一種生物相容性良好的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種生物相容性良好的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì) 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展非常注重以細(xì)胞為基礎(chǔ)的研究，包括細(xì)胞內(nèi)生物大分子的組 成和變化規(guī)律。一方面關(guān)于分子水平的研究受到重視，另一方面關(guān)于細(xì)胞與細(xì)胞之間的相 互關(guān)系，組織、器官以及機(jī)體的賦型和功能的完成，也都是非常重要的研究?jī)?nèi)容。這樣的認(rèn) 識(shí)，促使人們更加關(guān)注位于上皮或內(nèi)皮細(xì)胞下層、結(jié)締組織細(xì)胞周?chē)?，為組織、器官甚至 整個(gè)機(jī)體的完整性提供力學(xué)支持和物理強(qiáng)度的物質(zhì)一細(xì)胞外基質(zhì)。近年來(lái)，關(guān)于細(xì)胞外基 質(zhì)的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控的研究變得非常重要。除了機(jī)體的生理功能與細(xì)胞外基質(zhì)的 關(guān)系不可或缺，細(xì)胞外基質(zhì)在各種疾病的形成和演變中也具有非常重要的作用。因此，細(xì)胞 外基質(zhì)的研究已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中非常重要的研究方向和研究?jī)?nèi)容。
[0003] 脫細(xì)胞技術(shù)就是通過(guò)脫除組織細(xì)胞的方法得到無(wú)定型的胞外基質(zhì)，去除組織的移 植免疫原性，同時(shí)產(chǎn)生空間及保留相應(yīng)的生化信號(hào)，讓干細(xì)胞或者宿主相容的細(xì)胞能夠生 長(zhǎng)并重建組織。
[0004]目前國(guó)內(nèi)外常用到的脫細(xì)胞方法有機(jī)械法、酶消化法、化學(xué)去垢劑法等，只要條件 控制適度，這些方法均可制備出合乎條件的組織工程材料，但這些方法或多或少會(huì)影響胞 外基質(zhì)的生物性能。1、未交聯(lián)型的組織工程材料幾乎沒(méi)有表面張力，力學(xué)性能差，盡管有 一些工藝中復(fù)合了高分子生物材料，增加了組織工程材料的力學(xué)性能，但植入人體后，在使 用過(guò)程中，在極其復(fù)雜的人體環(huán)境中，受到各種因素的影響，會(huì)失去原有的機(jī)械強(qiáng)度。而細(xì) 胞外基質(zhì)是細(xì)胞賴(lài)以生存的微環(huán)境，基質(zhì)硬度的增加能影響DNA的復(fù)制和表達(dá)、影響干細(xì) 胞的分化方向，促進(jìn)細(xì)胞迀移、改變細(xì)胞核的形態(tài)。2、目前現(xiàn)有脫細(xì)胞技術(shù)中交聯(lián)型組織 工程材料則是通過(guò)一些化學(xué)和物理方法改性，增加胞外基質(zhì)的生物力學(xué)性能，通常都是利 用膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)X和Y位置的特殊氨基酸側(cè)鏈來(lái)進(jìn)行交聯(lián)，提高脫細(xì)胞基質(zhì)的強(qiáng)度、耐 用性和降低免疫性。然而，在交聯(lián)的同時(shí)，更重要的是交聯(lián)劑本身的毒性及其殘留成為影響 細(xì)胞相容性的一個(gè)隱性原因。3、另外，在我們產(chǎn)業(yè)化研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞技術(shù)制備 的產(chǎn)品，一個(gè)主要的問(wèn)題是細(xì)胞毒性不穩(wěn)定，不易控制。國(guó)內(nèi)已上市產(chǎn)品，未交聯(lián)型及交聯(lián) 型組織工程材料仍然存在細(xì)胞毒性不合格產(chǎn)品，雖然在脫細(xì)胞技術(shù)制備工藝中已經(jīng)過(guò)磷酸 鹽緩沖液和純化水大量洗滌，但仍有細(xì)胞毒性。目前幾乎所有的生物材料都必須通過(guò)相關(guān) 實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其是否具有良好的生物相容性，以確保生物材料安全地應(yīng)用于人體組織。其中 最常用的就是細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，它也是最敏感的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之一。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是指應(yīng)用體 外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，通過(guò)檢測(cè)材料或者其浸提液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)細(xì)胞的毒 性，通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量改變初步判斷材料是否具有毒性，是檢測(cè)生物相容性的一種 快速、價(jià)廉、重復(fù)性好的方法。動(dòng)物源性生物材料本身所含生物大分子的復(fù)雜性，原材料 經(jīng)過(guò)復(fù)雜的加工過(guò)程時(shí)，其中還可能添加很多輔助作用的化學(xué)試劑，樣品的初始污染菌數(shù) 量、內(nèi)毒素含量以及酸堿度等，每一環(huán)節(jié)都有可能產(chǎn)生毒性作用。
