本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蘆筍全雄育種方法。本方法首先對二倍體蘆筍植株進行染色體加倍，獲得四倍體材料，之后對四倍體雄性材料進行花藥培養(yǎng)，從而獲得二倍體超雄株，大大提高超雄株的誘導(dǎo)率，同時獲得的二倍體超雄株生活力強，易成活。通過超雄株與雌株雜交組配，從而獲得全雄蘆筍新品種，這對蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：

一種蘆筍全雄育種方法，包括以下步驟：

（1）蘆筍四倍體植株的獲得：采用質(zhì)量濃度0.08%-0.12%秋水仙素對苗齡30-40d的健壯蘆筍秧苗嫩莖頂端進行處理，8-12d后篩選出具有40條染色體的秧苗，即四倍體；

（2）四倍體植株的種植：將獲得的苗齡70-80d的四倍體秧苗定植于大田，常規(guī)栽培管理；

（3）四倍體植株的花藥培養(yǎng)：待四倍體植株開花后，選取長勢健壯的雄性單株，采集其單核靠邊期的花藥進行花藥培養(yǎng)，獲得二倍體超雄株材料；

（4）雜交與全雄雜交種的獲得：以獲得的二倍體超雄株材料為父本，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、雌性單株為母本進行雜交授粉，收獲的種子即為全雄新品種。

進一步地，步驟中（1）中采用浸透質(zhì)量濃度0.08-0.12%秋水仙素溶液的脫脂棉包裹蘆筍秧苗嫩莖頂端48-54h，之后清水沖洗干凈。優(yōu)選的，采用浸透0.1%秋水仙素溶液的脫脂棉包裹蘆筍秧苗嫩莖頂端48-54h，之后清水沖洗干凈。

進一步地，步驟中（3）中采集的四倍體花藥在2-4℃、避光條件下預(yù)處理3-4d。

進一步地，步驟中（3）中花藥培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA1.0mg/L；培養(yǎng)條件為：32-33℃條件下避光培養(yǎng)2-3d，之后轉(zhuǎn)移至25-26℃、1800-2000Lx條件下培養(yǎng)，每天光照8-10h，直至愈傷組織出現(xiàn)。

進一步地，步驟（3）中芽分化培養(yǎng)基為：MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.5mg/L，將獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移至芽分化培養(yǎng)基上，28-30℃、2000-2500Lx條件下培養(yǎng)，每天光照8-10h，進行芽誘導(dǎo)，直至蘆筍幼苗高度4-6cm。

進一步地，將獲得的蘆筍幼苗先轉(zhuǎn)移至MS+2,4D0.05mg/L+KT0.5mg/L +IAA0.5mg/L+嘧啶醇0.5mg/L培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)根原基；之后再轉(zhuǎn)移至MS+IBA1.0mg/L+KT0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L+嘧啶醇1.5mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至生根。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果為：

1、顯著提高花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)效率，現(xiàn)有技術(shù)對二倍體植株進行花藥培養(yǎng)，單倍體誘導(dǎo)率極低，僅為10%以下。而本技術(shù)對四倍體植株進行花藥培養(yǎng)，獲得半數(shù)染色體再生植株的誘導(dǎo)率為48.1%。

2、顯著提高再生植株的移栽成活率，現(xiàn)有技術(shù)對二倍體植株進行花藥培養(yǎng)獲得的單倍體植株，由于染色體缺失一半，生活力低，定植成活率僅為30%以下；而本技術(shù)對四倍體植株進行花藥培養(yǎng)獲得的植株為二倍體，與栽培品種染色體一致，生活力強，定植成活率為90%以上。

3、本技術(shù)結(jié)果可靠、操作性強、更易選擇出優(yōu)良的全雄蘆筍新品種。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明。

實施例1

（1）蘆筍四倍體植株的獲得和種植：以蘆筍品種冠軍為材料，種子催芽后播種，播種后40d時，采用浸透0.1%秋水仙素溶液的脫脂棉包裹秧苗嫩莖頂端48h，之后清水沖洗干凈，再培養(yǎng)10d后取莖尖進行染色、壓片，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目，篩選出具有40條染色體的秧苗（四倍體），獲得四倍體62株（處理80株），誘導(dǎo)率77.5%。之后對四倍體繼續(xù)培養(yǎng)30d，定植于大田。

