本發(fā)明涉及一種黃精一次成苗的方法。
背景技術(shù)：
：黃精(Polygonatumsibiricum)為百合科黃精屬，多年生草本植物的總稱，是我國(guó)傳統(tǒng)大宗藥材，以根莖入藥，具有補(bǔ)氣健脾、潤(rùn)肺、益腎等功能。黃精作為集藥用、觀賞、美容和食用于一身的植物，經(jīng)濟(jì)價(jià)值巨大，應(yīng)用前景廣闊。隨著市場(chǎng)需求量的與日俱增，野生資源已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的需求，加之過度開采，致使野生資源越來越少。目前生產(chǎn)上多采用塊莖繁殖的方式栽培黃精，但塊莖繁殖的方法繁殖系數(shù)較低，成本較高，且長(zhǎng)期的無性繁殖引起黃精品質(zhì)退化，病蟲害問題日益嚴(yán)重，嚴(yán)重的限制了黃精的生產(chǎn)規(guī)模。而黃精種子則存在胚后熟的習(xí)性，自然條件下發(fā)芽率較低。隨著組培技術(shù)的日趨成熟，通過組培快繁的方式培育黃精種苗成為一種可行之道。目前，關(guān)于黃精組培快繁的研究報(bào)道較多，但多為器官發(fā)生途徑。主要通過愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)黃精外植體脫分化形成愈傷組織，然后再先后轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)愈傷細(xì)胞分化形成芽和根，從而形成完整的植株。該途徑在組織培養(yǎng)上較為成熟，但存在過程較多，周期較長(zhǎng)，操作中易污染等問題，增加了組培苗繁育的周期和成本。而組織培養(yǎng)的另一條途徑——胚胎發(fā)生途徑，則將外植體放在一次成苗培養(yǎng)基上誘導(dǎo)外植體形成胚性愈傷細(xì)胞，從而進(jìn)一步發(fā)育成完整植株。通過該途徑進(jìn)行組織培養(yǎng)，具有周期短，操作步驟少，成本較低等優(yōu)點(diǎn)，是工廠化生產(chǎn)組培苗的首選技術(shù)。但目前同過該途徑來進(jìn)行黃精的組織培養(yǎng)尚未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種黃精一次成苗的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種黃精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步驟：a.培養(yǎng)基的配置：在MS基本培養(yǎng)基中加入6-BA和2,4-D，調(diào)節(jié)pH并滅菌，在超凈工作臺(tái)上分裝至培養(yǎng)瓶中；b.外植體的選取及滅菌：選取長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)健壯的黃精植株，摘取幼嫩葉片作外植體，用流動(dòng)的自來水沖洗，去除塵土雜質(zhì)，用滅菌的剪刀在無菌條件下剪成外植體材料；c.外植體的接種：在超凈工作臺(tái)上將外植體接種在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，蓋好瓶蓋；d.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)室溫度、相對(duì)濕度和光暗周期；e.移栽煉苗：培養(yǎng)90天后，將大苗移出培養(yǎng)瓶，并用清水清洗干凈根部培養(yǎng)基，種植在營(yíng)養(yǎng)土中煉苗。優(yōu)選的方案中一種黃精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步驟：a.培養(yǎng)基的配置：在MS基本培養(yǎng)基中加入6-BA和2,4-D，調(diào)節(jié)pH為5.8～6.0，121℃滅菌20min后，在超凈工作臺(tái)上分裝至培養(yǎng)瓶中；b.外植體的選取及滅菌：選取長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)健壯的黃精植株，摘取幼嫩葉片作外植體，用流動(dòng)的自來水沖洗，去除塵土雜質(zhì)，然后用0.5％洗衣粉水浸泡，用自來水沖洗干凈，再用75％乙醇浸泡，無菌水沖洗四次，投入0.1％升汞中消毒，最后用無菌水沖洗5～8次，用滅菌的剪刀在無菌條件下剪成外植體材料；c.外植體的接種：在超凈工作臺(tái)上將外植體接種在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種3～4塊，蓋好瓶蓋；d.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)室溫度和相對(duì)濕度，在16h:8h的光暗周期的條件下培養(yǎng)；e.