專利名稱：采用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種采用微不定芽技術(shù)快速繁殖 轉(zhuǎn)基因青蒿的方法。
背景技術(shù)：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素(artemi
是從其地上部分分離的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是目前世界上公認(rèn)的 最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對(duì)于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點(diǎn)。
目前，世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)。另 外，隨著對(duì)青蒿素藥理研究的逐步深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗 血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)的功能，可見青蒿素是一種多用途的天然藥物。
目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非 常低(0.01%-1%),使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。由于青蒿素結(jié)構(gòu)復(fù) 雜，人工合成難度大，產(chǎn)量低，成本高，不具有可行性。另外，青蒿素在愈傷組織中含 量低于干重的0. 1%，在芽中最高也只有干重的0. 16%，而大多數(shù)研究者在根中沒有檢測 到青蒿素，因此利用組織培養(yǎng)及細(xì)胞工程生產(chǎn)青蒿素的可行性也不高。
隨著青蒿素生物合成途徑研究的逐漸深入以及植物次生代謝工程的不斷發(fā)展，利用 轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高青蒿中青蒿素的含量是一種頗具前景的方法。目前，已有青蒿素含量較 高的轉(zhuǎn)基因青蒿。然而，轉(zhuǎn)基因青蒿一般為雜合體，不具備遺傳穩(wěn)定性，后代中基因發(fā) 生分離，不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。從轉(zhuǎn)基因青蒿培育純系品種需要很長的時(shí)間，而且耗費(fèi)大量 的人力物力，這使得轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推廣受到了一定的限制。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的査新，現(xiàn)有文獻(xiàn)中目前已有多種植物通過微不定芽技術(shù)快速繁殖成 完整再生植株的報(bào)道。如果能通過微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿，將對(duì)保持轉(zhuǎn)基因 青蒿的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推廣、保障充足優(yōu)質(zhì)的青蒿種苗、提高青蒿 素產(chǎn)量具有重要意義。目前尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題所提及的采用微不定芽技術(shù)快速繁殖
轉(zhuǎn)基因青蒿的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種采用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn) 基因青蒿的方法。本發(fā)明中涉及的青蒿微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、微不定芽伸長培養(yǎng)基、不 定芽生根培養(yǎng)基和移栽基質(zhì)用于本發(fā)明微不定芽組織培養(yǎng)的方法，建立了用微不定芽技 術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，能夠在短時(shí)間內(nèi)繁殖出大量的轉(zhuǎn)基因青蒿苗，為轉(zhuǎn)基因 青蒿的大面積推廣、保障充足優(yōu)質(zhì)的青蒿種苗、提高青蒿素產(chǎn)量奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明將轉(zhuǎn)基因青蒿外植體經(jīng)過消毒后，置于 微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)光照培養(yǎng)，在外植體周圍長出大量微不定芽；將長有大量微 不定芽的外植體轉(zhuǎn)移到微不定芽伸長培養(yǎng)基上，使微不定芽伸長；切取伸長后的不定芽 轉(zhuǎn)移到不定芽生根培養(yǎng)基上，產(chǎn)生出不定根；將生長健壯的完整植株移栽到盛有移栽基 質(zhì)的花盆中，通過馴化獲得生長正常的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。