[0005] 理想的脫細(xì)胞技術(shù)制備的樣品，應(yīng)該具有優(yōu)越的生物相容性、可降解性及具備一 定的機(jī)械強(qiáng)度。因此在現(xiàn)有脫細(xì)胞制備技術(shù)中，怎樣解決既要完全脫除細(xì)胞等抗原成分，又 能最大限度的保留胞外基質(zhì)等有用成分，在工藝產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中優(yōu)化脫細(xì)胞組織工程材料的 機(jī)械性能并且保證其良好、穩(wěn)定的組織相容性，是我們要解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種生物相容性良好的異種 脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，通過(guò)該方法制備得到的組織工程材料細(xì)胞毒性穩(wěn)定，細(xì)胞相 容性更好。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為： 一種生物相容性良好的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其具體包括如下步驟： (1) 制備斷層皮片 取0. 1-2. Omm厚的動(dòng)物斷層皮片，裁成長(zhǎng)、寬、高所需尺寸，PBS液洗滌，0. 1%(質(zhì)量體積 比(質(zhì)量體積比g/l〇〇ml))新潔爾滅去脂，再用PBS液洗滌； (2) 分離表皮和真皮 將步驟（1)得到的斷層皮片用0. 1%~0. 3% (質(zhì)量體積比g/100ml)的胰蛋白酶的PBS 液在4°C -20°C下，浸泡6-36h，依次用乙醇、雙氧水和純水洗滌，洗滌，最后PBS洗滌； (3) 脫細(xì)胞處理 將步驟（2)處理后的材料先用0. 1~0. 5%(質(zhì)量體積比g/100ml)SDS水溶液洗滌1~ 6小時(shí)，再用水溶性含羥基化合物的水溶液洗滌，然后用純化水洗滌，最后PBS液洗滌； (4) 交聯(lián) 將步驟（3)處理后的材料用0. 024~0. lmol/L的交聯(lián)液交聯(lián)，按每片脫細(xì)胞動(dòng)物皮干 重對(duì)應(yīng)215ml交聯(lián)液反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，用0. lmol/L磷酸氫二鈉洗滌，再用純化水洗滌； (5) 病毒滅活 將步驟（4)處理后的材料用0. 2~I. 2mol/L氫氧化鈉浸泡30~60分鐘，純化水洗滌 至中性； (6) 精制 將步驟（5)處理后的材料用乙醇洗滌，再用純化水充分洗滌； (7) Co-60輻照滅菌 將步驟（6)處理后的材料密封在生理鹽水中，經(jīng)Co-60所產(chǎn)生的F射線輻照消毒滅菌， 即得成品。
[0008] 進(jìn)一步的，所述的PBS液的配制方法如下： NaCl 8.00g/L ； KCl 0. 20 g/L ； Na2HPO4 I. 56g/L ； KH2PO4 0. 20 g/L ； 將上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，補(bǔ)加水至1000ml，混勻。
[0009] 進(jìn)一步地，所述步驟（2)中用乙醇洗滌，為40%~75%乙醇(體積分?jǐn)?shù)）洗滌6~12 小時(shí)，3%雙氧水洗滌15分鐘。
[0010] 進(jìn)一步地，所述步驟（3)中水溶性含羥基化合物包括水溶性氨基酸類(lèi)、羧甲基殼 聚糖或水溶性醇類(lèi)，濃度為2~10% (質(zhì)量體積比g/100ml)，用水溶性含羥基化合物的水溶液 洗滌的洗滌時(shí)間為1~6小時(shí)。
[0011] 進(jìn)一步地，水溶性含羥基化合物的水溶液為乙醇溶液，優(yōu)選濃度為4%(質(zhì)量體積比 g/100ml)，洗滌時(shí)間為1~6小時(shí)。
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟（4)中的交聯(lián)液通過(guò)如下方法配置：以濃度為0. 05mol/L的 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸（MES)水溶液為交聯(lián)液溶劑，先向其中加入EDC. HCL，然后再加入 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)，所述EDC. HCL和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)的質(zhì)量比為3 :1~8 : 1，交聯(lián)液濃度為〇. 024~0. lmol/L。
[0013] 進(jìn)一步地，所述步驟（6)中用乙醇洗滌，濃度為40% (體積分?jǐn)?shù))。
[0014] 進(jìn)一步地，具體步驟如下： (1) 制備斷層皮片 取0. 1-2. Omm厚的動(dòng)物斷層皮片，裁成長(zhǎng)、寬、高所需尺寸，PBS液洗滌，0. 1%新潔爾滅 去脂，再用PBS液洗滌3-6次； (2) 分離表皮和真皮 將步驟（1)得到的斷層皮片用0. 1%~0. 3% (質(zhì)量體積比g/100ml)的胰蛋白酶的PBS 液在4°C -20°C下，浸泡16-36h，用乙醇洗滌，優(yōu)選為70%乙醇洗滌6~12小時(shí)，3%雙氧水 洗滌15分鐘，然后用PBS洗滌，3~6次，然后再用純化水洗滌12~24次，隔1小時(shí)換液； (3) 脫細(xì)胞處理 將驟（2)處理后的材