（2）優(yōu)選植株與花蕾：田間篩選綜合性狀優(yōu)良的四倍體單株為材料，開花盛期，上午10點前，選取生長健壯雄性單株上的花蕾，用鑷子撥出小孢子置于載玻片上，醋酸洋紅染色，顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育時期，挑選單核靠邊期的花藥進行花藥培養(yǎng)。

（3）花蕾前處理：田間采集單核靠邊期的花蕾后，置于培養(yǎng)皿中，在2-4℃、避光條件下預(yù)處理4d。

（4）愈傷組織誘導(dǎo)：將花藥滅菌，接種于1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA1.0mg/L上，32℃條件下避光培養(yǎng)2d，之后25℃下培養(yǎng)，直至愈傷組織出現(xiàn)，本試驗中愈傷組織誘導(dǎo)率38.7%。

（5）芽誘導(dǎo)：愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS+ NAA0.1mg/L + 6-BA1.5mg/L分化培養(yǎng)基中， 25℃下培養(yǎng)，直至幼苗莖高3-5cm。

（6)生根培養(yǎng):切取3mm左右的莖尖接種MS+2,4D0.05mg/L+KT0.5mg/L +IAA0.5mg/L+ 嘧啶醇0.5 mg/L培養(yǎng)基上，4d誘導(dǎo)根原基，4d莖尖開始向上生長，根原基開始形成；之后再轉(zhuǎn)移至MS+IBA1.0mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.1 mg/L+嘧啶醇1.5mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)，9d后莖基部的切口處被誘導(dǎo)分化出不定根，生根率89%。

（9）鏡檢：取生根后的蘆筍植株莖尖進行染色、壓片，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目，篩選出具有20條染色體的秧苗，即為超雄株，本實例中獲得287株再生苗，其中超雄株138株，占48.1%。

（10）移栽：將超雄株轉(zhuǎn)移至裝有蛭石：草炭（1:1）的穴盤中，常規(guī)栽培管理，本實例中移栽138株再生苗，成活128株，占92.8%。

（11）雜交組配：以上述獲得的超雄株為父本，優(yōu)良的雌株為母本進行雜交組配，后代即為全雄新品種。

實施例2

（1）蘆筍四倍體植株的獲得和種植：以蘆筍品種冠軍為材料，種子催芽后播種，播種后30d時，采用浸透0.12%秋水仙素溶液的脫脂棉包裹秧苗嫩莖頂端50h，之后清水沖洗干凈，再培養(yǎng)8d后取莖尖進行染色、壓片，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目，篩選出具有40條染色體的秧苗（四倍體），獲得四倍體58株（處理80株），誘導(dǎo)率72.5%。之后對四倍體繼續(xù)培養(yǎng)40d，定植于大田。

（2）優(yōu)選植株與花蕾：田間篩選綜合性狀優(yōu)良的四倍體單株為材料，開花盛期，上午10點前，選取生長健壯雄性單株上的花蕾，用鑷子撥出小孢子置于載玻片上，醋酸洋紅染色，顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育時期，挑選單核靠邊期的花藥進行花藥培養(yǎng)。

（3）花蕾前處理：田間采集單核靠邊期的花蕾后，置于培養(yǎng)皿中，在2-4℃、避光條件下預(yù)處理4d。

（4）愈傷組織誘導(dǎo)：將花藥滅菌，接種于1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA1.0mg/L上，32℃條件下避光培養(yǎng)2d，之后25℃下培養(yǎng)，直至愈傷組織出現(xiàn)，本試驗中愈傷組織誘導(dǎo)率39.4%。

（5）芽誘導(dǎo)：愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.5mg/L分化培養(yǎng)基中, 25℃下培養(yǎng)，直至幼苗莖高3-5cm。

（6)生根培養(yǎng):切取3mm左右的莖尖接種MS+2,4D0.05mg/L+KT0.5mg/L +IAA0.5mg/L+嘧啶醇0.5mg/L培養(yǎng)基上，3d誘導(dǎo)根原基，5d莖尖開始向上生長，根原基開始形成；之后再轉(zhuǎn)移至MS+IBA1.0mg/L+KT0.5mg/L+ NAA0.1 mg/L+ 嘧啶醇1.5mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)，7d后莖基部的切口處被誘導(dǎo)分化出不定根，生根率87.2%。

