本發(fā)明屬于林業(yè)經(jīng)濟(jì)植物領(lǐng)域，尤其是一種小松子組織培養(yǎng)再生體系構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
石油是一種不可再生資源，世界總有一天地面地下的石油資源會(huì)用盡枯竭，這也是戰(zhàn)略物資，是眾所周知的。因此，世界上開(kāi)發(fā)了潮水發(fā)電，風(fēng)能發(fā)電等，而在植物煉油領(lǐng)域尚在開(kāi)發(fā)研究階段。小油松也叫小松子、小松果，果實(shí)，可煉柴油，出油率在30%以上，是一種粗生粗長(zhǎng)，易管易種的樹(shù)木。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)消毒殺菌、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)、煉苗、移栽方法構(gòu)成再生體系，得到一種成活率高，苗壯、根粗樹(shù)茂的小松果樹(shù)，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是這樣的，一種小松子組織培養(yǎng)再生體系構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟：
（1）種子消毒：選擇初期成熟茶尚存青的小松子果實(shí)放入中等濃度的洗衣粉水浸泡32min，洗凈后自來(lái)水沖洗2.5h，取出經(jīng)消毒的種子，在超凈工作臺(tái)中，剝開(kāi)外種皮，先用75%乙醇消毒32s后用無(wú)菌水洗6次，再用0.1%升汞溶液消毒30min，用無(wú)菌水沖洗8次后備用；
（2）胚愈傷組織誘導(dǎo)：將經(jīng)步驟（1）處理后未成熟種胚切成0.6cm×0.6cm×0.6cm接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,先在29℃條件下全暗培養(yǎng)46天，然后每天光照15小時(shí)，光照強(qiáng)度為3200lx，直至誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織；
（3）分化培養(yǎng)：將步驟（2）培養(yǎng)獲得的呈綠色的子葉愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，接種后先在29℃條件下全暗培養(yǎng)15天，然后每天光照18小時(shí)，光照強(qiáng)度為5500lx，置于培養(yǎng)溫度為29℃的條件下培養(yǎng)直至形成叢生芽；
（4）生根培養(yǎng)：將步驟（3）過(guò)程獲得的高度約為3.6cm的叢生芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在29℃條件下全暗培養(yǎng)15天，然后每天光照18小時(shí)，光照強(qiáng)度為3200lx，培養(yǎng)溫度為29℃的條件下培養(yǎng)至生根；
（5）煉苗移栽：將步驟（4）獲得的高約9cm的生根試管苗去瓶蓋自然光照下煉苗8天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和黃沙泥混合成的基質(zhì)中并定植于大田中。
步驟（2）所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ER+5-BA4mg/L+NAA0.6mg/L+GA36 mg/L+蔗糖32g/L+瓊脂3.2g/L，pH為5.9。
步驟（3）所述的分化培養(yǎng)基為：ER+5-BA6mg/L+IBA0.6mg/L+蔗糖32g/L+瓊脂6.5g/L，pH為5.9。
步驟（4）所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA1.0mg/L+GGR2.2mg/L+KT3.5mg/L+蔗糖32g/L+瓊脂3.0g/L，pH為5.9。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的突出效果是：技術(shù)可靠，成熟，工藝路線簡(jiǎn)單，操作容易，成本低，形成的苗木栽種成活率高達(dá)90%以上，很好地解決了種苗稀缺的問(wèn)題，為今后林業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供了有力保障。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1：
（1）種子消毒：選擇處于進(jìn)入成熟期初期青綠色果實(shí)放入中性濃度洗衣粉水浸泡20min，刷凈后自來(lái)水沖洗半小時(shí)，取出種果，在超凈工作臺(tái)中，剝開(kāi)外種皮，先用70%乙醇消毒3s后用無(wú)菌水洗2次，再用0.1%升汞溶液消毒15min，用無(wú)菌水沖洗3次后備用，接種一周后統(tǒng)計(jì)污染率可低至2%。
（2）胚愈傷組織誘導(dǎo)：將經(jīng)步驟（1）處理后種胚切成0.6cm×0.6cm×0.6cm接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,先在26℃條件下全暗培養(yǎng)30天，然后每天光照8小時(shí)，光照強(qiáng)度為1600x，直至誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為65%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ER+5-BA1.0mg/L+NAA0.6mg/L+GA36mg/L+蔗糖12g/L+瓊脂3.2g/L，pH為5.5。
（3）分化培養(yǎng)：將步驟（2）培養(yǎng)獲得的呈綠色的子葉愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，接種后先在26℃條件下全暗培養(yǎng)6天，然后每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度為3500lx，培養(yǎng)溫度為26℃的條件下培養(yǎng)直至形成叢生芽，所述的分化培養(yǎng)基為ER+5-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖10g/L+瓊脂3.2g/L，pH為5.5。
（4）生根培養(yǎng)：將步驟（3）過(guò)程獲得的高度約為2.6～3.8cm的叢生芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在26℃條件下全暗培養(yǎng)6天，然后每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為3000lx，培養(yǎng)溫度為26℃的條件下培養(yǎng)至生根，生根率為90%。所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.1mg/L+GGR1.0mg/L+KT1.2mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂3.2g/L，pH為5.5。
（5）煉苗移栽：將步驟（4）獲得的高約8.5～9cm的生根試管苗去瓶蓋自然光照下煉苗8天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和黃沙泥混合成的基質(zhì)中并定植于大田中，移栽成活率可達(dá)92%。
實(shí)施例2：
（1）種子消毒：選擇1年半未成熟果，于洗衣粉水浸泡16min，刷凈后自來(lái)水沖洗1.5h，取出尚未成熟的種子，在超凈工作臺(tái)中，剝開(kāi)外種皮，先用75%乙醇消毒9s后用無(wú)菌水洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒11min，用無(wú)菌水沖洗5次后備用，接種一周后統(tǒng)計(jì)污染率可低至6%。
（2）胚愈傷組織誘導(dǎo)：將經(jīng)步驟（1）處理后未成熟種胚切成0.4cm×0.4cm×0.4cm接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,先在26℃條件下全暗培養(yǎng)32天，然后每天光照11小時(shí)，光照強(qiáng)度為1600x，直至誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為65%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ER+8-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L+GA34mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂3.6g/L，pH為5.9。
（3）分化培養(yǎng)：將步驟（2）培養(yǎng)獲得的呈綠色的子葉愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，接種后先在26℃條件下全暗培養(yǎng)8天，然后每天光照11小時(shí)，光照強(qiáng)度為2500lx，培養(yǎng)溫度為26℃的條件下培養(yǎng)直至形成叢生芽。所述的分化培養(yǎng)基為ER+8-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂3.0g/L，pH為5.9。
（4）生根培養(yǎng)：將步驟（3）過(guò)程獲得的高度約為3.6cm的叢生芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在26℃條件下全暗培養(yǎng)8天，然后每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為3000lx，培養(yǎng)溫度為26℃的條件下培養(yǎng)至生根，生根率為85%。所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.5mg/L+GGR2.0mg/L+KT1.2mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂3.0g/L，pH值為5.9。
（5）煉苗移栽：將步驟（4）獲得的高約9cm的生根試管苗去瓶蓋自然光照下煉苗8天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和黃沙泥混合成的基質(zhì)中并定植于大田中，移栽成活率可達(dá)90%以上。