移栽煉苗：培養(yǎng)90天后，將4cm以上的大苗移出培養(yǎng)瓶，并用清水清洗干凈根部培養(yǎng)基，種植在泥炭土營(yíng)養(yǎng)土中煉苗。優(yōu)選的方案中一種黃精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步驟：a.培養(yǎng)基的配置：在MS基本培養(yǎng)基中加入6-BA和2,4-D，并使其濃度分別達(dá)到2mg/L和0.5mg/L，調(diào)節(jié)pH為5.8～6.0，121℃滅菌20min后，在超凈工作臺(tái)上分裝至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基厚2-3cm；b.外植體的選取及滅菌：選取長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)健壯的黃精植株，摘取未完全展開或剛展開的幼嫩葉片作外植體，用流動(dòng)的自來水沖洗1～3分鐘，去除塵土雜質(zhì)，然后用0.5％洗衣粉水浸泡6～8分鐘，用自來水沖洗干凈，再用75％乙醇浸泡20s，無菌水沖洗四次，投入0.1％升汞中消毒8～10min，最后用無菌水沖洗5～8次，用滅菌的剪刀在無菌條件下剪成1cm2外植體材料；c.外植體的接種：在超凈工作臺(tái)上將外植體接種在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，并使葉背面朝上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種3～4塊，蓋好瓶蓋；d.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度23～27℃，相對(duì)濕度70％～80％，在16h:8h的光暗周期的條件下培養(yǎng)；e.移栽煉苗：培養(yǎng)90天后，將4cm以上的大苗移出培養(yǎng)瓶，并用清水清洗干凈根部培養(yǎng)基，種植在泥炭土營(yíng)養(yǎng)土中煉苗，移栽后7天及時(shí)澆水保持土壤濕度，并遮陰，苗成活后即可撤去蔭棚，并適當(dāng)干燥蹲苗，培育壯苗。本發(fā)明一種黃精一次成苗的方法的有益效果是：與傳統(tǒng)的方法選取地下根莖進(jìn)行組織培養(yǎng)相比，選取黃精幼嫩葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，不僅取材容易、不損毀黃精根莖產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益，而且因?yàn)辄S精的葉片量大、繁殖系數(shù)更高，使得生產(chǎn)方法方便快捷，能在較短的時(shí)間內(nèi)培育出黃精的組培苗；且該方法操作簡(jiǎn)便，從外植體到幼苗只需要一個(gè)步驟，大大減少了人工作業(yè)，最大限度的降低了污染的發(fā)生；并且通過選擇優(yōu)良的母本來進(jìn)行黃精種質(zhì)提純復(fù)壯和優(yōu)良性狀的保持，對(duì)于黃精的優(yōu)良種苗繁育具有較高的應(yīng)用價(jià)值；本發(fā)明一種黃精一次成苗的方法操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)周期短，投入少，且技術(shù)易掌握，適于推廣應(yīng)用。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。實(shí)施例1：本發(fā)明一種黃精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步驟：a.培養(yǎng)基的配置：在MS基本培養(yǎng)基中加入6-BA和2,4-D，并使其濃度分別達(dá)到2mg/L和0.5mg/L，調(diào)節(jié)pH為5.8，121℃滅菌20min后，在超凈工作臺(tái)上分裝至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基厚2cm；b.外植體的選取及滅菌：選取長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)健壯的黃精植株，摘取未完全展開或剛展開的幼嫩葉片作外植體，用流動(dòng)的自來水沖洗1分鐘，去除塵土雜質(zhì)，然后用0.5％洗衣粉水浸泡6分鐘，用自來水沖洗干凈，再用75％乙醇浸泡20s，無菌水沖洗四次，投入0.1％升汞中消毒8min，最后用無菌水沖洗5次，用滅菌的剪刀在無菌條件下剪成1cm2外植體材料；c.