(yǎng)1～10天，使其完全進入活躍的胚性狀態(tài)。該Y-2為MS+6-BA 0.2mg/L+KT 0.2mg/L+IAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L。
第三步將愈傷組織胚性細胞置于秋水仙素誘變液Q-1中進行振蕩處理，處理時間為12小時-72小時，振蕩轉速60-200RPM，處理溫度25℃±2℃。該誘變液Q-1為MS+6-BA0.1mg/L+秋水仙素0.1％+蔗糖30g/L。
第四步將處理過的胚性細胞轉入清洗液Q-2中清洗12-48小時。該清洗液Q-2為MS+6-BA0.1mg/L+蔗糖30g/L。
第五步將清洗好的胚性細胞依次轉入分化培養(yǎng)基Y-2中分化培養(yǎng)天數為20～50天，再轉入生根培養(yǎng)基M5中生根，培養(yǎng)天數為20～50天。其中，該Y-2培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2mg/L+KT0.2mg/L+IAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，該M5培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.1mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L。
實施例2秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，具體步驟為第一步選取木本植物組培苗為外植體切成1～2mm莖段。
第二步胚性細胞置于培養(yǎng)基Y-2上，在溫度25℃±2℃，光照時間為14小時/天，培養(yǎng)1～10天，使其完全進入活躍的胚性狀態(tài)。該Y-2為MS+6-BA 0.1mg/L+KT 0.4mg/L+IAA 0.1mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂8g/L。
第三步將愈傷組織胚性細胞置于秋水仙素誘變液Q-1中進行振蕩處理，處理時間為72小時，振蕩轉速60RPM，處理溫度25℃±2℃。該誘變液Q-1為MS+6-BA0.2mg/L+秋水仙素0.5％+蔗糖20g/L。
第四步將處理過的胚性細胞轉入清洗液Q-2中清洗12-48小時。該清洗液Q-2為MS+6-BA0.4mg/L+蔗糖25g/L。
第五步將清洗好的胚性細胞依次轉入分化培養(yǎng)基Y-2中分化培養(yǎng)天數為20～50天，再轉入生根培養(yǎng)基M5中生根，培養(yǎng)天數為20～50天。其中，該Y-2培養(yǎng)基為MS+6-BA0.4mg/L+KT0.05mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8g/L，該M5培養(yǎng)基為1/2MS+IBA1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂3g/L。
實施例3秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，具體步驟為第一步選取木本植物組培苗為外植體切成1～2mm莖段。
第二步胚性細胞置于培養(yǎng)基Y-2上，在溫度25℃±2℃，光照時間為14小時/天，培養(yǎng)1～10天，使其完全進入活躍的胚性狀態(tài)。該Y-2為MS+6-BA 0.4mg/L+KT 0.05mg/L+IAA 0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂4g/L。
第三步將愈傷組織胚性細胞置于秋水仙素誘變液Q-1中進行振蕩處理，處理時間為12小時，振蕩轉速200RPM，處理溫度25℃±2℃。該誘變液Q-1為MS+6-BA0.4mg/L+秋水仙素0.05％+蔗糖25g/L。
第四步將處理過的胚性細胞轉入清洗液Q-2中清洗12-48小時。該清洗液Q-2為MS+6-BA0.2mg/L+蔗糖20g/L。
第五步將清洗好的胚性細胞依次轉入分化培養(yǎng)基Y-2中分化培養(yǎng)天數為20～50天，再轉入生根培養(yǎng)基M5中生根，培養(yǎng)天數為20～50天。其中，該Y-2培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1mg/L+KT0.4mg/L+IAA0.05mg/L+蔗糖28g/L+瓊脂4g/L，該M5培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.01mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂8g/L。
實施例4一種秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，以楊樹愈傷組織胚性細胞為誘變對象，采用秋水仙素進行誘變處理，包括外植體選擇及處理、脫分化處理、再分化處理、采用秋水仙素誘變處理、誘變細胞的分化和生根培養(yǎng)，其中，誘變處理，振蕩洗滌，分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，選取木本植物組培苗為外植體切成1～2mm莖段，經過脫分化處理、再分化處理后，愈傷組織胚性細胞置于秋水仙素誘變液中進行誘變處理，接著置于清洗液中洗滌，然后置于分化培養(yǎng)基中分化壯苗，在生根培養(yǎng)基中生根。
具體步驟為第一步選取木本植物組培苗為外植體切成1～2mm莖段。
第二步外植體置于脫分化Y-1上，在溫度25℃±2℃，光照時間為14小時/天，連續(xù)培養(yǎng)7天，使其完全進入脫分化狀態(tài)。該Y-1培養(yǎng)基為MS+2.4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+蔗糖20-30g/L+瓊脂4-8g/L。
