本發(fā)明屬于果樹栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種栽培藍(lán)莓的菌根真菌土的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
菌根真菌在生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)循環(huán)和物質(zhì)循環(huán)過程中扮演著重要的角色，對植物的營養(yǎng)獲取和生長等方面具有十分重要的作用。首先菌根真菌能夠促進(jìn)植物的生長，促進(jìn)植物對氮磷元素的吸收，其次菌根真菌生長及其與植物共生過程中可直接合成或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種激素類物質(zhì)，在誘導(dǎo)植物增強(qiáng)抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用。
土壤中的菌根真菌與寄主根系形成一種互惠共生體稱為菌根。研究成果證實VA菌根由于能增加植物對礦質(zhì)營養(yǎng)特別是磷元素的吸收，提高光合作用速率，對養(yǎng)分平衡和水分利用起重要作用，進(jìn)而可增強(qiáng)植物抗旱、耐鹽堿、抗低溫、抗病蟲等外部不良環(huán)境的能力，促進(jìn)植物生長并改善其品質(zhì)。叢枝菌根(AM)是菌根中分布最廣泛、最普遍的一類，叢枝菌根具有增加植物對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收、改善植物生長狀況、提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)等特性。
菌根真菌的菌絲體能夠侵入植物根系的組織和細(xì)胞中，通過其侵染達(dá)到提高植物對土壤的適應(yīng)性、促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收、改善植物水分代謝、增強(qiáng)植物耐鹽性、提高植物抗病性、改善土壤物理性狀、增加植物產(chǎn)量等作用。菌根真菌還可以分泌有機(jī)酸，促使一些不易溶解的無機(jī)和有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)養(yǎng)分從而被植物吸收。
藍(lán)莓(Vaccinium viti-idaea L.)是杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)多年生灌木。自然條件下藍(lán)莓也會與菌根真菌形成互惠共生關(guān)系，它們形成的是一種特殊的菌根結(jié)構(gòu)，即杜鵑花類菌根(又稱歐石楠類菌根)。杜鵑花類菌根可以促進(jìn)宿主植物對營養(yǎng)元素的吸收，緩解環(huán)境脅迫，增加植物生長量，增強(qiáng)植物對重金屬的抵抗能力等作用。
菌根對藍(lán)莓的營養(yǎng)吸收和生長發(fā)育有重要的生理作用。1908年，Wilson在幾種越桔屬(Vaccinium)植物的根上發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)生菌根的真菌；1910年，Coville首先觀察到所有的高叢藍(lán)莓根系均有菌根真菌寄生；Frieslehen于1936年首次從藍(lán)莓的根系中分離出了菌根真菌；1974年，Read從藍(lán)莓根系分離出一種菌根菌，研究證實菌根對藍(lán)莓生長和生理有著明顯的影響；其后，Darinka在對一年生藍(lán)莓苗移栽時接種菌根菌O.rhodogenum和O.griseum，發(fā)現(xiàn)接種植物生長更為良好，葉面積和干重均有所增加。
在自然條件下野生藍(lán)莓菌根真菌資源豐富，其侵染率可達(dá)75％，但在人工栽培條件下藍(lán)莓自身形成菌根比較困難，其菌根真菌侵染率不到3％。然而，由于野生藍(lán)莓分布的地理局限性，利用野生藍(lán)莓培養(yǎng)菌根真菌，進(jìn)行栽培藍(lán)莓的接種也受到一定的影響。杜鵑花科的植物分布廣泛且大多數(shù)植物根系都具有菌根真菌。
杜鵑花科(Ericaceae)約305屬3350種植物。分布遍及全世界，除沙漠地區(qū)外，廣布于南北半球的溫帶及北半球亞寒帶，少數(shù)屬種分布在環(huán)北極或北極，也分布于熱帶高山。我國有15屬，約757種，分布于全國各地。在我國西南部高山、亞高山的濕潤山坡，優(yōu)勢植物群落幾乎全為浩瀚的杜鵑灌叢或杜鵑--苔蘚矮曲林。杜鵑花類菌根，也稱為歐石楠類菌根，是指杜鵑花科幾個屬植物根系上形成的菌根，是內(nèi)生菌根中的一個特殊類型。除野草莓或漿果鵑屬(Arbutus)、熊果屬(Arctos taphylos)外，杜鵑花科植物都有明顯的杜鵑花類菌根共生。