本發(fā)明屬于中藥材組培技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種白芨體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及成苗方法。

背景技術(shù)：

白芨又名白根、地螺絲、白雞娃、羊角七、紫蘭、刀口藥、連及草等，為蘭科白芨屬植物白芨的干燥塊莖。白芨性溫、味苦、甘、辛，藥用價(jià)值較高，具有補(bǔ)肺、止血、散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿、生肌、斂瘡的功能，主要用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、 鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶、肺傷咳血、衄血、金瘡出血、癰疽腫毒、潰瘍疼痛、湯火灼傷、手足皺裂等， 是我國(guó)民間的傳統(tǒng)中藥。白芨除了具有重要的藥用價(jià)值外，還應(yīng)用于保健食品、紡織印染、特種涂料、日用化工等各行業(yè)領(lǐng)域，需求量日趨增多，現(xiàn)已被列入《瀕危動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》予以保護(hù)。

白芨的繁殖有有性繁殖和無(wú)性繁殖兩種，在有性繁殖中，由于白芨種子培育過(guò)程煩瑣，生長(zhǎng)速度慢，出苗率低，在自然狀態(tài)下極少能萌發(fā)成苗。白芨的無(wú)性繁殖主要利用地下假鱗莖和地上莖進(jìn)行繁殖，但是長(zhǎng)期的無(wú)性假鱗莖和地上莖繁殖，假鱗莖和地上莖中容易滋生真菌和積累病毒，在進(jìn)行組培苗時(shí)，組培苗容易被污染，導(dǎo)致繁殖速度減慢，成苗率低，品種種性退化的問(wèn)題。

白芨除了利用假鱗莖和地上莖進(jìn)行無(wú)性繁殖外，還可以利用莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)和無(wú)菌實(shí)生苗進(jìn)行無(wú)性繁殖，該繁殖方法取材料較難，且該方法從脫分化、原球莖增殖、分化、煉苗至大田移栽周期至少需要24個(gè)月，培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)，且培養(yǎng)期間需要更換8-10次培養(yǎng)基，工作量大，成本高，一般的藥材種植企業(yè)和藥農(nóng)無(wú)法承擔(dān)高昂的種植成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中白芨的無(wú)性繁殖存在繁殖速度慢、培養(yǎng)周期長(zhǎng)、成本高、地下假鱗莖和地上莖等外植體中容易滋生真菌和積累病毒，造成品種種性退化的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種白芨體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及成苗方法，具體方案包括以下步驟：

（1）種子準(zhǔn)備：選用未開(kāi)裂的白芨新鮮蒴果里的種子作為體細(xì)胞胚誘導(dǎo)體，蒴果用洗衣粉或肥皂洗凈，洗干凈后，將蒴果放于超凈工作臺(tái)上的燒杯中，燒杯中加入75%的乙醇浸泡5 min，浸泡結(jié)束后，用無(wú)菌水沖洗蒴果3～4遍，沖洗結(jié)束后，將蒴果放到滅菌的培養(yǎng)皿中進(jìn)行吹風(fēng)，待蒴果被吹干后，剖開(kāi)蒴果，留取種子，得到白芨體細(xì)胞胚誘導(dǎo)體，備用；

（2）培養(yǎng)基準(zhǔn)備：在容量為1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸餾水，20000~30000 mg的硫代硫酸鈉，100~150 mg的維生素C，1.0~5.0 mg的活性炭，1.0~10 mg的氯化鈉和30000 mg的蔗糖，60~80 g的香蕉，100~120 mL的椰乳，最后再加蒸餾水使容量瓶的液體體積達(dá)到1 L，配制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH值在5.4~5.8之間；將配好的培養(yǎng)基按250 mL/瓶分裝至培養(yǎng)瓶中，放入高溫滅菌鍋中滅菌25 min，溫度控制在121 ℃，備用；