第三步外植體置于再分化培養(yǎng)基Y-2上，在溫度25℃±2℃，光照時間為14小時/天，連續(xù)培養(yǎng)3天，使其完全進入活躍的胚性狀態(tài)。該Y-2培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2mg/L+KT 0.2mg/L+IAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L。
第四步將愈傷組織胚性細胞置于秋水仙素誘變液Q-1中進行振蕩處理，處理時間為48小時，振蕩轉速60-200RPM，處理溫度25℃±2℃。該誘變液Q-1為MS+6-BA0.1mg/L+秋水仙素0.1％+蔗糖30g/L。
第五步將處理過的胚性細胞轉入清洗液Q-2中清洗48小時。該清洗液Q-2為MS+6-BA0.1mg/L+蔗糖30g/L。
第六步將清洗好的胚性細胞依次轉入分化培養(yǎng)基Y-2中分化培養(yǎng)天數為20天，再轉入生根培養(yǎng)基M5中生根，培養(yǎng)天數為30天。其中，該Y-2培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2mg/L+KT0.2mg/L+IAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，該M5培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.1mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L。
權利要求
1.一種秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，將楊樹的愈傷組織胚性細胞置于秋水仙素誘變液Q-1中進行誘變處理后，置于清洗液中清洗，將清洗過的變異細胞分化壯苗，最后進行生根培養(yǎng)，其中，所述的秋水仙素誘變液Q-1為MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+秋水仙素0.05-0.5％+蔗糖20-30g/L。
2.根據權利要求1所述的秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的誘變處理是將愈傷組織胚性細胞置于Q-1中振蕩12-72小時，振蕩轉速60-200RPM，處理溫度為25℃±2℃。
3.根據權利要求1或2所述的秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的清洗是將秋水仙素處理過的胚性細胞轉入清洗液Q-2為MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+蔗糖20-30g/L中，清洗12-48小時。
4.根據權利要求1或2所述的秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，其特征在于將清洗后的胚性細胞置于培養(yǎng)基Y-2中，分化培養(yǎng)20～50天，Y-2為MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+KT 0.05-0.4mg/L+IAA0.05-0.2mg/L+蔗糖20-30g/L+瓊脂4-8g/L。
5.根據權利要求1或2所述的秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)中在生根培養(yǎng)基M5中，生根培養(yǎng)20～50天，其中，M5培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.1-1.0mg/L+蔗糖20-30g/L+瓊脂3-8g/L。
6.根據權利要求1或2所述的秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的楊樹的愈傷組織胚性細胞的獲得方法是切取1～2mm莖段的楊樹組培苗作為外植體，用培養(yǎng)基Y-2進行分化培養(yǎng)，其中，Y-2為MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+KT 0.05-0.4mg/L+IAA0.05-0.2mg/L+蔗糖20-30g/L+瓊脂4-8g/L，溫度為25℃±2℃，光照時間為14小時/天，培養(yǎng)1～10天。
7.根據權利要求1或2所述的秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的楊樹的愈傷組織胚性細胞的獲得包括選取楊樹組培苗切取1～2mm莖段為外植體，經過培養(yǎng)基Y-1脫分化處理、再經過培養(yǎng)基Y-2再分化處理后獲得愈傷組織胚性細胞，其中，Y-1培養(yǎng)基為MS+2.4-D0.1-0.5mg/L+KT0.1-0.5mg/L+蔗糖20-30g/L+瓊脂4-8g/L。
8.根據權利要求7所述的秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的脫分化培養(yǎng)條件是，溫度為25℃±2℃，光照時間為14小時/天，培養(yǎng)1～10天。
9.根據權利要求7所述的秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的再分化培養(yǎng)條件是，溫度為25℃±2℃，光照時間為14小時/天，培養(yǎng)1～10天。
全文摘要
一種秋水仙素誘導楊樹突變體的組織培養(yǎng)方法，為將胚性細胞經秋水仙素處理——振蕩、洗滌——分化生根的組織培養(yǎng)方法，本發(fā)明是將楊樹胚性細胞置于誘變液Q－1中誘變，接著置于清洗液中清洗，然后進行分化壯苗、生根培養(yǎng)，其中，所述的秋水仙素誘變液Q－1為MS+6－BA 0.1－0.4mg/L+秋水仙素0.05－0.5％+蔗糖20－30g/L。本發(fā)明的優(yōu)點是便于操作控制，變異率高，周期短等優(yōu)點，獲得變異率高的楊樹突變群體。
文檔編號A01H4/00GK101066039SQ20071004103
公開日2007年11月7日 申請日期2007年5月22日 優(yōu)先權日2007年5月22日
發(fā)明者林煜, 章振華, 張承妹, 王凌健, 蘇敏, 宋學孟 申請人:上海光兆植物速生技術有限公司