專利名稱：薄荷同源多倍體的誘導(dǎo)和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及薄荷育種工作中的多倍體誘導(dǎo)和快速檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
薄荷(Mentha h即localyx Briq.)的莖、葉中富含揮發(fā)油，被廣泛地應(yīng)用于食品、 醫(yī)藥、化妝品、香料、煙草等工業(yè)。薄荷全草入藥，用于治療風(fēng)熱感冒、風(fēng)溫初起、頭痛、目赤、 喉痹、咽喉腫痛、口舌生瘡、牙痛、蕁麻疹、風(fēng)疹等。薄荷是我國重要的香料和藥用植物之一， 在江蘇、安徽、江西等地廣為栽培，已成為當(dāng)?shù)刂匾霓r(nóng)業(yè)特種經(jīng)濟作物。但是在薄荷生產(chǎn) 中出現(xiàn)的品種單一、品種退化現(xiàn)象，使薄荷的育種工作越來越引人注目。培育薄荷優(yōu)良新 品種，對現(xiàn)行生產(chǎn)中的品種進行更新是一項亟待開展的工作。多倍體有很多二倍體所沒有 的優(yōu)勢性狀，如植株的巨大性、抗性增加、有機合成速率加快及克服遠源雜交不育性，多倍 體育種用于薄荷的新品種選育具有良好的前景。多倍體育種在許多植物材料上已經(jīng)成功運 用，但在薄荷上的應(yīng)用尚未見報道。本發(fā)明來源于多年的研究結(jié)果，提供了一種薄荷同源多 倍體的誘導(dǎo)和檢測技術(shù)，可用于薄荷的多倍體育種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種薄荷同源多倍體的誘導(dǎo)和檢測方法。采用本方法進行 薄荷的多倍體誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率高(可達13%)，變異株成活率高(90%以上)，鑒定和擴繁同步 進行，可以大大縮短育種周期。主要內(nèi)容包括如下 1.無菌體系的建立。用薄荷莖尖做為外植體，在初代培養(yǎng)基上建立無菌體系。初 代培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+1. 0mg L-1 6-BA+0. 2mg L—、AA+5. 5g L-1瓊脂+30g L-1蔗 糖，pH5. 5 5. 8，培養(yǎng)條件為溫度25。C，光照時間8 10h/d，光照強度1500 20001x。
2.多倍體的誘導(dǎo)。取初代培養(yǎng)的無菌離體不定芽，用0. 1% 0.2%秋水仙素溶液 浸泡24 48h后，接種在不含秋水仙素的繼代培養(yǎng)基上；或取初代培養(yǎng)的無菌薄荷離體不 定芽，接種在添加20mg L—1秋水仙素的繼代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的繼 代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)相同。
3.多倍體的鑒定。處理株繼代培養(yǎng)20d后，取其葉片，用流式細胞儀檢測染色體變 異狀況。 4.多倍體植株的增殖培養(yǎng)。將染色體加倍植株的離莖尖最近的前兩個帶節(jié)莖段接
種在含2. Omg L-1 6-BA+0. 2mg L-1 NAA的MS增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中含5. 5g L-1瓊脂、
30g L-1蔗糖，pH 5. 5 5. 8，培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)20d，轉(zhuǎn)接增殖2次。 5.多倍體植株的生根培養(yǎng)。將增殖苗接種在含0. 5mg L—1 6-BA+0. 2mg L—、AA
的1/2MS生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中含5. 5g L—1的瓊脂、30g L—1蔗糖，pH 5. 5 5. 8，培養(yǎng)
條件同上。 6.煉苗和成苗。生根培養(yǎng)20d后，將生根苗培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，打開瓶蓋，噴水保 濕，室溫?zé)捗? 5d，取出加倍株，洗去培養(yǎng)基，栽入填有腐殖土、珍珠巖和沙(4 :3:2)
3的穴盤內(nèi)，放在室內(nèi)遮陰保濕，3 5d后將穴盤移至田間遮陰棚內(nèi)，常規(guī)方法管理。
具體實施例方式
實施例1 :以薄荷品種'68-7'為例。 切取薄荷品種'68-7'的大田苗莖尖，肥皂水清洗15min，流水沖洗30min，75X乙醇浸泡30s， 0. 1 % HgCl2浸泡7min，無菌水沖洗3次，接種于含1. Omg L—^-BA和0. 2mg L—、AA的MS初代培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含5. 5g L—1瓊脂、30g L—1蔗糖，pH 5. 5 5. 8。培養(yǎng)條件為溫度25。C，光照時間8 10h，光照強度1500 20001x。 取初代培養(yǎng)30d后的無菌苗不定芽，置于0. 2 %秋水仙素溶液中，保持25°C ± 1 ，在轉(zhuǎn)速為90r 'min—1的搖床上浸泡24h后，用無菌水沖洗干凈，接種在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)相同。培養(yǎng)20d后，取葉片進行倍性鑒定。
倍性鑒定采用流式細胞儀測定法。取幼葉50mg，在提取緩沖液[lOOmmol L一1檸檬酸+0. 5 % (V/V)吐溫-20 (pH 2. 30)]中研成粉末，500目尼龍網(wǎng)過濾，離心(1000r m—0 ，收集沉積細胞，加入染色液[提取緩沖液+400mmol L—A^HPC^ 12H20 (pH約8. 9)+3000U mL—丄RNA酶A+10ug mL—中I]，暗處低溫下染色30min。 500目尼龍網(wǎng)過濾，濾液用Coulter Epics XL型流式細胞儀(美國Beckman公司)檢測，觀察細胞染色體是否加倍。 檢測結(jié)果顯示染色體加倍的植株即為同源多倍體。取這些植株離莖尖最近的前兩