（3）實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)：在超凈工作臺(tái)里按無(wú)菌操作要求打開(kāi)（2）步驟中經(jīng)過(guò)高溫滅菌的培養(yǎng)瓶的瓶蓋，用鑷子夾?。?）步驟中得到種子并伸進(jìn)培養(yǎng)瓶口，用鑷子尖后部在瓶口輕輕敲擊，使得種子均勻撒落在培養(yǎng)基上，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶拿出超凈工作臺(tái)，將裝有種子的培養(yǎng)瓶放于細(xì)胞振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩暗培養(yǎng)，振蕩速度為100 r/min，培養(yǎng)的溫度控制在20~25 ℃之間，培養(yǎng)到第5 d，種子吸水、種皮充脹，此時(shí)，向培養(yǎng)瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20~25 mL；此后，每間隔10 d向培養(yǎng)基中添加同量的白砂糖溶液；培養(yǎng)到種子的種皮脹裂時(shí)，向培養(yǎng)瓶中添加0.1~0.5 mg/L甲硫達(dá)嗪浸泡種皮，進(jìn)行愈傷組織上分化出體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，即原球莖的誘導(dǎo)；此后進(jìn)行光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2500 lx，光照時(shí)間為12 h/d；培養(yǎng)到50 d，種皮破裂處可見(jiàn)大量的愈傷組織，愈傷組織上分化出體細(xì)胞胚，即原球莖；培養(yǎng)到60 d，原球莖胚芽開(kāi)始萌發(fā)，可見(jiàn)胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)，停止振蕩培養(yǎng)，得到培養(yǎng)物；

（4）大棚煉苗培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)60 d的培養(yǎng)物和培養(yǎng)基倒入食物攪拌器中，低頻攪拌打散20~30 min，轉(zhuǎn)速控制在300 r/min，然后用孔徑為0.3 cm × 0.3 cm的噴壺將攪拌后的培養(yǎng)物和培養(yǎng)基均勻噴撒于苗盤內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每間隔7 d，向噴撒有外植體的苗盤內(nèi)噴曬0.01~0.1 mg/L的激動(dòng)素，噴曬至基質(zhì)潮濕；苗盤培養(yǎng)到30 d，可見(jiàn)白芨幼苗長(zhǎng)出一對(duì)綠色真葉；苗盤培養(yǎng)到60~90 d，白芨幼苗長(zhǎng)出3~4對(duì)真葉，此時(shí)將幼苗取出，按5 cm × 5 cm間距的間距移至大棚內(nèi)進(jìn)行栽種；大棚內(nèi)栽種90 d，白芨幼苗莖壯根粗，此時(shí)可移栽到大田。

采用本技術(shù)方案的有益效果是：

1、白芨的培養(yǎng)基中含有硫代硫酸鈉、維生素C、活性炭、氯化鈉、蔗糖、香蕉、椰乳、蒸餾水，其營(yíng)養(yǎng)成份搭配比例合理，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，符合白芨生長(zhǎng)的需要，同時(shí)，白芨的原球莖培養(yǎng)物在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)和大棚內(nèi)煉苗培養(yǎng)的過(guò)程中，分別定期追加了白砂糖、甲硫達(dá)嗪和激動(dòng)素，大大促進(jìn)了白芨胚性愈傷組織的生長(zhǎng)、分裂和體細(xì)胞胚形成效率，提高了繁殖效率；

2、一般白芨的組織培養(yǎng)育苗到大田移栽需要24個(gè)月，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，生產(chǎn)成本較高，本發(fā)明利用種子的種皮破裂處產(chǎn)生的胚性愈傷組織形成體細(xì)胞胚，即原球莖，培養(yǎng)白芨種苗，從繁殖到大棚內(nèi)煉苗培養(yǎng)只需8個(gè)月，有效縮短了培養(yǎng)周期，降低了生產(chǎn)成本，幼苗的培養(yǎng)成本低至0.2~0.3元；

3、本發(fā)明培養(yǎng)工序較為簡(jiǎn)單，且培養(yǎng)的白芨幼苗為無(wú)性第一代，克服了利用地下假鱗莖和地上莖等外植進(jìn)行組培育苗時(shí)容易滋生真菌和積累病毒的問(wèn)題，培養(yǎng)出來(lái)的種苗適應(yīng)性及抗逆性極強(qiáng)，幼苗成活率可達(dá)到100%，降低了組培苗污染率，提高了品種種性的穩(wěn)定性。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：一種白芨體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及成苗方法，包括以下步驟：

