本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體地涉及一株dse真菌及藍(lán)莓組培苗快速菌根化的方法。

背景技術(shù)：

深色有隔內(nèi)生真菌(darkseptateendophytes，dse)是一類廣泛存在于植物根內(nèi)，且具有深色有隔菌絲的菌根真菌。已有的研究證實(shí)，dse與宿主互惠共生，賦予植物優(yōu)良生長性狀，能提高宿主抗病蟲能力及在脅迫環(huán)境中的抗逆性。

藍(lán)莓(vacciniumspp.)又稱越橘，為杜鵑花科越橘屬植物，是具有較高經(jīng)濟(jì)價值和廣闊開發(fā)前景的新興果樹樹種，栽培面積的擴(kuò)大對藍(lán)莓苗的市場需求也日益增大。藍(lán)莓苗的繁育主要采用硬枝扦插和組織培養(yǎng)等方法。其中，組織培養(yǎng)方法繁殖速度快，適宜于優(yōu)良品種的無病毒工廠化苗木繁育。目前，盡管許多藍(lán)莓品種的組培快繁體系已建立，但仍存在幼苗生根困難，葉片發(fā)黃，移栽成活率低等問題，成為制約藍(lán)莓苗規(guī)模化組培快繁的主要障礙。對藍(lán)莓苗進(jìn)行有益促生菌的接種，快速實(shí)現(xiàn)其菌根化是克服藍(lán)莓組培苗生長緩慢，提高成活率的一個有效措施。

目前，已有學(xué)者對dse與植物在無菌條件下的共生培養(yǎng)體系開展研究?，F(xiàn)行的方法多是采用改良的植物固體培養(yǎng)基，接入的dse菌種是菌塊或菌片的形式。但該方法在實(shí)施過程中往往出現(xiàn)dse菌片在植物培養(yǎng)基中生長緩慢，植物根系不能與dse充分接觸，從而造成共培養(yǎng)周期長、侵染效率低的情況。因此，上述方法不適于根系纖細(xì)不發(fā)達(dá)植物如藍(lán)莓與dse的共生培養(yǎng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一株dse真菌及藍(lán)莓組培苗快速菌根化的方法，所述菌株為r16，其分類命名為tricladiumsplendens，已在中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)保藏，其保藏編號為：cgmccno.13885。該菌株菌落為灰白色，絨氈狀，邊緣光滑，菌落背面灰黃色。菌絲分叉，由主軸從不同平面發(fā)出2個側(cè)枝，頂部漸尖，菌絲內(nèi)有隔，能產(chǎn)生孢子。

本發(fā)明為解決藍(lán)莓組培快繁中幼苗生根率低，生長緩慢，移栽成活率低等問題提供了有效途徑；穩(wěn)定高效的dse菌與藍(lán)莓組培苗共生體系為研究dse與藍(lán)莓互作機(jī)理提供了理想實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，也為建立dse與其它植物尤其是根系纖細(xì)植物的共生體系提供借鑒。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一株dse真菌，所述菌株為r16，其分類命名為tricladiumsplendens；該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，其保藏編號為：cgmccno.13885。

本發(fā)明還提供一種所述菌株與藍(lán)莓組培苗快速菌根化的方法，所述方法的具體步驟如下:

1)藍(lán)莓苗的培養(yǎng)

選取生長狀態(tài)良好，株高4-5cm的藍(lán)莓組培苗進(jìn)行快速繁殖，選取繁殖的高5-7cm生長狀態(tài)良好的藍(lán)莓組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)；

2)dse接種劑的制備

取斜面保存的菌種r16接入含有50mlpda培養(yǎng)液的250ml三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震蕩培養(yǎng)10天，制備種子液；將種子液按10％(體積比)接入量接入到裝有新鮮pda培養(yǎng)液的三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震蕩培養(yǎng)10-15天，備用；所用pda培養(yǎng)液的成分及終濃度：0.6％馬鈴薯浸粉，2％葡萄糖，ph5.6；高壓滅菌；

