本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是涉及一種番茄組織培養(yǎng)方法使用的誘導(dǎo)、分化、生根培養(yǎng)基，利用該培養(yǎng)基番茄實(shí)現(xiàn)在試管中開(kāi)花結(jié)果的方法。

背景技術(shù)：

番茄屬于茄科、番茄屬、番茄種(拉丁文名稱Lycopersicon esculantumMill)。番茄是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，是世界范圍內(nèi)分布廣、消費(fèi)多的主要蔬菜，同時(shí)番茄又是生物科學(xué)研究中的一種重要實(shí)驗(yàn)材料，是研究果實(shí)發(fā)育和成熟的模式植物。通過(guò)組織培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)番茄在試管中開(kāi)花結(jié)果，可以為番茄生物科學(xué)研究提供一個(gè)新的方法。為進(jìn)一步探索植物開(kāi)花結(jié)果的原理機(jī)制，提供理論依據(jù)，也可以為園藝植物的微型培養(yǎng)提供新的途徑。

現(xiàn)有技術(shù)中的番茄組織培養(yǎng)方法主要用于優(yōu)良品種的快繁和番茄轉(zhuǎn)基因中的生物技術(shù)的基本操作，但是沒(méi)有番茄在試管中開(kāi)花結(jié)果的組織培養(yǎng)方法的研發(fā)，因?yàn)榉言谠嚬軆?nèi)開(kāi)花結(jié)果不同于土壤中開(kāi)花結(jié)果，因?yàn)樵嚬苤惺且粋€(gè)相對(duì)密閉的人為控制的微環(huán)境，難點(diǎn)在于對(duì)于光照、溫度的控制和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和激素配比，以達(dá)到滿足番茄能在試管內(nèi)開(kāi)花結(jié)果的需求。常規(guī)的番茄組織培養(yǎng)主要是為了調(diào)節(jié)番茄組織的分化增殖能力以提高番茄試管苗的繁殖系數(shù)，或者是為了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的需要進(jìn)行調(diào)控，當(dāng)番茄試管苗分化后就轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中，生根后就移栽至土壤中。本發(fā)明人是在番茄組織培養(yǎng)成熟技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)基中激素種類和濃度、營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了改進(jìn)。該發(fā)明中的激素調(diào)節(jié)主要為了番茄試管苗在試管中實(shí)現(xiàn)由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化達(dá)到開(kāi)花結(jié)實(shí)的目的，因此在激素的種類和濃度以及營(yíng)養(yǎng)成分與常規(guī)的番茄組織培養(yǎng)是大不相同的。由于試管內(nèi)開(kāi)花結(jié)實(shí)不受季節(jié)限制，可以隨時(shí)誘導(dǎo)，組培試管成花具有成花率高、重復(fù)性好、技術(shù)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此可被大量用于成花結(jié)實(shí)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中組織培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)番茄在試管中開(kāi)花結(jié)果的方法的空白，發(fā)明了一種在試管中進(jìn)行番茄組織培養(yǎng)的方法，實(shí)現(xiàn)了番茄試管苗在試管中由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化達(dá)到開(kāi)花結(jié)實(shí)的效果和目的。

本發(fā)明的內(nèi)容為：

一種在試管中進(jìn)行番茄組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步驟，分化幼莖步驟，培育生根和開(kāi)花結(jié)果步驟；所述方法的整個(gè)過(guò)程均在試管中完成，即本方法不僅能在試管中使番茄分化增殖，而且還在試管中完成開(kāi)花結(jié)實(shí)的組培過(guò)程。

在實(shí)際的組培中，在試管中進(jìn)行番茄組織培養(yǎng)的步驟為：

(1)所述的番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步驟為：取番茄幼嫩葉片，用自來(lái)水徹底沖洗后放在1％-10％的吐溫-20中停留2-10分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗3-4次，然后用0.1％升汞(HgCl₂)溶液表面滅菌2-10分鐘，再用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗4-5次；葉片組織剪成大小面積范圍為1mm×1mm～10mm×10mm作為外植體，接種到MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)0.1-10mgL^-1+吲哚乙酸(IAA)0.01-1mgL^-1+瓊脂4-10g L^-1+蔗糖20-50g的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷；