所述轉(zhuǎn)基因青蒿外植體的消毒，是指從轉(zhuǎn)基因青蒿植株上剪取外植體，用75%酒 精消毒20秒，無菌水清洗l遍，1.5% HgCl2消毒6分鐘，無菌水清洗5-6遍。
所述外植體為含有生長點(diǎn)的幼嫩莖段，長lcm-2cm。
所述微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是通過在MS培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L 6-芐基腺嘌呤 (6-BA)、 0.05 mg/L萘乙酸(NAA)、 30g/L蔗糖和6. 5g/L瓊脂粉而得。其中MS培養(yǎng) 基為Murashige and Skoog于1962公布。
所述經(jīng)光照培養(yǎng)，在外植體周圍長出大量微不定芽，是指培養(yǎng)溫度為25士rc， 每天光照16小時(shí)，每14-20天繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過1-2次繼代培養(yǎng)后在外植體周圍長 出大量微不定芽。
所述微不定芽伸長培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中添加30g/L蔗糖和6. 5g/L瓊脂粉。
所述使微不定芽伸長，是指培養(yǎng)溫度為25'C土rC，每天光照16小時(shí)，經(jīng)過14 天-20天使微不定芽伸長。
所述不定芽生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基(即MS培養(yǎng)基用量的一半)，其中添加30g/L 蔗糖和6. 5g/L瓊脂粉。
所述產(chǎn)生出不定根，是指培養(yǎng)溫度為25土rC，每天光照16小時(shí)，經(jīng)過7天-14 天可產(chǎn)生出不定根，從而形成完整的青蒿植株。
所述將生長健壯的完整植株移栽到盛有移栽基質(zhì)的花盆中，是指選取生長健壯的植株，移栽到裝有移栽基質(zhì)的穴盤中。
所述移栽基質(zhì)為珍珠巖泥炭，珍珠巖和泥炭的體積比為1: 1。
本發(fā)明采用微不定芽組織培養(yǎng)的方法，篩選出適合轉(zhuǎn)基因青蒿微不定芽誘導(dǎo)和生根 的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)基因青蒿外植體微不定芽誘導(dǎo)率超過90%，不定芽生根率為100%，再生植
株移栽存活率為100%，繁殖系數(shù)達(dá)到80-100，轉(zhuǎn)基因青蒿微不定芽快速繁殖技術(shù)的建
立，為快速繁殖出大量的轉(zhuǎn)基因青蒿苗，對(duì)轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推廣、保障充足優(yōu)質(zhì)的 青蒿種苗、提高青蒿素產(chǎn)量具有重要意義。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí) 施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。
實(shí)施例1
轉(zhuǎn)基因青蒿外植體的消毒和微不定芽的誘導(dǎo)
從轉(zhuǎn)基因青蒿植株上剪取含有生長點(diǎn)的幼嫩莖段(1 cm長)作為外植體。用75% 酒精消毒20秒，無菌水清洗1遍，1. 5% HgCl2消毒6分鐘，無菌水清洗5遍。將消毒 后的轉(zhuǎn)基因青蒿外植體轉(zhuǎn)移到微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA) +0.05 mg/L萘乙酸(NM) +3%蔗糖+0. 65%瓊 脂粉。培養(yǎng)溫度為25士rC，每天光照16小時(shí)，每14天繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過l次繼代 培養(yǎng)后在外植體周圍長出大量微不定芽(長度為1.5 cm)。微不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到91%。
轉(zhuǎn)基因青蒿微不定芽的伸長和生根
將長有大量微不定芽的外植體轉(zhuǎn)移到微不定芽伸長培養(yǎng)基上，所述微不定芽伸長培 養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0. 65%瓊脂粉。培養(yǎng)溫度為25士rC，每天光照16小時(shí)，經(jīng) 過20天可使微不定芽伸長至5cm。切取伸長后的不定芽轉(zhuǎn)移到不定芽生根培養(yǎng)基上， 所述不定芽生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基+3y。蔗糖+0.65。/。瓊脂粉。培養(yǎng)溫度為25土rC， 每天光照16小時(shí)，經(jīng)過10天可產(chǎn)生出不定根，不定根的分化率為100%，從而形成完 整的青蒿植株。
轉(zhuǎn)基因青蒿再生植株的移栽
選取生長健壯的植株，洗去根部的培養(yǎng)基，移栽到裝有移栽基質(zhì)的穴盤中，所述移 栽基質(zhì)中的成分為珍珠巖和泥炭，其比例為1: 1。通過馴化1周，可獲得大量生長正
