本發(fā)明屬于植物組培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種嘉蘭百合快速繁殖的方法。

背景技術(shù)：

嘉蘭百合(Gloriosa superba Linn)屬百合科嘉蘭屬攀援性草本植物，原產(chǎn)于我國云南省南部、海南省及亞洲非洲熱帶地區(qū)，我國云南西雙版納海拔1200m以下有野生零星分布?；ㄗ似嫣兀q如燃燒的火焰，色彩艷麗而高雅；花色變幻多樣，花期較長，是一種極具觀賞價值的草本花卉。因富含秋水仙堿，其塊莖是生產(chǎn)秋水仙堿的理想原料之一。嘉蘭百合的繁殖方式有種子繁殖、塊莖無性繁殖和組培繁殖。由于嘉蘭百合的種子繁殖困難且生長緩慢，需3~4年才能開花，通常采用其地下塊莖進(jìn)行無性繁殖。然而，嘉蘭百合的繁殖系數(shù)非常低，每株只能形成1個塊莖，每個塊莖只有2個芽，嚴(yán)重制約了嘉蘭百合的規(guī)?；a(chǎn)。采用常規(guī)組培繁殖技術(shù)生產(chǎn)的組培苗，則面臨著過渡移栽成活率低，且后期生長緩慢，培養(yǎng)周期長等問題。也由于嘉蘭百合是百合科嘉蘭屬，而常見的百合品種是百合科百合屬，由于不是一個屬的植物，其繁殖差異極大，不具有參考價值。因此以常規(guī)的繁殖方法難以滿足嘉蘭百合的規(guī)?；焖偕a(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對嘉蘭百合種子繁殖困難、塊莖繁殖系數(shù)低、組培繁殖移栽后期生長緩慢、時間長等問題，本發(fā)明提供一種嘉蘭百合快速繁殖的方法，通過改進(jìn)生產(chǎn)流程和培養(yǎng)基配方，提高嘉蘭百合繁殖系數(shù)，快速生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)塊莖，以滿足優(yōu)質(zhì)種苗的大規(guī)模生產(chǎn)需要。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種嘉蘭百合快速繁殖的方法，包括如下步驟：

A、外植體的選擇與滅菌：選取生長健壯且未形成花芽的莖尖和/或腋芽為外植體，剝?nèi)ネ鈱尤~片，切成長為1.5~2.0cm的小段，清洗干凈并消毒，然后用無菌水漂洗至無消毒劑殘留；

B、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將經(jīng)過A步驟消毒滅菌后的小段接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，日光照時間為10～12h/d的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)20~40d直至外植體萌發(fā)分化出0.5~1.5cm長的不定芽；

所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+6.0mg/L~8.0mg/L 6-芐氨基嘌呤+0.01mg/L~0.05mg/L萘乙酸+6.5g/L~7.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.8~6.0；

C、不定芽繼代增殖培養(yǎng)：將B步驟的不定芽在無菌條件下切下置于增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，日光照時間為10～12h/d的條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，獲得帶有莖盤的不定芽；

所述的增殖培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+4.0mg/L~5.0mg/L 6-芐氨基嘌呤+0.05mg/L~0.1mg/L萘乙酸+瓊脂6.5g/L~7.0g/L+蔗糖30g/L，pH5.8~6.0；

D、塊莖培養(yǎng)：將C步驟獲得的帶有莖盤的不定芽在無菌條件下切成不定芽和莖盤兩部分，切下的不定芽返回接種至C步驟的增殖培養(yǎng)基中，再次進(jìn)行繼代培養(yǎng)；而切下的莖盤去除根、莖、葉后，將其分割成2~4塊接種至塊莖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，日光照時間為10～12h/d的條件下進(jìn)行塊莖培養(yǎng)50~60d，待塊莖長至直徑1.0~1.5cm即可出瓶下地種植；

