本發(fā)明涉及一種雪峰蟲草的人工培育方法，尤其涉及一種雪峰蟲草菌種感染活體癤蝙蝠蛾幼蟲人工培育雪峰蟲草的方法以及所得到的雪峰蟲草。

背景技術(shù)：

隨著人們生活水平以及生活質(zhì)量的不斷提高，認(rèn)識領(lǐng)域的不斷擴大，對功能保健產(chǎn)品以及食品的需求也日漸增大。蟲草是一類具有顯著保健療效的藥用和食用真菌，其中最著名的是冬蟲夏草，其相關(guān)的系列產(chǎn)品高達(dá)數(shù)十種，包括保健品、食品、中成藥等幾大類產(chǎn)品，在全世界都享有盛譽。但冬蟲夏草寄主專一，生活環(huán)境苛刻，人工培育很難完全成功，而且由于其天然寄主蝙蝠蛾生活周期長、天敵多、病害多，自然繁殖的幼蟲產(chǎn)量嚴(yán)重不足，加之這些年來冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)環(huán)境污染嚴(yán)重，人為過早、過量地滋采滋挖以及草甸沙化，從而造成未成熟的蟲草菌感染寄主的機會大量減少等原因，造成冬蟲夏草數(shù)量和質(zhì)量大幅度下降，貨源稀缺，價格昂貴，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場日益增長的需求。

雪峰蟲草為全球首次發(fā)現(xiàn)的新物種、藥用新資源，為線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌Ophiocordyceps xuefengensis T.C.Wen,R.C.Zhu,J.C.Kang&K.D.Hyde寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體，生于海拔300～1000m闊葉林中的馬鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.近地面根或莖中，主要分布在我省雪峰山片區(qū)，如湖南的洞口縣、隆回縣等。雪峰蟲草作為瑤藥使用歷史悠久，當(dāng)?shù)厝罕娡ㄟ^蒸煮、燉肉、泡酒等方式服用，具有補肺益腎、止咳化痰等功效，主要用于肺部疾病，如肺炎、哮喘、百日咳、干咳、熱咳等，配伍后對高血壓、病毒性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等疾病有良好的療效。

經(jīng)過多基因的分子系統(tǒng)學(xué)和形態(tài)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其與已發(fā)表的蟲草都不相同，是與冬蟲夏草親源關(guān)系很近的一種線型蟲草屬的一個新種。經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院的主要成份及含量檢測，結(jié)果表明：16種氨基酸的含量、D-甘露醇含量、腺苷、蟲草素含量均符合冬蟲夏草的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。經(jīng)雪峰蟲草的動物急性毒性試驗，長期毒性試驗，均表明雪峰蟲草是一種無毒安全蟲草。雪峰蟲草在湖南雪峰山區(qū)被長期當(dāng)成名貴中藥冬蟲夏草的替代品來使用，效果極佳，目前售價約每克20 美元。它也是世界上目前發(fā)現(xiàn)的最大的蟲草。

中國發(fā)明專利，申請?zhí)?01310245503.0；申請日：2013-06-20；發(fā)明名稱：人工培育雪峰蟲草的方法；公開(公告)日2013-10-09：公開(公告)號：CN103340091A，公開了一種人工培育雪峰蟲草的方法：將雪峰蟲草菌粉與培養(yǎng)料混合，將癤蝙蛾3齡以上寄生的大青根裝箱，撒上雪峰蟲草粉末，控制箱內(nèi)溫度、濕度，培養(yǎng)出雪峰蟲草。該培育方法中雪峰蟲草的產(chǎn)出需要有大青、癤蝙蛾幼蟲、雪峰蟲草菌種，缺一不可，其不足在于要砍伐大量大青，破壞生態(tài)環(huán)境；培養(yǎng)料和菌粉混合容易交叉感染，滋生雜菌；幼蟲的進(jìn)食量有限，感染率較低，感染時間較長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雪峰蟲草菌種感染活體癤蝙蝠蛾幼蟲人工培育雪峰蟲草的方法以及所得到的雪峰蟲草。

一種雪峰蟲草的人工培育方法，方法步驟如下：

S1：幼蟲選擇：選擇癤蝙蛾幼蟲；

S2：菌種選擇：線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌Ophiocordyceps xuefengensis T.C.Wen,R.C.Zhu,J.C.Kang&K.D.Hyde；該菌種由申請人采集，并于2015年8月10日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏號：CGMCC NO.11107；分類命名：雪峰蟲草菌Ophiocordyceps xuefengensis；