常的轉(zhuǎn)基因青蒿植株，移栽存活率為100%。繁殖系數(shù)達(dá)到80。 實(shí)施例2
轉(zhuǎn)基因青蒿外植體的消毒和微不定芽的誘導(dǎo)
從轉(zhuǎn)基因青蒿植株上剪取含有生長點(diǎn)的幼嫩莖段(1.5cm長)作為外植體。用75% 酒精消毒20秒，無菌水清洗l遍，1.5% HgCl2消毒6分鐘，無菌水清洗5遍。將消毒 后的轉(zhuǎn)基因青蒿外植體轉(zhuǎn)移到微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA) +0.05 mg/L萘乙酸(NAA) +3%蔗糖+0. 65%瓊 脂粉。培養(yǎng)溫度為25士rC，每天光照16小時(shí)，每14天繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過l次繼代 培養(yǎng)后在外植體周圍長出大量微不定芽(長度為1.5 cm)。微不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到94%。
轉(zhuǎn)基因青蒿微不定芽的伸長和生根
將長有大量微不定芽的外植體轉(zhuǎn)移到微不定芽伸長培養(yǎng)基上，所述微不定芽伸長培 養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0. 65%瓊脂粉。培養(yǎng)溫度為25土rC，每天光照16小時(shí)，經(jīng) 過20天可使微不定芽伸長至5cm。切取伸長后的不定芽轉(zhuǎn)移到不定芽生根培養(yǎng)基上， 所述不定芽生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0. 65%瓊脂粉。培養(yǎng)溫度為25土rC， 每天光照16小時(shí)，經(jīng)過10天可產(chǎn)生出不定根，不定根的分化率為100%,從而形成完 整的青蒿植株。
轉(zhuǎn)基因青蒿再生植株的移栽
選取生長健壯的植株，洗去根部的培養(yǎng)基，移栽到裝有移栽基質(zhì)的穴盤中，所述移 栽基質(zhì)中的成分為珍珠巖和泥炭，其比例為l: 1。通過馴化1周，可獲得大量生長正 常的轉(zhuǎn)基因青蒿植株，移栽存活率為100%。繁殖系數(shù)達(dá)到90。
實(shí)施例3
轉(zhuǎn)基因青蒿外植體的消毒和微不定芽的誘導(dǎo)
從轉(zhuǎn)基因青蒿植株上剪取含有生長點(diǎn)的幼嫩莖段(2 cm長)作為外植體。用75% 酒精消毒20秒，無菌水清洗l遍，1. 5% HgCl2消毒6分鐘，無菌水清洗5遍。將消毒 后的轉(zhuǎn)基因青蒿外植體轉(zhuǎn)移到微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基+0. 5 mg/L 6-節(jié)基腺嘌呤(6-BA) +0. 05 mg/L萘乙酸(NM) +3%蔗糖+0. 65%瓊 脂粉。培養(yǎng)溫度為25士rC，每天光照16小時(shí)，每20天繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過l次繼代 培養(yǎng)后在外植體周圍長出大量微不定芽(長度為1.5 cm)。微不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到98%。
轉(zhuǎn)基因青蒿微不定芽的伸長和生根 將長有大量微不定芽的外植體轉(zhuǎn)移到微不定芽伸長培養(yǎng)基上，所述微不定芽伸長培 養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0. 65%瓊脂粉。培養(yǎng)溫度為25±rC，每天光照16小時(shí)，經(jīng) 過20天可使微不定芽伸長至5cm。切取伸長后的不定芽轉(zhuǎn)移到不定芽生根培養(yǎng)基上， 所述不定芽生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0. 65%瓊脂粉。培養(yǎng)溫度為25土rC， 每天光照16小時(shí)，經(jīng)過10天可產(chǎn)生出不定根，不定根的分化率為100%,從而形成完 整的青蒿植株。
轉(zhuǎn)基因青蒿再生植株的移栽
選取生長健壯的植株，洗去根部的培養(yǎng)基，移栽到裝有移栽基質(zhì)的穴盤中，所述移 栽基質(zhì)中的成分為珍珠巖和泥炭，其比例為1: 1。通過馴化1周，可獲得大量生長正 常的轉(zhuǎn)基因青蒿植株，移栽存活率為100%。繁殖系數(shù)達(dá)到100。
上述實(shí)施例可以快速繁殖出大量的轉(zhuǎn)基因青蒿植株，對(duì)于轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推 廣、保障充足優(yōu)質(zhì)的青蒿種苗、提高青蒿素產(chǎn)量具有重要意義。
權(quán)利要求