3)共培養(yǎng)基質(zhì)的準(zhǔn)備

先將干苔蘚剪短，用清水洗凈，在蒸餾水中浸泡過夜，讓其充分吸水，ph為5.5，再分裝到組培瓶中，容器裝量體積比為15％-25％，121℃高壓滅菌1hr，備用；

4)dse真菌與藍(lán)莓共生體系的建立

將步驟1)制備的生長狀態(tài)良好的生根藍(lán)莓苗接入步驟3)制備的共培養(yǎng)基質(zhì)中，再加入6-8ml步驟2)制備的dse接種劑，接種后，放至23-25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時間8-16h/天條件下進(jìn)行共培養(yǎng)；

5)共培養(yǎng)體系的檢測

共培養(yǎng)一周后，在共培養(yǎng)基質(zhì)中有明顯的dse菌絲的生長；30天后取出藍(lán)莓苗，洗凈根部，然后將根系剪成4‐5cm長的根段將其放入提前配制好的faa固定液中固定；12小時后，將藍(lán)莓根段從faa固定液中取出，沖洗后脫色，隨機(jī)選取藍(lán)莓根段，在顯微鏡下鏡檢觀察深色有隔內(nèi)生真菌的定殖情況，當(dāng)部分根段看到深色有隔內(nèi)生真菌的典型特征結(jié)構(gòu)--微菌核時，表明深色有隔內(nèi)生真菌-植物共生體系建立。

進(jìn)一步，所述的脫色方法為經(jīng)過10％koh(g/ml)透明處理、質(zhì)量比為10％h2o2漂白、質(zhì)量比為1％hcl酸化、0.05％(g/ml)臺盼藍(lán)染色和體積比為50％甘油脫色。

本發(fā)明還提供一種包含所述菌株發(fā)酵菌液的藍(lán)莓生根制劑。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

本發(fā)明從藍(lán)莓根部篩選了一株dse菌株r16，所述菌株為一株tricladiumsplendens，已在中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)保藏，其保藏編號為：cgmccno.13885，建立了所述菌株與藍(lán)莓組培苗快速菌根化的方法。該體系采用滅菌苔蘚作為無菌條件下的共培養(yǎng)基質(zhì)，dse接種劑采用液體培養(yǎng)方法。與現(xiàn)行的采用菌塊接種的方法相比，接種液體培養(yǎng)的菌株r16生長快，與藍(lán)莓根菌接觸充分，共培養(yǎng)時短，定植率高。dse菌株r16對藍(lán)莓組培苗生長有顯著的促進(jìn)作用。與未接種對照相比，接種dse菌的藍(lán)莓苗生長有顯著優(yōu)勢，葉片大而濃綠，根系發(fā)達(dá)，移栽成活率高。

附圖說明

圖1r16菌落形態(tài)特征：a,菌落正面；b，菌落反面；

圖2r16菌絲形態(tài)特征；

圖3r16在藍(lán)莓根內(nèi)定植的菌絲和微菌核：a，箭頭所指為細(xì)胞內(nèi)的r16菌絲；b，箭頭所指為細(xì)胞內(nèi)的r16微菌核；

圖4r16對藍(lán)莓組培苗的促生效應(yīng)：a未接種，b接種r16菌塊，c接種r16菌塊；

菌株為r16，其分類命名為tricladiumsplendens；該菌株保藏于2017年4月11日中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏編號為：cgmccno.13885。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

藍(lán)莓根內(nèi)生真菌的分離、純化，步驟如下：

1、用清水洗凈藍(lán)莓根段，然后將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中進(jìn)行如下操作：將根段浸泡在10％(質(zhì)量比)雙氧水中8min，期間用無菌鑷子輕輕翻動幾次，以保證消毒徹底；無菌水漂洗2-3次后，將其轉(zhuǎn)入6％(質(zhì)量比)次氯酸鈉，浸泡15分鐘，無菌水漂洗2次；濾紙吸干根段表面殘留的液體。將消毒后的根段用無菌的剪刀剪成0.5cm長的根段，接入制備好的pda平板，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)。pda平板的配方：0.6％馬鈴薯浸粉，2％葡萄糖，2％瓊脂，ph5.6。115℃滅菌20min，冷卻至60℃時，加入無菌的氨芐青霉素(50ug/ml)和硫酸鏈霉素(100ug/ml)。上述各成份濃度均為pda培養(yǎng)基中的終濃度。