S3：菌種的制備：雪峰蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每2-3塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、130r/min震蕩培養(yǎng)15-20d得發(fā)酵液，過濾得液體菌種；

S4：營養(yǎng)土的制備：將沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均勻，然后加水至含水量為15-30％，再進(jìn)行高溫高壓滅菌；

S5：幼蟲體表消毒：先用75％的酒精擦拭，后紫外消毒，消毒時間20-50min；

S6：接種；

S7：培養(yǎng)管理。

優(yōu)選地，所述S1中的癤蝙蛾幼蟲的長度4-8cm。

優(yōu)選地，所述S4中的高溫高壓為121℃、0.1Mpa，滅菌時間為30min。

優(yōu)選地，所述S6中的接種為涂抹法、浸泡法、注射法中的一種。

涂抹法：用無菌棉球蘸菌液涂抹；浸泡法：或?qū)⑾镜挠紫x放入菌液中浸泡60s；注射法：用一次性的注射器吸取0.2-0.5ml的液體菌種注射到已消毒的幼蟲體內(nèi)。

優(yōu)選地，所述S7中的培養(yǎng)管理方法步驟如下：

進(jìn)一步的，步驟1，將接種后的幼蟲放入上述S4中的營養(yǎng)土內(nèi)，放置在4-15℃環(huán)境下避光培養(yǎng)16-30d；

進(jìn)一步的，步驟2，轉(zhuǎn)入光照強度為0-250lx,培養(yǎng)溫度為5-15℃12h,15-25℃12h，濕度為80-90％的條件下培養(yǎng)至菌絲布滿幼蟲表面，長出子座；

進(jìn)一步的，步驟3，轉(zhuǎn)入溫度10-25℃，濕度90％，弱光培養(yǎng)至子座成熟。

溫度對子座的形成和生長發(fā)育具有很重要的影響，持續(xù)低溫難以形成子座，持續(xù)高溫子座生長太快，容易形成細(xì)小的子座，一定的溫差有利于形成健壯的子座。

優(yōu)選地，權(quán)利要求1-6之一的方法得到的雪峰蟲草。

與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在：

1、操作簡單，成本低，技術(shù)容易推廣。

2、蟲體感染率高達(dá)80％，出草率90％以上，所得雪峰蟲草的營養(yǎng)活性成分接近野生雪峰蟲草，所得雪峰蟲草的子座外層結(jié)構(gòu)緊密，外形近似野生雪峰蟲草、子座飽滿、大小形狀比較均一，易于規(guī)模化栽培。

3、本發(fā)明的雪峰蟲草中的腺苷、甘露醇、蟲草素均符合冬蟲夏草的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

4、按照本專利流程操作，如培育周期縮短至2個月，比自然條件縮短了13個月左右，可以在狹小的空間里立體化培育雪峰蟲草，畝產(chǎn)量是自然條件的50倍以上。

附圖說明

圖1為一種雪峰蟲草的人工培育方法的流程圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

營養(yǎng)土原料來源說明：沙壤土取自中藥所種植園，過100目的篩子；草炭土購買自廣州市生升農(nóng)業(yè)有限公司。

實施例1

S1：幼蟲的選擇：選擇大小為4cm的癤蝙蝠蛾幼蟲作為寄主；

S2：菌種選擇：線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌；

S3：雪峰蟲草菌種的制備：將復(fù)壯后的雪峰蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每2塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、130r/min震蕩培養(yǎng)15d得發(fā)酵液，過濾得液體菌種；

S4：營養(yǎng)土的制備：將沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均勻，然后加水配制含水量為15％的土壤，在溫度121℃，壓力0.1Mpa的條件下滅菌30min；

S5：幼蟲體表消毒及接種：將S1中的幼蟲用75％酒精擦拭后放入超凈工作臺上紫外消毒20min，然后用無菌棉球蘸菌液涂抹消毒的幼蟲體表；

S6：前期培養(yǎng)管理：將S5中的幼蟲放入S4制備的無菌營養(yǎng)土內(nèi)，放置在4℃環(huán)境下避光培養(yǎng)16d；

S7：后期培養(yǎng)管理：將經(jīng)S6中的培養(yǎng)的幼蟲放在光照條件下培養(yǎng)，光照強度為50lx，培養(yǎng)溫度為10℃12h,20℃12h，濕度為90％。

培養(yǎng)結(jié)束后，其蟲體感染率0％，出草率為0％。

實施例2

S1：幼蟲的選擇：選擇大小為8cm的癤蝙蝠蛾幼蟲作為寄主；

S2：菌種選擇：線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌；

S3：雪峰蟲草菌種的制備：將復(fù)壯后的雪峰蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每3塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、130r/min震蕩培養(yǎng)15d得發(fā)酵液，過濾得液體菌種；