1.一種采用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，其特征在于，將轉(zhuǎn)基因青蒿外植體經(jīng)過消毒后，置于微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)光照培養(yǎng)，在外植體周圍長出大量微不定芽，將長有大量微不定芽的外植體轉(zhuǎn)移到微不定芽伸長培養(yǎng)基上，使微不定芽伸長，切取伸長后的不定芽轉(zhuǎn)移到不定芽生根培養(yǎng)基上，產(chǎn)生出不定根，將生長健壯的完整植株移栽到盛有移栽基質(zhì)的花盆中，通過馴化獲得生長正常的轉(zhuǎn)基因青蒿植株；所述微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中添加0.5mg/L 6-芐基腺嘌呤、0.05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和6.5g/L瓊脂粉；所述微不定芽伸長培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中添加30g/L蔗糖和6.5g/L瓊脂粉；所述不定芽生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，其中添加30g/L蔗糖和6.5g/L瓊脂粉；所述移栽基質(zhì)為珍珠巖泥炭，珍珠巖和泥炭的體積比為1∶1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述采用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，其特 征是，所述轉(zhuǎn)基因青蒿外植體的消毒，是指從轉(zhuǎn)基因青蒿植株上剪取外植體， 用酒精消毒，無菌水清洗，再HgCl2消毒，無菌水清洗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述采用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，其 特征是，用75%酒精消毒20秒，無菌水清洗l遍，再1.5% HgCl2消毒6分鐘， 無菌水清洗5遍。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述采用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法， 其特征是，所述外植體為含有生長點(diǎn)的幼嫩莖段，長lcm-2cm。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述采用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，其 特征是，所述經(jīng)光照培養(yǎng)，在外植體周圍長出大量微不定芽，是指培養(yǎng)溫度為 25'C士rC，每天光照16小時(shí)，每14天-20天繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過l次繼代培 養(yǎng)后在外植體周圍長出大量微不定芽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述采用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，其特 征是，所述使微不定芽伸長，是指培養(yǎng)溫度為25'C土rC，每天光照16小時(shí)， 經(jīng)過20天使微不定芽伸長。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述采用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，其特征是，所述產(chǎn)生出不定根，是指培養(yǎng)溫度為25t:士rc，每天光照16小時(shí)，經(jīng)過10天產(chǎn)生出不定根。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的用微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法。本發(fā)明將轉(zhuǎn)基因青蒿外植體經(jīng)過消毒后，置于微不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，在外植體周圍長出大量微不定芽；將長有大量微不定芽的外植體轉(zhuǎn)移到微不定芽伸長培養(yǎng)基中，使微不定芽伸長；切取伸長后的不定芽轉(zhuǎn)移到不定芽生根培養(yǎng)基上，產(chǎn)生出不定根；將生長健壯的完整植株移栽到盛有移栽基質(zhì)的花盆中，通過馴化獲得大量生長正常的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明篩選出適合轉(zhuǎn)基因青蒿微不定芽誘導(dǎo)和生根的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)基因青蒿外植體微不定芽誘導(dǎo)率超過90％，不定芽生根率為100％，再生植株移栽存活率為100％，繁殖系數(shù)達(dá)到80-100。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101176430SQ20071017042
公開日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者唐克軒, 凌 張, 景福遠(yuǎn), 王國豐 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)