調(diào)查研究認(rèn)為杜鵑花科植物在世界上如此廣泛分布，而且大多生境條件惡劣，與其共生真菌有著舉足輕重的關(guān)系；菌根對杜鵑花類植物的營養(yǎng)吸收、增強(qiáng)對逆境因子的抗性等方面具有重要的作用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，促進(jìn)藍(lán)莓植物的生長，增加其對不良環(huán)境的抗性，本發(fā)明提供一種用于栽培藍(lán)莓的菌根真菌土的制備和應(yīng)用方法。系采集杜鵑花的根系及土壤樣品進(jìn)行菌種的分離和純化、并制備成菌根真菌沙土、回接到藍(lán)莓根部的一種方法。從而達(dá)到提高菌根真菌侵染率，實現(xiàn)菌根有益效果的目的。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下方案，一種用于栽培藍(lán)莓的菌根真菌土的制備方法，包括如下步驟：
(1)、菌根真菌的取樣：選取生長健壯的杜鵑花樹，在樹干周圍20cm處向下挖至主要根系分布處，在菌根周圍取帶有直徑小于2mm細(xì)根的土樣；
(2)、制備土壤稀釋液：過濾所取土樣，將過濾后土樣連同細(xì)根一起放入裝有無菌水的三角瓶中，振蕩搖晃使土與水充分混合，用無菌吸管從中吸取土壤懸液注入盛有無菌水的試管中，制成10-1、10-2、10-3…不同稀釋倍數(shù)的土壤溶液；
(3)、倒平板：將預(yù)先制備的馬丁氏培養(yǎng)基熔化，待冷卻至55℃～60℃時，向馬丁氏培養(yǎng)基中加入鏈霉素溶液，使每1ml馬丁氏培養(yǎng)基中含有鏈霉素30-60uk；在無菌操作下向培養(yǎng)皿內(nèi)注入培養(yǎng)基，平置于桌面上，待凝固后成平板；
(4)、涂布真菌：將步驟(3)中所得的平板分別標(biāo)上不同稀釋倍數(shù)，用無菌吸管從土壤稀釋液中吸取0.2～0.4ml不同稀釋倍數(shù)10-1、10-2、10-3…加入到對應(yīng)稀釋倍數(shù)的平板中，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基平板表面輕涂均勻；
(5)、培養(yǎng)及挑菌：將上述培養(yǎng)基平板倒置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)60～72h；將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到培養(yǎng)基的斜面上于28℃培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，如有其它雜菌混雜，再次進(jìn)行分離純化，直至把真菌分純?yōu)橹梗?/p>
(6)、無菌河沙土的制備：向河沙土中加入10wt％稀鹽酸，加熱煮沸30min，以去除其中的有機(jī)質(zhì)；倒去酸水，用水沖洗至中性；烘干，40目過篩去掉粗顆粒；裝入小試管，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌、烘干；
(7)、菌根真菌土的培養(yǎng)：選擇培養(yǎng)成熟的優(yōu)良菌株，用無菌水洗，制成孢子懸液；向每個裝有河沙土小試管中加入1.0～1.2ml孢子懸液，以接種針拌勻；放入真空干燥器內(nèi)，抽干水分，存放備用。
優(yōu)選的，所述土樣含有直徑小于2mm細(xì)菌根，該土樣采用20目篩網(wǎng)過濾，每10g土樣用90ml無菌水混合。
優(yōu)選的，所述鏈霉素的濃度為10～12mg/ml。
作為本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例，所述馬丁氏培養(yǎng)基組成為：KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，瓊脂15-20g，水1000ml，pH自然，1％孟加拉紅水溶液3.3ml。
優(yōu)選的，所述步驟(6)中每100ml小試管裝2g河沙土。
本發(fā)明另一個目的是請求保護(hù)上述方法制備的真菌土在藍(lán)莓栽培中的應(yīng)用，具體應(yīng)用方法為：在藍(lán)莓生長季，以藍(lán)莓主根基部為中心，直徑20～30cm的區(qū)域挖坑，使用接種匙將菌根真菌土接入到藍(lán)莓根系附近。
優(yōu)選的，接種時間每年4-8月份，每株藍(lán)莓只接種一次即可。
有益效果
本發(fā)明的有益效果是：該菌根真菌土取材方便，能夠方便地采集到分布廣泛的杜鵑花植物根系土壤的菌根真菌樣品，克服了采集野生藍(lán)莓菌根真菌所受到的地理分布的局限性。菌根接種侵染率高，經(jīng)過菌種的分離純化并制備成菌根真菌沙土、回接到藍(lán)莓根系從而大幅提高菌根真菌的侵染率，菌根侵染率達(dá)到52％，而正常栽培的藍(lán)莓菌根不足3％。本發(fā)明方法通過提高菌根真菌侵染率以更大限度地發(fā)揮菌根的有益作用。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不以任何形式受限于實施例內(nèi)容。實施例中所述試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例1