（1）種子準(zhǔn)備：選用未開(kāi)裂的白芨新鮮蒴果里的種子作為體細(xì)胞胚誘導(dǎo)體，蒴果用洗衣粉或肥皂洗凈，洗干凈后，將蒴果放于超凈工作臺(tái)上的燒杯中，燒杯中加入75%的乙醇浸泡5 min，浸泡結(jié)束后，用無(wú)菌水沖洗蒴果3遍，沖洗結(jié)束后，將蒴果放到滅菌的培養(yǎng)皿中進(jìn)行吹風(fēng)，待蒴果被吹干后，剖開(kāi)蒴果，留取種子，得到白芨體細(xì)胞胚誘導(dǎo)體，備用；

（2）培養(yǎng)基準(zhǔn)備：在容量為1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸餾水，20000 mg的硫代硫酸鈉，100 mg的維生素C，1.0 mg的活性炭，1.0 mg的氯化鈉和30000 mg的蔗糖，60 g的香蕉，100 mL的椰乳，最后再加蒸餾水使容量瓶的液體體積達(dá)到1 L，配制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH值為5.4；將配好的培養(yǎng)基按250 mL/瓶分裝至培養(yǎng)瓶中，放入高溫滅菌鍋中滅菌25 min，溫度控制在121 ℃，備用；

（3）實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)：在超凈工作臺(tái)里按無(wú)菌操作要求打開(kāi)（2）步驟中經(jīng)過(guò)高溫滅菌的培養(yǎng)瓶的瓶蓋，每瓶培養(yǎng)瓶中加入的種子量為5個(gè)蒴果里面的種子量，加入種子時(shí)，用鑷子夾?。?）步驟中得到的種子并伸進(jìn)培養(yǎng)瓶口，用鑷子尖后部在瓶口輕輕敲擊，使得種子均勻撒落在培養(yǎng)基上，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶拿出超凈工作臺(tái)，將裝有種子的培養(yǎng)瓶放于細(xì)胞振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩暗培養(yǎng)，振蕩速度為100 r/min，培養(yǎng)的溫度控制在20 ℃之間，培養(yǎng)到第5 d，種子吸水、種皮充脹，此時(shí)，向培養(yǎng)瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20 mL；此后，每間隔10 d向培養(yǎng)基中添加同量的白砂糖溶液；培養(yǎng)到種子的種皮脹裂時(shí)，向培養(yǎng)瓶中添加0.1 mg/L甲硫達(dá)嗪浸泡種皮，進(jìn)行愈傷組織上分化出體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，即原球莖的誘導(dǎo)；此后進(jìn)行光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2500 lx，光照時(shí)間為12 h/d；培養(yǎng)到50 d，種皮破裂處可見(jiàn)大量的愈傷組織，愈傷組織上分化出體細(xì)胞胚，即原球莖；培養(yǎng)到60 d，原球莖胚芽開(kāi)始萌發(fā)，可見(jiàn)胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)，停止振蕩培養(yǎng)，得到培養(yǎng)物；

（4）大棚煉苗培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)60 d的培養(yǎng)物和培養(yǎng)基倒入食物攪拌器中，低頻攪拌打散20 min，轉(zhuǎn)速控制在300 r/min，然后用孔徑為0.3 cm × 0.3 cm的噴壺將攪拌后的培養(yǎng)物和培養(yǎng)基均勻噴撒于苗盤內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每間隔7 d，向噴撒有外植體的苗盤內(nèi)噴曬0.01 mg/L的激動(dòng)素，噴曬至基質(zhì)潮濕；苗盤培養(yǎng)到30 d，可見(jiàn)白芨幼苗長(zhǎng)出一對(duì)綠色真葉；苗盤培養(yǎng)到60 d，白芨幼苗長(zhǎng)出3對(duì)真葉，此時(shí)將幼苗取出，按5 cm × 5 cm間距的間距移至大棚內(nèi)進(jìn)行栽種；大棚內(nèi)栽種90 d，白芨幼苗莖壯根粗，此時(shí)可移栽到大田。

