本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種烏司他丁融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

烏司他丁是含有兩個(gè)kunitz型結(jié)構(gòu)域的單鏈糖蛋白，是重要的尿胰蛋白酶抑制劑(urinarytrypsininhibitor，uti)。在人體細(xì)胞中，uti是由a-microglobulinprecursor(ambp)基因編碼，含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。成熟的基因編碼產(chǎn)物含有147個(gè)氨基酸。烏司他丁對(duì)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、白細(xì)胞彈力蛋白酶、纖溶酶等在內(nèi)的多種蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制作用。此外uti還在抗炎、抗休克、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面起作用。

烏司他丁最初是從人尿中提取獲得。從人尿中來(lái)源的烏司他丁含有共價(jià)結(jié)合的硫酸軟骨素分子，并且高度糖基化。最初人們認(rèn)為共價(jià)結(jié)合的硫酸軟骨素以及糖基化對(duì)烏司他丁的生物活性至關(guān)重要，然而德國(guó)bayeraltiengsellschaft公司證明糖基化并非uti活性所必需。而后的研究表明，利用大腸桿菌(e.coli)表達(dá)的重組烏司他丁也同樣具有對(duì)胰蛋白酶的抑制作用。由于利用基因工程技術(shù)表達(dá)重組蛋白可以避免從尿液中提取蛋白存在的來(lái)源限制、樣品污染、后提取工藝復(fù)雜等，目前已成為獲得烏司他丁的最佳途徑。然而，目前利用基因工程手段從e.coli等微生物中獲得的重組烏司他丁產(chǎn)量仍然低，難以滿足商業(yè)化要求。

此外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，自人尿提取的烏司他丁給健康正常男性30萬(wàn)單位/10ml靜脈注射給藥后，3小時(shí)內(nèi)血藥濃度直線下降，清除半衰期為40分鐘；給藥后6小時(shí)給藥量的24％從尿中排泄。研制長(zhǎng)效的烏司他丁可以降低給藥劑量、減少給藥次數(shù)，具有良好的臨床應(yīng)用效益。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種烏司他丁融合蛋白，并提供了其制備與應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明涉及一種烏司他丁融合蛋白，其結(jié)構(gòu)為uti-rhsa所示；

其中，uti為烏司他丁，或其部分片段、突變體和缺失體；

rhsa為人血白蛋白，或其部分片段、突變體和缺失體。

1909年，beuer和berich首次報(bào)道了尿液中存在蛋白酶抑制劑(urinarytrypsininhibitor，uti)，現(xiàn)在也多稱之為烏司他丁(ulinastatin)，其在治療急性胰腺炎、輔助治療休克、改善手術(shù)預(yù)后尤其是減少體外循環(huán)并發(fā)癥等方面有重要的作用，加上其本身來(lái)源于人體，無(wú)免疫原性，安全性高。

本發(fā)明所提供的烏司他丁融合蛋白，生物效價(jià)好，且具有更長(zhǎng)的半衰期，且蛋白序列本身來(lái)源于人體，無(wú)免疫原性，安全性高。

其中，“部分片段、突變體和缺失體”的選擇為仍具有uti或rhsa活性的多肽片段，其選擇方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。

優(yōu)選的，如上所述的烏司他丁融合蛋白，所述uti的氨基酸序列如seqidno：1所示。

優(yōu)選的，如上所述的烏司他丁融合蛋白，所述rhsa的氨基酸序列如seqidno：2所示。

優(yōu)選的，如上所述的烏司他丁融合蛋白，所述uti與所述rhsa還包括linker；

優(yōu)選的，所述linker的氨基酸數(shù)目為1～30個(gè)；氨基酸數(shù)量可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)；

優(yōu)選的，所述linker的序列選自(ggggs)n、(gggs)n、(ggs)n或gn，其中n可以是1，2，3，4，5或6；

優(yōu)選的，所述linker的氨基酸序列如seqidno：3所示。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明還涉及編碼權(quán)利要求如上所述的烏司他丁融合蛋白的核苷酸序列。

優(yōu)選的，編碼所述uti的核苷酸序列如seqidno：4所示；

優(yōu)選的，編碼所述rhsa的核苷酸序列如seqidno：5所示；

優(yōu)選的，編碼所述linker的核苷酸序列如seqidno：6所示。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明還涉及一種表達(dá)盒，其含有如上所述的核苷酸序列；