S4：營養(yǎng)土的制備：將沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均勻，然后加水配制含水量為15％的土壤，在溫度121℃，壓力0.1Mpa的條件下滅菌30min；

S5：幼蟲體表消毒及接種：將S1中的幼蟲用75％酒精擦拭后放入超凈工作臺上紫外消毒30min，將消毒的幼蟲在菌液浸泡60s；

S6：前期培養(yǎng)管理：將S5中的幼蟲放入S4制備的無菌營養(yǎng)土內(nèi)，放置在4℃環(huán)境下避光培養(yǎng)16d；

S7：后期培養(yǎng)管理：將經(jīng)S6中的培養(yǎng)的幼蟲放在光照條件下培養(yǎng)，光照強度為100lx，培養(yǎng)溫度為10℃12h,20℃12h，濕度為90％。

培養(yǎng)結(jié)束后，其蟲體感染率0％，出草率為0％。

實施例3

S1：幼蟲的選擇：選擇大小為4cm的癤蝙蝠蛾幼蟲作為寄主；

S2：菌種選擇：線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌；

S3：雪峰蟲草菌種的制備：將復(fù)壯后的雪峰蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每2塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、130r/min震蕩培養(yǎng)20d得發(fā)酵液，過濾得液體菌種；

S4：營養(yǎng)土的制備：將沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均勻，然后加水配制含水量為15％的土壤，在溫度121℃，壓力0.1Mpa的條件下滅菌30min；

S5：幼蟲體表消毒及接種：將S1中的幼蟲用75％酒精擦拭后放入超凈工作臺上紫外消毒20min，然后用一次性的注射器吸取0.2ml的液體菌種注射到幼蟲體內(nèi)；

S6：前期培養(yǎng)管理：將S5中的幼蟲放入S4制備的無菌營養(yǎng)土內(nèi)，放置在10℃環(huán)境下避光培養(yǎng)16d；

S7：后期培養(yǎng)管理：將經(jīng)S6中的培養(yǎng)的幼蟲放在光照條件下培養(yǎng)，光照強度為50lx，培養(yǎng)溫度為10℃12h，20℃12h，濕度為90％，待蟲體表面布滿菌絲，長出子座，轉(zhuǎn)入弱光條件，溫度為22℃，濕度90％，以上培養(yǎng)條件待子座成熟。

培養(yǎng)結(jié)束后，其蟲體感染率45％，出草率為90％。

實施例4

S1：幼蟲的選擇：選擇大小為6cm的癤蝙蝠蛾幼蟲作為寄主；

S2：菌種選擇：線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌；

S3：雪峰蟲草菌種的制備：將復(fù)壯后的雪峰蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每3塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、130r/min震蕩培養(yǎng)15d得發(fā)酵液，過濾得液體菌種；

S4：營養(yǎng)土的制備：將沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均勻，然后加水配制含水量為20％的土壤，在溫度121℃，壓力0.1Mpa的條件下滅菌30min；

S5：幼蟲體表消毒及接種：將S1中的幼蟲用75％酒精擦拭后放入超凈工作臺上紫外消毒30min，然后用一次性的注射器吸取0.4ml的液體菌種注射到幼蟲體內(nèi)；

S6：前期培養(yǎng)管理：將S5中的幼蟲放入S4制備的無菌營養(yǎng)土內(nèi)，放置在13℃環(huán)境下避光培養(yǎng)20d；

S7：后期培養(yǎng)管理：將經(jīng)S6中的培養(yǎng)的幼蟲放在光照條件下培養(yǎng)，光照強度為0lx，培養(yǎng)溫度為5℃12h，20℃12h，濕度為85％，待蟲體表面布滿菌絲，長出子座，轉(zhuǎn)入弱光條件，溫度為22℃，濕度90％，以上培養(yǎng)條件待子座成熟。

培養(yǎng)結(jié)束后，其蟲體感染率70％，出草率為90％。

實施例5

S1：幼蟲的選擇：選擇大小為8cm的癤蝙蝠蛾幼蟲作為寄主；

S2：菌種選擇：線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌；

S3：雪峰蟲草菌種的制備：將復(fù)壯后的雪峰蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每2塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、130r/min震蕩培養(yǎng)20d得發(fā)酵液，過濾得液體菌種；

S4：營養(yǎng)土的制備：將沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均勻，然后加水配制含水量為30％的土壤，在溫度121℃，壓力0.1Mpa的條件下滅菌30min；