所述的塊莖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+1.0mg/L~1.5mg/L 6-芐氨基嘌呤+0.1mg/L~0.5mg/L萘乙酸+6.5g/L~7.0g/L瓊脂+60g/L蔗糖，pH5.8~6.0；

E、移栽：將D步驟出瓶的塊莖按常規(guī)洗凈塊莖上的培養(yǎng)基，放入質(zhì)量濃度為0.1～0.2%的多菌靈溶液中消毒1～2min后，移栽至質(zhì)量比為紅土：腐葉土=1︰1的營養(yǎng)基質(zhì)中，需40%~45%的遮陰度，按常規(guī)進(jìn)行澆水、施肥管理，生長40~60d后發(fā)芽出苗，即可得到嘉蘭百合種苗。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟A中所述的清洗和消毒的具體方法是用常規(guī)的加有洗滌劑的水清洗后，在質(zhì)量濃度為0.1%的升汞溶液中消毒7~10min，再在質(zhì)量濃度為0.3%的次氯酸鈉溶液中消毒3~5min，然后用無菌水漂洗3~4次。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述的繼代周期為20~30d，繼代3~5代，可獲得大量帶有莖盤的不定芽。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟D中，切下的莖盤去除根、莖、葉后，將其分割成2~4塊，每塊粒徑為0.3~0.5c

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

1、與種子繁殖技術(shù)相比，本發(fā)明繁殖容易且縮短了生長周期。嘉蘭百合種子繁殖困難，其種皮較硬、厚，種子萌發(fā)率低，出苗不整齊，且出苗時間長，需要3~4年才能開花。而本發(fā)明繁殖容易，繁殖系數(shù)高可達(dá)6~8倍，進(jìn)種率可達(dá)90%，移栽成活率在95%以上。

2、與現(xiàn)有的常規(guī)組培繁殖方法相比，本發(fā)明的出瓶移栽成活率高，更易于養(yǎng)護(hù)管理。目前，現(xiàn)有的常規(guī)組培繁殖方法是通過不定芽誘導(dǎo)，然后進(jìn)行不定芽增殖從而獲得組培苗，繁殖系數(shù)可達(dá)4~5倍，但是過渡移栽的成活率低，僅60%左右，且后期生長速度慢。本發(fā)明通過不定芽誘導(dǎo)、增殖，然后通過不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生小塊莖，經(jīng)過50~60d培養(yǎng)后獲得約1.0~1.5cm的塊莖，出瓶移栽后成活率高，可達(dá)95%；后期生長速度快，而且還可生長出3~5個芽，大大提高了繁殖效率，經(jīng)濟(jì)效益顯著增加，同時便于栽培管理。

3、本發(fā)明方法建立了不定芽誘導(dǎo)，然后通過不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生塊莖的嘉蘭百合繁殖體系，同時通過激素、營養(yǎng)、培養(yǎng)環(huán)境的綜合調(diào)節(jié)，解決了嘉蘭百合繁殖系數(shù)低、生產(chǎn)周期長的難題，達(dá)到了進(jìn)種率高、增殖速度快，生產(chǎn)技術(shù)穩(wěn)定的目的，實(shí)現(xiàn)了嘉蘭百合規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化、工廠化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用材料、試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

A．外植體的選擇與滅菌：選取生長健壯且未形成花芽的莖尖和腋芽為外植體，剝?nèi)ネ鈱尤~片，切成1.5~2.0cm的小段，用常規(guī)的加有適量洗滌劑的水清洗后，在質(zhì)量濃度為0.1%的升汞溶液中消毒7min，再在質(zhì)量濃度為0.3%的次氯酸鈉溶液中消毒5min，然后用無菌水漂洗4次，每次2min，然后用無菌濾紙吸干，備用；

B、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：在無菌條件下，將經(jīng)過A步驟消毒滅菌后的小段接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA) 6.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.01mg/L+瓊脂6.5 g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，光照時間為10h/d的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)40d直至外植體萌發(fā)分化出0.5~1.5cm不定芽；