（9）鏡檢：取生根后的蘆筍植株莖尖進行染色、壓片，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目，篩選出具有20條染色體的秧苗，即為超雄株，本實例中獲得300株再生苗，其中超雄株142株，占47.3%。

（10）移栽：將超雄株轉(zhuǎn)移至裝有蛭石：草炭（1:1）的穴盤中，常規(guī)栽培管理，本實例中移栽142株再生苗，成活131株，占92.3%。

（11）雜交組配：以上述獲得的超雄株為父本，優(yōu)良的雌株為母本進行雜交組配，后代即為全雄新品種。

實施例3

（1）蘆筍四倍體植株的獲得和種植：以蘆筍品種冠軍為材料，種子催芽后播種，播種后35d時，采用浸透0.08%秋水仙素溶液的脫脂棉包裹秧苗嫩莖頂端54h，之后清水沖洗干凈，再培養(yǎng)12d后取莖尖進行染色、壓片，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目，篩選出具有40條染色體的秧苗（四倍體），獲得四倍體56株（處理80株），誘導(dǎo)率70%。之后對四倍體繼續(xù)培養(yǎng)35d，定植于大田。

（2）優(yōu)選植株與花蕾：田間篩選綜合性狀優(yōu)良的四倍體單株為材料，開花盛期，上午10點前，選取生長健壯雄性單株上的花蕾，用鑷子撥出小孢子置于載玻片上，醋酸洋紅染色，顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育時期，挑選單核靠邊期的花藥進行花藥培養(yǎng)。

（3）花蕾前處理：田間采集單核靠邊期的花蕾后，置于培養(yǎng)皿中，在2-4℃、避光條件下預(yù)處理4d。

（4）愈傷組織誘導(dǎo)：將花藥滅菌，接種于1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA1.0mg/L上，32℃條件下避光培養(yǎng)2d，之后25℃下培養(yǎng)，直至愈傷組織出現(xiàn)，本試驗中愈傷組織誘導(dǎo)率38.1%。

（5）芽誘導(dǎo)：愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS+ NAA0.1mg/L + 6-BA1.5mg/L分化培養(yǎng)基中，25℃下培養(yǎng)，直至幼苗莖高3-5cm。

（6)生根培養(yǎng):切取3mm左右的莖尖接種MS+2,4D0.05mg/L+KT0.5 mg/L +IAA 0.5 mg/L+嘧啶醇0.5mg/L培養(yǎng)基上，5d誘導(dǎo)根原基，3d莖尖開始向上生長，根原基開始形成；之后再轉(zhuǎn)移至MS+IBA1.0mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.1 mg/L+嘧啶醇1.5mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10d后莖基部的切口處被誘導(dǎo)分化出不定根，生根率86.8%。

（9）鏡檢：取生根后的蘆筍植株莖尖進行染色、壓片，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目，篩選出具有20條染色體的秧苗，即為超雄株，本實例中獲得295株再生苗，其中超雄株140株，占47.5%。

（10）移栽：將超雄株轉(zhuǎn)移至裝有蛭石：草炭（1:1）的穴盤中，常規(guī)栽培管理，本實例中移栽140株再生苗，成活129株，占92.1%。

（11）雜交組配：以上述獲得的超雄株為父本，優(yōu)良的雌株為母本進行雜交組配，后代即為全雄新品種。

對比例1：

將本申請中提及技術(shù)與目前公開的文獻中超雄株誘導(dǎo)技術(shù)獲得進行對比，結(jié)果表明（見下表），采用本技術(shù)較目前公開文獻提及的技術(shù)方法具有明顯的優(yōu)勢。

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對比例2：

分別將本技術(shù)獲得的超雄株試管苗和常規(guī)花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得的單倍體試管苗移栽至蛭石：草炭（1:1）的穴盤中，常規(guī)栽培管理，結(jié)果表明（見下表），采用本技術(shù)較目前常規(guī)技術(shù)方法具有明顯的優(yōu)勢。

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