S5：幼蟲體表消毒及接種：將S1中的幼蟲用75％酒精擦拭后放入超凈工作臺上紫外消毒50min，然后用一次性的注射器吸取0.4ml的液體菌種注射到幼蟲體內(nèi)；

S6：前期培養(yǎng)管理：將S5中的幼蟲放入S4制備的無菌營養(yǎng)土內(nèi)，放置在13℃環(huán)境下避光培養(yǎng)20d；

S7：后期培養(yǎng)管理：將經(jīng)S6中的培養(yǎng)的幼蟲放在光照條件下培養(yǎng)，光照強度為0lx，培養(yǎng)溫度為5℃12h，25℃12h，濕度為80％，待蟲體表面布滿菌絲，長出子座，轉(zhuǎn)入弱光條件，溫度為25℃，濕度90％，以上培養(yǎng)條件待子座成熟。

培養(yǎng)結(jié)束后，其蟲體感染率73％，出草率為90％。

實施例6

S1：幼蟲的選擇：選擇大小為5cm的癤蝙蝠蛾幼蟲作為寄主；

S2：菌種選擇：線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌；

S3：雪峰蟲草菌種的制備：將復(fù)壯后的雪峰蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每2塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、130r/min震蕩培養(yǎng)17d得發(fā)酵液，過濾得液體菌種；

S4：營養(yǎng)土的制備：將沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均勻，然后加水配制含水量為22％的土壤，在溫度121℃，壓力0.1Mpa的條件下滅菌30min；

S5：幼蟲體表消毒及接種：將S1中的幼蟲用75％酒精擦拭后放入超凈工作臺上紫外消毒25min，然后用一次性的注射器吸取0.5ml的液體菌種注射到幼蟲體內(nèi)；

S6：前期培養(yǎng)管理：將S5中的幼蟲放入S4制備的無菌營養(yǎng)土內(nèi)，放置在9.5℃環(huán)境下避光培養(yǎng)23d；

S7：后期培養(yǎng)管理：將經(jīng)S6中的培養(yǎng)的幼蟲放在光照強度為250lx的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15℃12h，20℃12h，濕度為85％，待蟲體表面布滿菌絲，長出子座，轉(zhuǎn)入弱光條件，溫度為10℃，濕度90％，以上培養(yǎng)條件待子座成熟。

培養(yǎng)結(jié)束后，其蟲體感染率50％，出草率為90％。

實施例7

S1：幼蟲的選擇：選擇大小為7cm的癤蝙蝠蛾幼蟲作為寄主；

S2：菌種選擇：線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌；

S3：雪峰蟲草菌種的制備：將復(fù)壯后的雪峰蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每3塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、130r/min震蕩培養(yǎng)18d得發(fā)酵液，過濾得液體菌種；

S4：營養(yǎng)土的制備：將沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均勻，然后加水配制含水量為27％的土壤，在溫度121℃，壓力0.1Mpa的條件下滅菌30min；

S5：幼蟲體表消毒及接種：將S1中的幼蟲用75％酒精擦拭后放入超凈工作臺上紫外消毒35min，然后用一次性的注射器吸取0.3ml的液體菌種注射到幼蟲體內(nèi)；

S6：前期培養(yǎng)管理：將S5中的幼蟲放入S4制備的無菌營養(yǎng)土內(nèi)，放置在15℃環(huán)境下避光培養(yǎng)30d；

S7：后期培養(yǎng)管理：將經(jīng)S6中的培養(yǎng)的幼蟲放在光照條件下培養(yǎng)，光照強度為125lx，培養(yǎng)溫度為10℃12h，15℃12h，濕度為90％，待蟲體表面布滿菌絲，長出子座，轉(zhuǎn)入弱光條件，溫度為18℃，濕度90％，以上培養(yǎng)條件待子座成熟。

培養(yǎng)結(jié)束后，其蟲體感染率60％，出草率為90％。

實施例中蟲體感染率跟接種方法密切相關(guān)，菌液涂抹和浸泡的方法蟲體感染雪峰蟲草菌的概率為0，有的在培養(yǎng)期間甚至還蛻皮生長；而用注射的方法提高其感染率。感染率的高低還與培養(yǎng)溫度有直接關(guān)系，前期溫度太高容易造成雜菌污染，降低感染率，而持續(xù)低溫會使菌絲生長緩慢，延長感染時間，甚至無法形成子座。在后期管理中，持續(xù)的高溫導(dǎo)致子座生長細(xì)弱，所以一定的溫差有利于形成健壯的子座，成功感染的幼蟲其出草率高達(dá)90％。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。