C、不定芽繼代增殖培養(yǎng)：將B步驟的不定芽在無菌條件下切下置于下列增殖培養(yǎng)基中：MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA)4.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.05mg/L+瓊脂6.5 g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，日光照時間為10h/d的條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代周期為30d，繼代3代，獲得大量的帶有莖盤的不定芽；

D、塊莖培養(yǎng)：將C步驟獲得的帶有莖盤的不定芽在無菌條件下切成不定芽和莖盤兩部分，切下的不定芽返回接種至C步驟的增殖培養(yǎng)基中，再次進(jìn)行繼代培養(yǎng)；而切下的莖盤去除根、莖、葉后，將其分割成2~4塊（每塊粒徑為0.3~0.5cm大?。┙臃N至下列塊莖培養(yǎng)基中：MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.1mg/L+瓊脂6.5 g/L+蔗糖60g/L，pH=5.8，在培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，日光照時間為10h/d的條件下進(jìn)行塊莖培養(yǎng)60d，待塊莖長至直徑約1.0cm即可出瓶下地種植。

E、移栽：將D步驟出瓶的塊莖取出，按常規(guī)洗凈塊莖上的培養(yǎng)基，放入質(zhì)量濃度為0.1～0.2%的多菌靈溶液中消毒1～2min后，移栽至質(zhì)量比為紅土：腐葉土=1︰1的營養(yǎng)基質(zhì)中，需40%~45%的遮陰度，按常規(guī)進(jìn)行澆水、施肥管理，生長40~60d后發(fā)芽出苗，即可得到嘉蘭百合種苗。

實(shí)施例2

A．外植體的選擇與滅菌：選取生長健壯且未形成花芽的莖尖和腋芽為外植體，剝?nèi)ネ鈱尤~片，切成1.5~2.0cm的小段，用常規(guī)的加有適量洗滌劑的水清洗后，在質(zhì)量濃度為0.1%的升汞溶液中消毒8min，再在質(zhì)量濃度為0.3%的次氯酸鈉溶液中消毒4min，然后用無菌水漂洗4次，每次2min，然后用無菌濾紙吸干，備用；

B、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：在無菌條件下，將經(jīng)過A步驟消毒滅菌后的小段接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA) 7.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.03mg/L+瓊脂7.0 g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，光照時間為11h/d的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)30d直至外植體萌發(fā)分化出0.5~1.5cm不定芽；

C、不定芽繼代增殖培養(yǎng)：將B步驟的不定芽在無菌條件下切下置于下列增殖培養(yǎng)基中：MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA)4.5mg/L+萘乙酸（NAA）0.08mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，日光照時間為11h/d的條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代周期為25d，繼代4代，獲得大量的帶有莖盤的不定芽；

D、塊莖培養(yǎng)：將C步驟獲得的帶有莖盤的不定芽在無菌條件下切成不定芽和莖盤兩部分，切下的不定芽返回接種至C步驟的增殖培養(yǎng)基中，再次進(jìn)行繼代培養(yǎng)；而切下的莖盤去除根、莖、葉后，將其分割成2~4塊（每塊粒徑為0.3~0.5cm大小）接種至下列塊莖培養(yǎng)基中：MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA)1.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.3mg/L+瓊脂7.0 g/L+蔗糖60g/L，pH=5.8，在培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，日光照時間為11h/d的條件下進(jìn)行塊莖培養(yǎng)55d，待塊莖長至直徑約1.0cm即可出瓶下地種植。

E、移栽：將D步驟出瓶的塊莖取出，按常規(guī)洗凈塊莖上的培養(yǎng)基，放入質(zhì)量濃度為0.1～0.2%的多菌靈溶液中消毒1～2min后，移栽至質(zhì)量比為紅土：腐葉土=1︰1的營養(yǎng)基質(zhì)中，需40%~45%的遮陰度，按常規(guī)進(jìn)行澆水、施肥管理，生長40~60d后發(fā)芽出苗，即可得到嘉蘭百合種苗。