優(yōu)選的，所述表達(dá)盒還包括表達(dá)蛋白二硫化物異構(gòu)酶pdi的核苷酸序列；

天然二硫鍵的形成是許多蛋白正確折疊中的限速步驟，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象和保持蛋白質(zhì)活性方面起重要作用。二硫化物異構(gòu)酶(proteindisulfideisomerase，pdi)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一種重要的蛋白折疊催化劑，它催化蛋白二硫鍵的形成和錯(cuò)誤配對(duì)二硫鍵的重排，并有抑制錯(cuò)誤折疊蛋白聚集的分子伴侶活性。

優(yōu)選的，所述pdi的核苷酸序列位于所述rhsa的下游；

優(yōu)選的，所述pdi的核苷酸序列如seqidno：7所示。

優(yōu)選的，如上所述的表達(dá)盒，在所述rhsa與所述pdi之間包括啟動(dòng)子元件；

優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子元件的核苷酸序列如seqidno：8所示。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明還涉及一種重組載體，其含有如上所述的核苷酸序列，或如上所述的表達(dá)盒。

本發(fā)明進(jìn)一步包含至少一種編碼如上所述的核酸分子的核構(gòu)建體，優(yōu)選為表達(dá)載體，比如質(zhì)粒，在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中會(huì)介紹該載體的構(gòu)建方法。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，其被如上所述的核苷酸序列，或如上所述的表達(dá)盒，或如上所述的重組載體所轉(zhuǎn)化；

所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，比如酵母，優(yōu)選為畢赤酵母。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明還涉及一種制備烏司他丁融合蛋白的方法，包括：

在培養(yǎng)基中和合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)如上所述的宿主細(xì)胞；

從培養(yǎng)基中或從所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中回收如此產(chǎn)生的烏司他丁融合蛋白。

如上所述的烏司他丁融合蛋白在制備用于治療和/或預(yù)防腫瘤、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、變態(tài)反應(yīng)以及感染的藥物中的應(yīng)用；

優(yōu)選的，所述腫瘤包括：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、黑色素瘤；

優(yōu)選的，所述自身免疫性疾病包括：關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、擴(kuò)張型心肌病樣疾病、斯耶格倫氏綜合征、過(guò)敏性接觸性皮炎、多肌炎、硬皮病、動(dòng)脈周性多動(dòng)脈炎、風(fēng)濕熱、白癜風(fēng)、胰島素依賴性糖尿病、白塞氏綜合征和慢性甲狀腺炎；

優(yōu)選的，所述神經(jīng)退行性疾病包括：帕金森氏病、亨廷頓氏病、馬查多-約瑟夫病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病。

本發(fā)明利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了烏司他丁與人血清白蛋白的融合蛋白，構(gòu)建了用于表達(dá)重組烏司他丁的質(zhì)粒，在表達(dá)質(zhì)粒中引入了與蛋白折疊和分泌相關(guān)的二硫鍵異構(gòu)酶基因(pdi)，及啟動(dòng)子元件pgap，并將pdi基因正確連接到pgap下游，實(shí)現(xiàn)了重組uti與人血白蛋白的融合蛋白的高量表達(dá)，融合蛋白經(jīng)純化后具有與重組uti基本相同的抑制胰蛋白酶的活性、在小鼠上與重組uti相比具有更長(zhǎng)的半衰期。本發(fā)明研制的uti人血白蛋白融合蛋白具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為質(zhì)粒ppicza::uti-rhsa構(gòu)建示意圖；

圖2為質(zhì)粒picza::uti構(gòu)建示意圖；

圖3為質(zhì)粒peasy-t3-pgap-pdi構(gòu)建示意圖；

圖4為質(zhì)粒ppicza::uti-rhsa-pdi構(gòu)建示意圖；

圖5為發(fā)酵上清電泳圖；a：ppbuh-uh上清；b:ppbuh-ulh上清；c:ppbuh-uhp上清；d:ppbuh-ulhp上清；

圖6為發(fā)酵上清和蛋白純化液sds-page電泳圖；a：ppbuh-uhp上清；b:ppbuh-ulhp上清；c：uti-hsa純化液；d:uti-l-hsa純化液；e：uti純化液。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例

1.畢赤酵母表達(dá)載體ppicza::uti-rhsa和ppicza::uti-l-rhsa的構(gòu)建

根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，設(shè)計(jì)烏司他丁的基因序列seqidno：4和人血白蛋白的基因序列seqidno：5及l(fā)inker(連接區(qū))的基因序列seqidno：6，并提交華大公司全基因合成，不含linker的融合蛋白的uti-rhsa序列以及含linker的融合蛋白的uti-l-rhsa序列。在融合蛋白基因的兩端分別引入xhoi和kpni的酶切位點(diǎn)，通過(guò)雙酶切后插入到同樣雙酶切的酵母表達(dá)載體picza中，經(jīng)t4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10，陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒分別命名為：picza::uti-rhsa,picza::uti-l-rhsa。