實(shí)施例2：一種白芨體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及成苗方法，具體方案包括以下步驟：

（1）種子準(zhǔn)備：選用未開(kāi)裂的白芨新鮮蒴果里的種子作為體細(xì)胞胚誘導(dǎo)體，蒴果用洗衣粉或肥皂洗凈，洗干凈后，將蒴果放于超凈工作臺(tái)上的燒杯中，燒杯中加入75%的乙醇浸泡5 min，浸泡結(jié)束后，用無(wú)菌水沖洗蒴果4遍，沖洗結(jié)束后，將蒴果放到滅菌的培養(yǎng)皿中進(jìn)行吹風(fēng)，待蒴果被吹干后，剖開(kāi)蒴果，留取種子，得到白芨體細(xì)胞胚誘導(dǎo)體，備用；

（2）培養(yǎng)基準(zhǔn)備：在容量為1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸餾水，30000 mg的硫代硫酸鈉，150 mg的維生素C，5.0 mg的活性炭10 mg的氯化鈉和30000 mg的蔗糖，80 g的香蕉，120 mL的椰乳，最后再加蒸餾水使容量瓶的液體體積達(dá)到1 L，配制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH值在5.8之間；將配好的培養(yǎng)基按250 mL/瓶分裝至培養(yǎng)瓶中，放入高溫滅菌鍋中滅菌25 min，溫度控制在121 ℃，備用；

（3）實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)：在超凈工作臺(tái)里按無(wú)菌操作要求打開(kāi)（2）步驟中經(jīng)過(guò)高溫滅菌的培養(yǎng)瓶的瓶蓋，每瓶培養(yǎng)瓶中加入的種子量為5個(gè)蒴果里面的種子量，加入種子時(shí)，用鑷子夾取（1）步驟中得到種子并伸進(jìn)培養(yǎng)瓶口，用鑷子尖后部在瓶口輕輕敲擊，使得種子均勻撒落在培養(yǎng)基上，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶拿出超凈工作臺(tái)，將裝有種子的培養(yǎng)瓶放于細(xì)胞振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩暗培養(yǎng)，振蕩速度為100 r/min，培養(yǎng)的溫度控制在25 ℃，培養(yǎng)到第5 d，種子吸水、種皮充脹，此時(shí)，向培養(yǎng)瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20 mL；此后，每間隔10 d向培養(yǎng)基中添加同量的白砂糖溶液；培養(yǎng)到種子的種皮脹裂時(shí)，向培養(yǎng)瓶中添加0.5 mg/L甲硫達(dá)嗪浸泡種皮，進(jìn)行愈傷組織上分化出體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，即原球莖的誘導(dǎo)；此后進(jìn)行光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2500 lx，光照時(shí)間為12 h/d；培養(yǎng)到50 d，種皮破裂處可見(jiàn)大量的愈傷組織，愈傷組織上分化出體細(xì)胞胚，即原球莖；培養(yǎng)到60 d，原球莖胚芽開(kāi)始萌發(fā)，可見(jiàn)胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)，停止振蕩培養(yǎng)，得到培養(yǎng)物；

（4）大棚煉苗培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)60 d的培養(yǎng)物和培養(yǎng)基倒入食物攪拌器中，低頻攪拌打散30 min，轉(zhuǎn)速控制在300 r/min，然后用孔徑為0.3 cm × 0.3 cm的噴壺將攪拌后的培養(yǎng)物和培養(yǎng)基均勻噴撒于苗盤內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每間隔7 d，向噴撒有外植體的苗盤內(nèi)噴曬0.1 mg/L的激動(dòng)素，噴曬至基質(zhì)潮濕；苗盤培養(yǎng)到30 d，可見(jiàn)白芨幼苗長(zhǎng)出一對(duì)綠色真葉；苗盤培養(yǎng)到90 d，白芨幼苗長(zhǎng)出4對(duì)真葉，此時(shí)將幼苗取出，按5 cm × 5 cm間距的間距移至大棚內(nèi)進(jìn)行栽種；大棚內(nèi)栽種90 d，白芨幼苗莖壯根粗，此時(shí)可移栽到大田。