2、當(dāng)發(fā)現(xiàn)組織切口處有真菌長出來的時候，盡快用接種針將其挑入不加青霉素和鏈霉素的pda平板中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置進(jìn)行純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移3-5次后得到純菌落。

實(shí)施例2菌株r16的形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定

1、挑取上述保存的純化菌種，接種到pda平板中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化1-2周。用直徑為0.5cm的無菌打孔器從菌落的最外層打取菌餅，接種到新的pda平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，觀察菌落的形態(tài)。r16菌落為灰白色，絨氈狀，邊緣光滑，菌落背面為灰黃色(圖1)。

2、用接種針挑取少量純化后的單菌落菌絲，將其放入滴有一滴生理鹽水的載玻片上制成臨時裝片，并在顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌的菌絲結(jié)構(gòu)。菌絲分叉，由主軸從不同平面發(fā)出2個側(cè)枝，頂部漸尖，菌絲內(nèi)有隔，能產(chǎn)生孢子(圖2)。

3、對菌種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用全式金的plantgenomicdnakit試劑盒提取培養(yǎng)菌絲的基因組dna，擴(kuò)增引物是its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′。pcr反應(yīng)體系(25μl)包括：2.5μl10×pcr緩沖液(含mg²⁺)，2μldntp(2.5mmeach)，1.5μlits1(10μm)，1.5μlits4(10μm)，0.2μltaq酶，2μl基因組dna，15.3μlddh2o，。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，循環(huán)1次；94℃變性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物寄至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。將獲得的rdna基因間內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，即its序列(internallytranscribedspacer)，與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(ncbi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的序列進(jìn)行blastn比對，與一株tricladiumsplendens(gq152146)相似度最高為98％。該菌種編號為r16，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定為一株tricladiumsplendens，已在中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)保藏，其保藏號為cgmccno.13885。

測序結(jié)果：

ggaaggatcattacagtgttccctgcccttcggggtaggacgccacccttgattattttatgagtgttgctttggcgggcctcgcggcctggccgcgccccggcttcggcgggggagcgcccgccagaggattctacaaacctgactattagtgtcgtctgagtactatataatagttaaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccgtggtattccgcggggcatgcctgttcgagcgtcattataaccaatccagctcgctgggtcttgggcaccgccgccaggcgggcctcaaaataagtggcggtacggccggactctgagcgtagtaaatcttctcgctacagggtcccgggcggcactggccagcaacccccaaatctttcacaggttgacctcggatcaggtagggataccc。

實(shí)施例3藍(lán)莓組培苗的培養(yǎng)，步驟如下：

(1)藍(lán)莓芽分化

選取生長狀態(tài)良好，株高4-5cm的藍(lán)莓組培苗進(jìn)行快速繁殖。在超凈工作臺中用無菌的剪刀將組培瓶中的藍(lán)莓植株從基部剪斷，剪成2-3cm的莖段，然后用無菌的鑷子將其接到含有分化培養(yǎng)基的組培瓶中，每瓶中接入3-4個莖段，均勻分散放置。所用的培養(yǎng)基是以wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在每升wpm培養(yǎng)基中均添加蔗糖20g、瓊脂5-10g，添加植物激素玉米素1.0-3.0mg，培養(yǎng)基ph5.0-5.5，培養(yǎng)容器裝量10-30％，121℃高壓滅菌20min。培養(yǎng)條件設(shè)置為23-25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時間8-16h/天，培養(yǎng)時間40-60天。

(2)藍(lán)莓生根培養(yǎng)