個帶節(jié)莖段接種在含2. Omg L—1 6-BA和0. 2mg L—、AA的MS增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中含
5. 5g L-1瓊脂、30g L-1蔗糖，pH 5. 5 5. 8。培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)20d，轉(zhuǎn)接增殖2次。將增殖苗接種在含0. 5mg L—1 6-BA和0. 2mg L—、AA的1/2MS生根培養(yǎng)基上，培
養(yǎng)基中含5. 5g L—1瓊脂、30g L—1蔗糖，ra 5. 5 5. 8。培養(yǎng)條件同上。 20d后將生根苗培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，打開瓶蓋，噴水保濕，室溫?zé)捗? 5d，取出后
洗去根部培養(yǎng)基，栽入填有腐殖土、珍珠巖和沙(4 : 3 : 2)的穴盤內(nèi)，室內(nèi)放置3 5d后，
移至室外遮陰棚內(nèi)，l個月后移入大田。 實施例2 :以薄荷品種'73-8'為例。 除以下區(qū)別外，其他步驟和方法與實施例1相同。 取初代培養(yǎng)30d后的無菌苗不定芽，接種在添加20mg *L—1秋水仙素的培養(yǎng)基(同初代培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)30d后，轉(zhuǎn)移到不含秋水仙素的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d，用于倍性檢
權(quán)利要求
本發(fā)明薄荷同源多倍體的誘導(dǎo)和檢測方法，其特征在于包括以下步驟薄荷離體莖尖做為外植體在初代培養(yǎng)基上建立無菌體系，以一定濃度的秋水仙素處理離體無菌不定芽后，進行繼代培養(yǎng)，以流式細胞儀法檢測染色體倍性變化，檢測確認的染色體加倍材料經(jīng)增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗、移栽，即可獲得多倍體植株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，初代培養(yǎng)建立無菌體系的方法，其特征在于以離體莖尖做為外植體；初代培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+1. 0mg L—VBA+O. 2mg L—、AA+5. 5g L-1瓊脂 +30g *L—1蔗糖，pH 5. 5 5. 8 ;培養(yǎng)條件為溫度25。C，光照時間8 lOh，光照強度1500 20001x。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，秋水仙素處理方法，其特征在于秋水仙素處理的材料為組織培養(yǎng)的離體不定芽；用O. 1% 0. 2X秋水仙素溶液浸泡24 48h后，接種在不含秋水仙素 的繼代培養(yǎng)基上；或取初代培養(yǎng)的無菌薄荷離體不定芽，接種在添加20mg L—1秋水仙素的 繼代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的培養(yǎng) 基、培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)相同。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述，多倍體的鑒定方法，其特征在于經(jīng)秋水仙素處理的材料在繼 代培養(yǎng)20d后，取葉片，用流式細胞儀進行倍性檢測。染色體加倍的試管苗即為同源多倍 體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，倍性材料的增殖方法，其特征在于增殖培養(yǎng)基為MS基本培 養(yǎng)基+2. Omg L—VBA+O. 2mg L—、AA+5. 5g L—1瓊脂+30g L—1蔗糖，pH 5. 5 5. 8 ;培養(yǎng) 條件為溫度25t:，光照時間8 lOh，光照強度1500 20001x ;培養(yǎng)20d，轉(zhuǎn)接增殖2次。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，倍性材料的生根培養(yǎng)方法，其特征在于生根培養(yǎng)基為1/2MS +0. 5mg *L—VBA+O. 2mg *L—^AA+5. 5g *L—1的瓊月旨+30g *L—1蔗糖，pH 5. 5 5. 8 ;培養(yǎng)條件為 溫度25。C，光照時間8 lOh，光照強度1500 20001x ;培養(yǎng)20d。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，煉苗和成苗的方法，其特征在于將生根苗培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng) 室，打開瓶蓋，噴水保濕，室溫?zé)捗? 5d，取出后洗去根部培養(yǎng)基，栽入填有腐殖土、珍珠 巖和沙(4 :3:2)的穴盤內(nèi)，室內(nèi)放置3 5d后，移至室外遮陰棚內(nèi)，l個月后移入大田。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用薄荷離體莖尖誘導(dǎo)同源多倍體的技術(shù)，可用于薄荷的多倍體育種。其關(guān)鍵技術(shù)在于通過秋水仙素處理濃度、時間和方法的控制，在短時間內(nèi)獲得大量薄荷同源多倍體植株，并采用流式細胞儀法進行倍性檢測。采用本方法進行薄荷的多倍體誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率較高(可達15％)，變異株成活率高(90％以上)，鑒定方法簡單易行，可以大大縮短薄荷育種周期。
文檔編號A01H4/00GK101790961SQ201010017950
公開日2010年8月4日 申請日期2010年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月18日
發(fā)明者于盱, 劉艷, 李維林, 梁呈元 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所