質(zhì)粒picza::uti-rhsa的圖譜如圖1所示。

2.uti表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

以putif:gttactcgaggtccatgtatgggtatgacttctagatac；和putir:gattggtacctcagagaccgagagcagc為上下游引物(分別引入了xhoi和kpni的酶切位點(diǎn))，以合成基因uti-rhsa為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增uti基因，pcr產(chǎn)物經(jīng)膠試劑盒回收后以xhoi和kpni雙酶切回收，與同樣雙酶切的酵母表達(dá)載體picza進(jìn)行連接，經(jīng)t4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10，陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒分別命名為：picza::uti，即為uti表達(dá)質(zhì)粒，其質(zhì)粒圖譜如圖2所示。

3.二硫鍵異構(gòu)酶基因(pdi)的克隆與ppicza::uti-rhsa-pdi和ppicza::uti-l-rhsa-pdi的構(gòu)建

從畢赤酵母gs115中克隆了與蛋白折疊和分泌相關(guān)的二硫鍵異構(gòu)酶基因(pdi)，同時(shí)克隆了高效表達(dá)啟動(dòng)子元件pgap，并將pdi基因正確連接到pgap下游,構(gòu)建pdi表達(dá)元件。提取畢赤酵母gs115的基因組，以基因組為模板以ppgapf(agatctatgtcttggtgtcctcgtc)和ppgapr(aagcttaataccgacagtgatagcc)分別為上下游引物(兩端分別設(shè)計(jì)了bglii和hindiii的酶切位點(diǎn))pcr擴(kuò)增獲得啟動(dòng)子元件pgap(序列如seqidno：8所示)，將此pcr產(chǎn)物用bglii和hindiii雙酶切后插入到同樣雙酶切的質(zhì)粒peasy-t3中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后挑選單克隆測(cè)序正確后提取質(zhì)粒備用，即為質(zhì)粒peasy-t3-pgap。以畢赤酵母gs115的基因組模板以pppdif(aagcttaaagaactgcccgatgaac)和pppdir(gcggccgcaggccaaccacaagatgaa)分別為上下游引物(兩端分別設(shè)計(jì)了hindiii和noti的酶切位點(diǎn))pcr擴(kuò)增獲得pdi基因(序列如seqidno：7所示)，將此pcr產(chǎn)物用hindiii和noti雙酶切后插入到同樣雙酶切的質(zhì)粒peasy-t3-pgap中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后挑選單克隆測(cè)序正確后提取質(zhì)粒備用，即為質(zhì)粒peasy-t3-pgap-pdi，質(zhì)粒圖譜如圖3所示。

用noti將含有pgap-pdi的dna片段從peasy-t3-pgap-pdi質(zhì)粒中切下來(lái)，并插入到前期工作構(gòu)建的ppicza::uti-rhsa和ppicza::uti-l-rhsa質(zhì)粒的noti酶切位點(diǎn)，得到質(zhì)粒ppicza::uti-rhsa-pdi和ppicza::uti-l-rhsa-pdi。質(zhì)粒ppicza::uti-rhsa-pdi的質(zhì)粒圖譜如圖4所示。