外植體的接種：在超凈工作臺(tái)上將外植體接種在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，并使葉背面朝上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種3塊，蓋好瓶蓋；d.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度23℃，相對(duì)濕度70％，在16h:8h的光暗周期的條件下培養(yǎng)；e.移栽煉苗：培養(yǎng)90天后，將4cm以上的大苗移出培養(yǎng)瓶，并用清水清洗干凈根部培養(yǎng)基，種植在泥炭土營(yíng)養(yǎng)土中煉苗，移栽后7天及時(shí)澆水保持土壤濕度，并遮陰，苗成活后即可撤去蔭棚，并適當(dāng)干燥蹲苗，培育壯苗。實(shí)施例2：本發(fā)明一種黃精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步驟：a.培養(yǎng)基的配置：在MS基本培養(yǎng)基中加入6-BA和2,4-D，并使其濃度分別達(dá)到2mg/L和0.5mg/L，調(diào)節(jié)pH為6.0，121℃滅菌20min后，在超凈工作臺(tái)上分裝至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基厚3cm；b.外植體的選取及滅菌：選取長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)健壯的黃精植株，摘取未完全展開或剛展開的幼嫩葉片作外植體，用流動(dòng)的自來水沖洗3分鐘，去除塵土雜質(zhì)，然后用0.5％洗衣粉水浸泡8分鐘，用自來水沖洗干凈，再用75％乙醇浸泡20s，無菌水沖洗四次，投入0.1％升汞中消毒10min，最后用無菌水沖洗8次，用滅菌的剪刀在無菌條件下剪成1cm2外植體材料；c.外植體的接種：在超凈工作臺(tái)上將外植體接種在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，并使葉背面朝上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種4塊，蓋好瓶蓋；d.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度27℃，相對(duì)濕度80％，在16h:8h的光暗周期的條件下培養(yǎng)；e.移栽煉苗：培養(yǎng)90天后，將4cm以上的大苗移出培養(yǎng)瓶，并用清水清洗干凈根部培養(yǎng)基，種植在泥炭土營(yíng)養(yǎng)土中煉苗，移栽后7天及時(shí)澆水保持土壤濕度，并遮陰，苗成活后即可撤去蔭棚，并適當(dāng)干燥蹲苗，培育壯苗。實(shí)施例3：本發(fā)明一種黃精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步驟：a.培養(yǎng)基的配置：在MS基本培養(yǎng)基中加入6-BA和2,4-D，并使其濃度分別達(dá)到2mg/L和0.5mg/L，調(diào)節(jié)pH為5.9，121℃滅菌20min后，在超凈工作臺(tái)上分裝至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基厚3cm；b.外植體的選取及滅菌：選取長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)健壯的黃精植株，摘取未完全展開或剛展開的幼嫩葉片作外植體，用流動(dòng)的自來水沖洗2分鐘，去除塵土雜質(zhì)，然后用0.5％洗衣粉水浸泡7分鐘，用自來水沖洗干凈，再用75％乙醇浸泡20s，無菌水沖洗四次，投入0.1％升汞中消毒9min，最后用無菌水沖洗7次，用滅菌的剪刀在無菌條件下剪成1cm2外植體材料；c.外植體的接種：在超凈工作臺(tái)上將外植體接種在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，并使葉背面朝上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種3塊，蓋好瓶蓋；d.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度25℃，相對(duì)濕度75％，在16h:8h的光暗周期的條件下培養(yǎng)；e.移栽煉苗：培養(yǎng)90天后，將4cm以上的大苗移出培養(yǎng)瓶，并用清水清洗干凈根部培養(yǎng)基，種植在泥炭土營(yíng)養(yǎng)土中煉苗，移栽后7天及時(shí)澆水保持土壤濕度，并遮陰，苗成活后即可撤去蔭棚，并適當(dāng)干燥蹲苗，培育壯苗。