實(shí)施例3

A．外植體的選擇與滅菌：選取生長健壯且未形成花芽的莖尖和腋芽為外植體，剝?nèi)ネ鈱尤~片，切成1.5~2.0cm的小段，用常規(guī)的加有適量洗滌劑的水清洗后，在質(zhì)量濃度為0.1%的升汞溶液中消毒10min，再在質(zhì)量濃度為0.3%的次氯酸鈉溶液中消毒3min，然后用無菌水漂洗3次，每次2min，然后用無菌濾紙吸干，備用；

B、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：在無菌條件下，將經(jīng)過A步驟消毒滅菌后的小段接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA) 8.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.05mg/L+瓊脂6.8 g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，光照時間為12h/d的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)20d直至外植體萌發(fā)分化出0.5~1.5cm不定芽；

C、不定芽繼代增殖培養(yǎng)：將B步驟的不定芽在無菌條件下切下置于下列增殖培養(yǎng)基中：MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA)5.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.1mg/L+瓊脂6.8g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，日光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代周期為20d，繼代5代，獲得大量的帶有莖盤的不定芽；

D、塊莖培養(yǎng)：將C步驟獲得的帶有莖盤的不定芽在無菌條件下切成不定芽和莖盤兩部分，切下的不定芽返回接種至C步驟的增殖培養(yǎng)基中，再次進(jìn)行繼代培養(yǎng)；而切下的莖盤去除根、莖、葉后，將其分割成2~4塊（每塊粒徑為0.3~0.5cm大?。┙臃N至下列塊莖培養(yǎng)基中：MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L+瓊脂6.8 g/L+蔗糖60g/L，pH=5.8，在培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，日光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行塊莖培養(yǎng)50d，待塊莖長至直徑約1.0cm即可出瓶下地種植。

E、移栽：將D步驟出瓶的塊莖取出，按常規(guī)洗凈塊莖上的培養(yǎng)基，放入質(zhì)量濃度為0.1～0.2%的多菌靈溶液中消毒1～2min后，移栽至質(zhì)量比為紅土：腐葉土=1︰1的營養(yǎng)基質(zhì)中，需40%~45%的遮陰度，按常規(guī)進(jìn)行澆水、施肥管理，生長40~60d后發(fā)芽出苗，即可得到嘉蘭百合種苗。

對比試驗(yàn)：

1. 供試材料：嘉蘭百合品種‘山里紅’；

2. 試驗(yàn)方法：同實(shí)施例1；

3. 試驗(yàn)結(jié)果：

3.1 不同激素配比對不定芽誘導(dǎo)的影響

在供試的8個培養(yǎng)基配比中，誘導(dǎo)率差異大，6-BA濃度高時不定芽誘導(dǎo)效果較好。從表1可見，處理，當(dāng)6-BA為8.0mg/L、NAA為0.01mg/L時誘導(dǎo)率最高，為92.1%；其次是處理，為85.0%。

表1 不同激素配比對不定芽誘導(dǎo)的影響

3.2 不同激素配比對不定芽增殖的影響

不定芽在不同激素濃度培養(yǎng)基中的生長情況見表2。6-BA濃度過高，不定芽生長細(xì)弱，玻璃化嚴(yán)重；當(dāng)6-BA濃度在4.0~5.0mg/L時，不定芽增殖倍數(shù)高，植株生長正常。

表2 不同激素配比對不定芽增殖的影響

3.3 不同蔗糖濃度對塊莖形成的影響

蔗糖濃度影響塊莖的形成。蔗糖濃度低，塊莖的形成率也低。從表3可見，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)60g/L時，塊莖的形成率最高，達(dá)84%；

表3 不同蔗糖濃度對塊莖形成的影響

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。