1、菌根真菌的取樣：在大連大黑山選取生長健壯的杜鵑花樹，在樹干周圍20cm處向下挖至主要根系分布處(視樹體大小而定，一般30-40cm深度，樹體越大主要根系分布越深)，觀察是否長有菌根(多數(shù)杜鵑花都有歐石楠類菌根)。在菌根周圍取含有部分2mm以下細(xì)根的土樣。
2、制備馬丁氏培養(yǎng)基，馬丁氏培養(yǎng)基組成如下：KH2PO4 1g,MgSO4·7H2O 0.5g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,瓊脂15g，水1000ml，pH自然，1％孟加拉紅水溶液3.3ml。該培養(yǎng)基利于菌根真菌的生長。
3、制備土壤稀釋液：使用20目篩網(wǎng)過濾所取土樣，稱取過濾土樣連同細(xì)根10g，放入裝有90ml無菌水的三角瓶中，振蕩搖晃20min，使土與水充分混合。使用1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無菌水的試管中，吹吸三次，并振蕩搖晃混勻。然后再用一支吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4的四種稀釋倍數(shù)的土壤溶液。
4、倒平板：將上述馬丁氏培養(yǎng)基熔化，待冷卻至55℃時，向馬丁氏培養(yǎng)基中加入濃度為10mg/ml鏈霉素溶液，使得每毫升培養(yǎng)基中含有鏈霉素50uk。然后，在無菌操作下向培養(yǎng)皿內(nèi)注入培養(yǎng)基15ml左右，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使得培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后成平板。
5、涂布真菌：將上述培養(yǎng)基的平板分別標(biāo)上10-1、10-2、10-3、10-4四種稀釋倍數(shù)，然后用4支1ml無菌吸管分別由10-1、10-2、10-3、10-4四管土壤稀釋液中各吸取0.2ml對號放于已經(jīng)標(biāo)好稀釋倍數(shù)的平板中，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基平板表面輕涂均勻。
6、培養(yǎng)及挑菌：將上述培養(yǎng)基平板倒置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時；將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到培養(yǎng)基的斜面上，置于28℃培養(yǎng)，獲得單純菌苔。
7、無菌河沙土的制備：取河沙加入10％稀鹽酸，加熱煮沸30min，以去除其中的有機(jī)質(zhì)；倒去酸水，用自來水沖洗至中性；烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒；裝入小試管(10×100ml)，每管裝2g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌、烘干。
8、菌根真菌土的培養(yǎng)：選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長豐滿的)優(yōu)良菌株，以無菌水洗下，制成孢子懸液；于每沙土管中加入約1.0ml(剛剛使沙土濕潤為宜)孢子懸液，以接種針拌勻；放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分。存放于冰箱或室內(nèi)干燥處備用。
實施例2
本實施例與實施例1的區(qū)別僅在于步驟4中鏈霉素濃度及冷卻溫度不同。
本實施例步驟4為：將馬丁氏培養(yǎng)基熔化，待冷卻至60℃時，向培養(yǎng)基中加入濃度為12mg/ml鏈霉素溶液，使得每毫升培養(yǎng)基中含有鏈霉素60uk。然后，在無菌操作下向培養(yǎng)皿內(nèi)注入培養(yǎng)基15ml左右，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使得培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后成平板。
應(yīng)用例
4月份在藍(lán)莓生長季，選取300株藍(lán)莓進(jìn)行接種，在藍(lán)莓植物的根系周邊20cm的區(qū)域挖坑，挖坑深度為藍(lán)莓根系主要分布區(qū)域，然后使用接種匙將實施例1制備的菌根真菌土接入到藍(lán)莓根系附近。
接種率調(diào)查：于接種后的第30天調(diào)查菌根真菌侵染率，隨機(jī)抽取回接菌根真菌的藍(lán)莓樹100株，并抽取100株未接種藍(lán)莓樹作為對照，調(diào)查結(jié)果顯示，使用本方法接種的菌根真菌侵染率達(dá)到52％，而對照藍(lán)莓樹的菌根只有1％。由此可見其間的差異性極其顯著，回接菌根真菌極大地提高了菌根的侵染率。