實(shí)施例4：本發(fā)明根據(jù)植物細(xì)胞的全能性，利用黃精幼嫩葉片細(xì)胞分生能力強(qiáng)的特點(diǎn)，將黃精幼嫩葉片充分消毒滅菌并切成約1cm2外植體后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行成苗誘導(dǎo)，3周后即可分化形成淡黃色或白色致密的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)60天后體細(xì)胞胚胎發(fā)育形成具有根和芽的完整植株。植株進(jìn)一步在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至約4cm左右時(shí)，可以移栽煉苗。用于誘導(dǎo)黃精外植體一次成苗的培養(yǎng)基配方：MS基本培養(yǎng)基+2mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D。a、培養(yǎng)基的配制及滅菌(1)MS培養(yǎng)基母液的母液配制有些微量元素和有機(jī)成分成分濃度極低，因此，先配制成母液的母液，濃度如下表：(2)MS培養(yǎng)基母液配制MS-A(macro)：為工作液濃度的50倍。稱取NH4NO341.25g、KNO347.5g、MgSO4·7H2O9.25g、KH2PO49.25g，蒸餾水溶解，容量瓶定容至500ml。4℃的冰箱中保存。MS-B：吸取母液的母液若干，用蒸餾水定容至200ml，使終濃度如下表。4℃的冰箱中保存。母液終濃度H3BO30.124g/200mlMnSO4·4H2O0.338g/200mlZnSO4·7H2O0.172g/200mlCuSO4·5H2O0.0005g/200mlCoCl2·6H2O0.0005g/200mlKI0.0166g/200mlNa2MoO4·2H2O0.005g/200mlMS-C：稱取CaCl2·2H2O22.0g蒸餾水溶解，容量瓶定容至500ml。4℃的冰箱中保存。MS-D：吸取母液的母液若干，用蒸餾水定容至200ml，使終濃度如下表。4℃的冰箱中保存。MS-E：稱取Na2-EDTA3.725g、FeSO4·7H2O2.875g蒸餾水溶解，容量瓶定容至500ml。4℃的冰箱中避光保存。(3)MS培養(yǎng)基的配制①配制1升工作液，燒杯中放入700ml左右的蒸餾水，按順序分別吸取MS-A母液20ml、MS-B母液10ml、MS-C母液10ml、MS-D母液10ml、MS-E母液10ml。②加入固體蔗糖30g(根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)濃度)，溶解。③加入6-BA和2,4-D，定容至1000ml，并使其濃度分別達(dá)到2mg/L和0.5mg/L。④使用0.1－1mol/l的HCl或NaOH調(diào)整pH值為6.0。⑤加入7g瓊脂粉，使瓊脂濃度為0.7％。⑥配制好的培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min，然后乘熱在超凈工作臺(tái)上無菌分裝至培養(yǎng)瓶中，瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基厚3cm，封口消毒備用。b、外植體的選取及滅菌選取長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)健壯的黃精植株，摘取未完全展開或剛展開的幼嫩葉片作外植體，用流動(dòng)的自來水沖洗幾分鐘，去除塵土雜質(zhì)；然后用0.5％洗衣粉水浸泡8分鐘，用自來水沖洗干凈；再放入75％乙醇中浸泡20s，取出后用無菌水沖洗四次；接著投入0.1％升汞中消毒10min，后用無菌水沖洗6次，最后用滅菌的剪刀在無菌條件下剪成1cm2外植體備用。c、外植體接種在超凈工作臺(tái)上將外植體接種在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，并使葉背面朝上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種3塊，蓋好瓶蓋。所有操作環(huán)節(jié)應(yīng)嚴(yán)格注意無菌，避免污染。d、培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度25℃，相對(duì)濕度80％，在16h:8h的光暗周期下培養(yǎng)至成苗。e、移栽煉苗培養(yǎng)約90天后，將培養(yǎng)瓶中4cm以上的大苗移出，并用清水小心清洗干凈根部培養(yǎng)基，后移栽至泥炭土中煉苗。移栽后7天應(yīng)及時(shí)澆水保持土壤濕度，并遮陰。黃精幼苗成活返青后即可撤去蔭棚，并追施稀尿素水溶液，起苗前適當(dāng)干燥蹲苗，培育壯苗。當(dāng)前第1頁1 2 3