(2)所述的分化幼莖步驟為：將愈傷組織轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基，將愈傷組織分化為幼莖；

(3)培育生根，開(kāi)花結(jié)果步驟為：將幼莖接種到MS基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸IBA0.1-10mgL^-1+瓊脂4-10g L^-1+蔗糖20-50g的基質(zhì)中，其pH值為5.0-6.7，控制組織培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為23-25℃，光照為白色熒光，光強(qiáng)度定為65μE/m²/s，在12-20小時(shí)的光周期，12-4小時(shí)的暗周期中完成生根、開(kāi)花結(jié)果。

在具體的實(shí)踐中，所述在試管中進(jìn)行番茄組織培養(yǎng)的步驟為：

在所述的(1)番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步驟中：所述的用自來(lái)水徹底沖洗后放在5％的吐溫-20中停留時(shí)間為5分鐘；用0.1％升汞(HgCl₂)溶液表面滅菌時(shí)間為4分鐘；所述的葉片組織剪成大小范圍為5mm×5mm左右作為外植體，接種到培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL^-1+吲哚乙酸(I AA)0.2mgL^-1+瓊脂6g L^-1+蔗糖30g的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷；

在所述的(3)培育生根，開(kāi)花結(jié)果步驟中的幼莖接種的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸IBA1mgL^-1+瓊脂8g L^-1+蔗糖30g；所述的pH值為5.8；所述的組織培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為23-25℃，所述的光照為白色熒光，光強(qiáng)定為65μE/m²/s，所述的光周期為16小時(shí)，所述的暗周期8小時(shí)。

本發(fā)明完善了番茄組織培養(yǎng)的技術(shù)，即不僅能在試管中使番茄分化增殖，而且還可以在試管中開(kāi)花結(jié)實(shí)，由于在試管中培育的技術(shù)較難，目前世界上在試管中能夠開(kāi)花結(jié)實(shí)的植物種類很少，該項(xiàng)發(fā)明體現(xiàn)了組織培養(yǎng)的較高水平。

實(shí)施例

實(shí)例1

將番茄品種MicroTom田間生長(zhǎng)的葉片作為外植體，自來(lái)水下徹底沖洗，然后放在5％的吐溫-20中5分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗3-4次，0.1％升汞(HgCl₂)表面滅菌4分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗4-5次。

葉片組織剪成大小為5mm×5mm左右作為外植體，接種到培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL^-1+吲哚乙酸(IAA)0.2mgL^-1+瓊脂6g L^-1+蔗糖30g，誘導(dǎo)愈傷25-30天。

將愈傷轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)7-10天，愈傷組織分化為幼莖。將幼莖接種到MS基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸(IBA)1mgL^-1+瓊脂8g L^-1+蔗糖30g，pH值5.8，組織培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度23-25℃，白色熒光光強(qiáng)65μE/m²/s，16小時(shí)的光周期，8小時(shí)的暗周期。7天后生根、形成花蕾，15天開(kāi)花，30天果實(shí)轉(zhuǎn)色，45天果實(shí)成熟。

實(shí)例2

將番茄品種Bener Best田間生長(zhǎng)的葉片作為外植體，自來(lái)水下徹底沖洗，然后放在5％的吐溫-20中5分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗3-4次，0.1％升汞(HgCl₂)表面滅菌4分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗4-5次。

葉片組織剪成大小為5mm×5mm左右作為外植體，接種到培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL^-1+吲哚乙酸(IAA)0.2mgL^-1+瓊脂6g L^-1+蔗糖30g，誘導(dǎo)愈傷25-30天。

將愈傷轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)14-20天，愈傷組織分化為幼莖。將幼莖接種到MS基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸(IBA)1mgL^-1+瓊脂8g L^-1+蔗糖30g，pH值5.8，組織培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度23-25℃，光照為白色熒光，光強(qiáng)65μE/m²/s，16小時(shí)的光周期，8小時(shí)的暗周期。7天后生根、14天形成花蕾，20天開(kāi)花，40天果實(shí)轉(zhuǎn)色，60天果實(shí)成熟。