4.表達(dá)融合蛋白重組菌株的構(gòu)建和高效表達(dá)融合蛋白的重組菌株的篩選

將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒ppicza::uti-rhsa，ppicza::uti-l-rhsa，ppicza::uti-rhsa-pdi和ppicza::uti-l-rhsa-pdi以及ppicza::uti分別用bglii酶切獲得線性化的表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母gs115中，并涂布于含有100μg/ml的zeocin的ypd平板上。28℃培養(yǎng)3天，隨機(jī)挑取多個(gè)單克隆轉(zhuǎn)接到新鮮的含有100μg/ml的zeocin的ypd平板上，并分別提取基因組dna進(jìn)行pcr驗(yàn)證。以puhf(atgggtatgacttctagatacttc)和puhr(tcagagaccgagagcagcctg)分別為上下游引物，表達(dá)質(zhì)粒ppicza::uti-rhsa，ppicza::uti-l-rhsa，ppicza::uti-rhsa-pdi和ppicza::uti-l-rhsa-pdi的轉(zhuǎn)化菌株應(yīng)能夠擴(kuò)增出約2100bp的dna片段。以putif和putir為上下游引物，ppicza::uti的轉(zhuǎn)化菌株應(yīng)能夠擴(kuò)增出約530bp的dna片段。每個(gè)重組菌株隨機(jī)挑取36個(gè)單克隆，分別接種于含有3mlbmgy的大試管中，于28℃，220rpm培養(yǎng)18小時(shí)。取培養(yǎng)物于室溫下3000g離心1分鐘，收集菌體，并用2mlbmmy重新懸浮菌體，于28℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24小時(shí)向培養(yǎng)基中添加100％甲醇至終濃度1％。培養(yǎng)3天后，離心收集發(fā)酵液上清。通過(guò)page膠檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，最終獲得了表達(dá)量相對(duì)較高的轉(zhuǎn)化子，表達(dá)質(zhì)粒ppicza::uti-rhsa，ppicza::uti-l-rhsa，ppicza::uti-rhsa-pdi，ppicza::uti-l-rhsa-pdi和ppicza::uti轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115獲得的表達(dá)量高的重組菌株分別命名為ppbuh-uh,ppbuh-ulh,ppbuh-uhp和ppbuh-ulhp，pputi。

有pdi共表達(dá)的菌株ppbuh-uhp、ppbuh-ulhp較沒(méi)有pdi共表達(dá)的菌株ppbuh-uh、ppbuh-ulh的uti融合蛋白的表達(dá)量較高，如圖5所示。

5.uti及uti融合蛋白重組菌株的搖瓶發(fā)酵及融合蛋白純化

將融合蛋白的表達(dá)菌株ppbuh-uhp和ppbuh-ulhp，分別涂含有100μg/ml的zeocin的ypd平板上，自平板挑取單克隆接種到5mlypd試管中，30℃、250rpm培養(yǎng)過(guò)夜，18h后od600應(yīng)在15左右，再按按1‰接種量接種于100mlbmgy搖瓶中，30℃、250rpm培養(yǎng)24小時(shí)，3000g離心后收集菌體，將菌體懸于110mlbmmy中，加入終濃度為0.5％的甲醇，30℃、250rpm繼續(xù)培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加一次甲醇并測(cè)量od600，培養(yǎng)110小時(shí)后結(jié)束培養(yǎng)。5000g收集菌液上清。各取發(fā)酵上清約100ml，用10mmtrisph:8.5緩沖液稀釋至250ml,用固體tris將稀釋后的發(fā)酵上清ph值調(diào)節(jié)至8.5，上陰離子交換層析qff。以含0.1mnacl的10mmtrisph8.5緩沖液沖洗，以含nacl0.1m至1.0m的10mmtrisph8.5緩沖液作連續(xù)梯度洗脫，收集到2個(gè)蛋白峰，用sds-page檢測(cè)，樣品上樣過(guò)程中的流穿峰和0.1mnacl的沖洗峰中均無(wú)目標(biāo)蛋白，目標(biāo)蛋白基本在2個(gè)洗脫峰中，合并洗脫峰，通過(guò)截留10k的超濾離心管將緩沖液換為20mmph7.2的pb緩沖液中。因融合蛋白中含有人白蛋白，可用ge公司的bluesepharosehp親合層析，將換液后的蛋白液上bluesepharosehp層析柱，用含nacl0-1.5m的ph7.2的pb緩沖液做連續(xù)梯度洗脫，收集蛋白峰。接下來(lái)進(jìn)行疏水層析，用5mnacl將樣品電導(dǎo)值調(diào)至155ms/cm左右，蛋白樣品上ge公司的苯基高密疏水層析，緩沖液為buffera:10mmtrisph:7.52.5mnacl，bufferb:10mmtrisph:7.5。沖洗條件為100％buffera,洗脫條件為0-100％bufferb，收集蛋白洗脫峰，用截留10k的超濾離心管將緩沖液換為20mmph7.2的pb緩沖液中，用0.22um的除菌濾器過(guò)濾后即為純化液于-20℃冰箱備用。