在超凈工作臺中，選取高6cm生長狀態(tài)良好的藍(lán)莓組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。用無菌的剪刀從藍(lán)莓組培苗的基部剪斷，然后用無菌的鑷子將剪斷的植株插入帶有濾紙球的生根培養(yǎng)基中，植株插的深度以植株底部剛浸入培養(yǎng)基為宜，每瓶液體培養(yǎng)基中接入6-10株藍(lán)莓苗。所用培養(yǎng)基為1/2wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，然后加入蔗糖20g，吲哚丁酸1-2.5mg，定容到1升，調(diào)培養(yǎng)基的ph為5.0-5.5，培養(yǎng)容器裝量10-30％。將配好的液體培養(yǎng)基倒入裝有濾紙球的組培瓶中，121℃高壓滅菌20min。濾紙球以鋪滿組培瓶的底部以固定藍(lán)莓幼苗。培養(yǎng)條件設(shè)置為23-25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時間8-16h/天，培養(yǎng)時間40-60天。

實(shí)施例4不同接種方法的效果比較

1、dse接種劑的制備

制備2兩種r16接種劑：第一種是現(xiàn)行多采用的菌塊的形式：取斜面保存的菌種，接入pda平板，25-28℃倒置培養(yǎng)14天，備用。第二種是本發(fā)明采用的液體培養(yǎng)的形式：取斜面保存的菌種r16接入含有50mlpda培養(yǎng)液的250ml三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震蕩培養(yǎng)10天，制備種子液。將種子液按10％接入量接入到裝有100ml新鮮pda培養(yǎng)液的500ml三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震蕩培養(yǎng)10-15天，備用。所用pda液體培養(yǎng)基的組成：0.6％馬鈴薯浸粉，2％葡萄糖，ph5.6，分裝到500ml三角瓶中，每瓶分裝100ml，并放入10-20個直徑為3-5mm的玻璃球，121℃高壓滅菌20min。

共培養(yǎng)基質(zhì)的準(zhǔn)備

2、共培養(yǎng)基質(zhì)的制備

先將干苔蘚剪短，用清水洗凈，在蒸餾水中浸泡過夜，讓其充分吸水，ph5.5，再分裝到組培瓶中，容器裝量為15％-25％，121℃高壓滅菌1hr，備用。

3、dse真菌與藍(lán)莓共生體系的建立

選擇生長狀態(tài)良好的生根藍(lán)莓苗用無菌的鑷子接入上述制備共培養(yǎng)基質(zhì)中。設(shè)置三個實(shí)例組：一個不接菌對照組和兩個接菌實(shí)例組。兩個接菌實(shí)例組分別采用兩種方法：一是利用上述制備的r16培養(yǎng)平板，使用打孔器打取直徑5mm的r16菌塊，每棵藍(lán)莓苗周圍均勻放置3塊。二是采用本發(fā)明優(yōu)化的方法：用移液槍加入6-8ml上述制備的r16培養(yǎng)液。吸取前，需要將dse接種劑晃動混勻。移液槍頭前端需剪掉2-3mm，并滅菌后才能使用。每組各20瓶藍(lán)莓苗，均放至23-25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時間8-16h/天條件下進(jìn)行共培養(yǎng)。

4、共培養(yǎng)體系的檢測

共培養(yǎng)30天時，從上述3個實(shí)例組各取10瓶藍(lán)莓苗檢測r16在藍(lán)莓根部的定植情況，剩余10瓶藍(lán)莓苗繼續(xù)培養(yǎng)，用于分析r16對藍(lán)莓苗的接種效應(yīng)。用清水洗凈根部，然后用剪刀將根系剪成4‐5cm長的根段將其放入提前配制好的faa固定液中固定。時間后，將藍(lán)莓根段從faa固定液中取出，用蒸餾水沖洗3次。經(jīng)過10％koh(g/ml)透明、質(zhì)量比為10％h2o2漂白、質(zhì)量比為1％hcl酸化、0.05％(g/ml)臺盼藍(lán)染色和體積比為50％甘油脫色后，隨機(jī)選取藍(lán)莓根段，在顯微鏡下鏡檢觀察深色有隔內(nèi)生真菌的定殖情況，當(dāng)部分根段看到深色有隔內(nèi)生真菌的典型特征結(jié)構(gòu)--微菌核時，表明深色有隔內(nèi)生真菌-植物共生體系建立。結(jié)果顯示，接種r16培養(yǎng)液的藍(lán)莓苗根中，r16菌絲定殖率達(dá)到21.1％，微菌核的定殖率為6.8％(圖3)；而接種r16菌塊的藍(lán)莓根中，僅觀察到r16菌絲定植，定植率為7.9％；未接菌對照組的藍(lán)莓根樣中沒有觀察到相應(yīng)的菌絲和微菌核。同時，從上述兩個接菌實(shí)例組的藍(lán)莓根樣中，只分離得到與接種劑形態(tài)特征相同的dse菌株r16，進(jìn)一步表明r16在藍(lán)莓根內(nèi)成功定植。以上結(jié)果說明，對于根系纖細(xì)不發(fā)達(dá)的藍(lán)莓苗來說，采用液體培養(yǎng)的接種劑可有效提高dse真菌定植率，實(shí)現(xiàn)快速菌根化。

5、dse菌對藍(lán)莓組培苗的促生效應(yīng)

共培養(yǎng)90天后，觀察接種r16對藍(lán)莓苗生長的影響。與未接種對照相比，接種r16的藍(lán)莓苗生長均表現(xiàn)出優(yōu)勢，根系發(fā)達(dá)，葉片大而濃綠。接種r16培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)組的藍(lán)莓苗優(yōu)勢更為顯著(圖4)。

實(shí)施例5適宜共培養(yǎng)基質(zhì)的篩選

選擇苔蘚、草炭土和蛭石三種常用栽培基質(zhì)按不同體積比例混合作為待用共培養(yǎng)基質(zhì)。設(shè)定三個實(shí)例組：苔蘚：草炭土：蛭石1：1：1；苔蘚：草炭土1：1；純苔蘚。先將干苔蘚(ph5.5)剪短，用清水洗凈，在蒸餾水中浸泡過夜，讓其充分吸水，按不同體積比例與草炭土或蛭石混合，分裝到培養(yǎng)瓶中，容器裝量為15％-25％。，121℃高壓滅菌2hr，備用。按實(shí)施例4中的步驟3接入藍(lán)莓生根苗和菌株r16液體接種劑。每組各10瓶藍(lán)莓苗，均放至23-25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時間8-16h/天條件下進(jìn)行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)50天時，檢測上述三個實(shí)例組中r16在藍(lán)莓根部的定植情況。檢測方法同實(shí)施例4的步驟4。表1示在不同共培養(yǎng)基質(zhì)中r16對藍(lán)莓根部定植率的比較。在苔蘚、草炭土、蛭石三種等體積混合的基質(zhì)中，r16的定植率最低，而在純苔蘚中，r16定植率最高。并且，以純苔蘚作為共培養(yǎng)基質(zhì)，操作更簡單，因此本發(fā)明確定純苔蘚為最佳共培養(yǎng)基質(zhì)。

表1不同共培養(yǎng)基質(zhì)對r16在藍(lán)莓根內(nèi)定植率的影響

本發(fā)明提供了一株dse真菌r16及利用所述菌株快速、高效實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓組培苗菌根化的方法，因此該菌株的菌液可以制成藍(lán)莓促生長制劑，在藍(lán)莓苗工廠化組培快繁中推廣應(yīng)用，具有廣闊的應(yīng)用前景和市場空間。

sequencelisting

<110>魯東大學(xué)

<120>一株dse真菌及藍(lán)莓組培苗快速菌根化的方法

<130>無

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>512

<212>dna

<213>tricladiumsplendens

<400>1

ggaaggatcattacagtgttccctgcccttcggggtaggacgccacccttgattatttta60

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aaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgat240

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acaggttgacctcggatcaggtagggataccc512