表達(dá)菌株pputi涂含有100μg/ml的zeocin的ypd平板上，自平板挑取單克隆接種到5mlypd試管中，30℃、250rpm培養(yǎng)過(guò)夜，再按按1‰接種量接種于100mlbmgy搖瓶中，30℃、250rpm培養(yǎng)24小時(shí)，3000g離心后收集菌體，將菌體懸于110mlbmmy中，加入終濃度為0.5％的甲醇，30℃、250rpm繼續(xù)培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加一次甲醇并測(cè)量od600，培養(yǎng)110小時(shí)后結(jié)束培養(yǎng)。5000g收集菌液上清。各取發(fā)酵上清約100ml，用10mmtrisph:8.5緩沖液稀釋至250ml，用固體tris將稀釋后的發(fā)酵上清ph值調(diào)節(jié)至8.5,上陰離子交換層析qff。以含0.1mnacl的10mmtrisph8.5緩沖液沖洗，以含nacl0.1m至1.0m的10mmtrisph8.5緩沖液作連續(xù)梯度洗脫，收集蛋白峰，用sds-page檢測(cè)，合并目標(biāo)蛋白峰，通過(guò)截留10k的超濾離心管將緩沖液換為20mmph7.2的pb緩沖液中。用5mnacl將樣品電導(dǎo)值調(diào)至160ms/cm左右，蛋白樣品上ge公司的苯基高密疏水層析，緩沖液為buffera:10mmtrisph:7.52.5mnacl，bufferb:10mmtrisph:7.5。沖洗條件為100％buffera,洗脫條件為0-100％bufferb，收集蛋白洗脫峰，用截留10k的超濾離心管將緩沖液換為20mmph7.2的pb緩沖液中，用0.22um的除菌濾器過(guò)濾后即為純化液于-20℃冰箱備用。ppbuh-uhp和ppbuh-ulhp發(fā)酵上清以及純化的uti蛋白、融合蛋白u(yù)ti-rhsa，uti-l-rhsa的電泳結(jié)果如圖6所示，純化后的uti，uti-rhsa，uti-l-rhsa的純度在95％以上。

6.生物活性的檢測(cè)

按照《中國(guó)藥典》2015年版二部p83-84中烏司他丁溶液效價(jià)測(cè)定方法進(jìn)行，以人尿中提取的烏司他丁作對(duì)照，結(jié)果如下表所示，人尿中提取的烏司他丁的效價(jià)為3600u/mg，重組表達(dá)的uti活性為3700u/mg，而融合蛋白u(yù)ti-rhsa與uti-l-rhsa的比活按摩爾濃度計(jì)算與uti相當(dāng)，在4.4-5.0萬(wàn)u/nmol之間。

表1效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

7.小鼠異常毒性試驗(yàn)和大鼠血藥濃度檢測(cè)

取純化后的uti和uti-rhsa為實(shí)驗(yàn)組，分別以腹腔給藥方式，按5mg/kg劑量注射babl/c小鼠(體重18-22g)，以生理鹽水為陰性對(duì)照組，每組小鼠5只，觀察各組的異常情況，觀察7天，檢測(cè)體重變化。結(jié)果如下表所示，各組小鼠體重增加，均無(wú)異常。

表2小鼠異常毒性結(jié)果

取純化后的uti和uti-rhsa為實(shí)驗(yàn)組，以靜脈注射給藥方式，按1.0mg/kg/劑量注射sd大鼠(體重230-250g)，以生理鹽水為陰性對(duì)照組，每組大鼠3只，自尾靜脈取血，取血時(shí)間點(diǎn)為0，5min，20min，60min，120min，以elisa法檢測(cè)血中uti(包被兔抗uti多抗過(guò)夜，封閉后加稀釋100倍以上的血清樣品，加抗uti鼠源單抗和羊抗小鼠酶標(biāo)抗體，tmb顯色，2m硫酸終止反應(yīng)，450nm比色)elisa檢測(cè)的od值大于0.15判定為陽(yáng)性，每份血清自100倍稀釋，以后倍比稀釋，計(jì)算每份血清檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)的最大稀釋倍數(shù)計(jì)為滴度，每組3只大鼠的滴度結(jié)果取幾何平均值，陰性結(jié)果計(jì)為n，各組的結(jié)果如下表所示，uti組的滴度在5分鐘最大為102400，以后快速下降，半衰期小于20分鐘，在120分鐘時(shí)滴度僅為4031；融合蛋白u(yù)ti-rhsa組的滴度也是在5分鐘最大；由于融合蛋白和uti給藥的質(zhì)量相同但融合蛋白的分子量是uti分子量的6.6倍，所以檢測(cè)的血清滴度也相差4倍左右，但融合蛋白的血清半衰期比uti組應(yīng)明顯延長(zhǎng)，融合蛋白組半衰期應(yīng)在20分鐘以上，在120分鐘時(shí)滴度仍有5080。融合蛋白較uti的血清半衰期明顯延長(zhǎng)。

表3uti和uti-rhsa在大鼠血清中含量elisa檢測(cè)結(jié)果

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>北京百華百匯生物科技有限公司

<120>烏司他丁融合蛋白及其制備與應(yīng)用

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