本發(fā)明屬于生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)工程領(lǐng)域，具體涉及一種雙層包埋的諸葛菜人工種子制作方法。
背景技術(shù)：
諸葛菜又稱二月蘭，十字花科諸葛菜屬植物，一年或二年生草本，廣泛分布于全國(guó)大部分地區(qū)，耐寒、耐旱、耐陰，病蟲(chóng)害少?；ǔ首仙虬咨?，生活史從每年9月至次年6月，甚至在寒冷冬季仍可保綠不枯，可以較好地覆蓋地面，是北方地區(qū)不可多得的早春觀花，冬季觀綠的地被植物，因此深受人們喜歡。諸葛菜種子的脂肪酸組成中，芥酸、亞麻酸含量低，棕櫚酸、油酸和亞油酸的含量為總脂肪的89.8％，即諸葛菜為高亞油酸低芥酸種質(zhì)，其種子油是品質(zhì)優(yōu)良的食用油，尤其適合心血管病患者食用。近年來(lái)諸葛菜在組織培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交等方面的研究多有進(jìn)展，諸葛菜人工種子技術(shù)也頗有進(jìn)展，現(xiàn)在已經(jīng)建立了一套較為完整的諸葛菜人工種子制作方法，但距離實(shí)際應(yīng)用還有一定距離。
根據(jù)人工種皮材料的不同，人工種子有不同的包埋方式。Kitto等試驗(yàn)了8種水溶性樹(shù)脂，認(rèn)為聚氧乙烯可作為內(nèi)種皮；Redenbaugh(1986)試驗(yàn)了26中水凝膠最終確定用海藻酸鈉制作的人工種子萌發(fā)率最高，由此開(kāi)啟了用海藻酸鈉制作人工種皮的體系?，F(xiàn)在的研究者普遍通過(guò)海藻酸鈉與氯化鈣絡(luò)合反應(yīng)制作人工種子，通過(guò)在海藻酸鈉中加入不同添加劑改變?nèi)斯しN皮各種屬性。
目前單層包埋人工種子技術(shù)已取得一定進(jìn)展，添加了納米二氧化鈦的單層包埋諸葛菜人工種子可以在有菌環(huán)境中萌發(fā)，但抗菌能力不夠強(qiáng)、萌發(fā)率不高等問(wèn)題仍然制約著人工種子技術(shù)的發(fā)展。單層包埋技術(shù)是將一切營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和殺菌劑加入同一層種皮，這種做法既增加了外界微生物與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸，也使得繁殖體完全包裹在有害的殺菌劑中。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種雙層包埋的諸葛菜人工種子制作方法，制作出來(lái)的諸葛菜人工種子具有較高的抗菌能力、萌發(fā)率和生根率。
本發(fā)明采用具體技術(shù)方案為：
一種雙層包埋的諸葛菜人工種子制作方法，包括步驟：
步驟(1)，諸葛菜的芽簇誘導(dǎo)：取諸葛菜幼苗,無(wú)菌水沖洗，切取腋芽和頂芽，消毒后進(jìn)行芽簇誘導(dǎo)培養(yǎng)；
步驟(2)，諸葛菜的芽繁培養(yǎng)：取步驟(1)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的諸葛菜組培苗，切取幼芽，轉(zhuǎn)接到芽繁培養(yǎng)基上進(jìn)行芽繁培養(yǎng)；
步驟(3)，諸葛菜芽的包埋和人工種子膠囊制備：取步驟(2)中在芽繁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的幼芽，切取若干個(gè)一定長(zhǎng)度的芽并逐個(gè)放在內(nèi)種皮包埋液表面，所述內(nèi)種皮包埋液是含納米二氧化鈦nTiO2、NAA、MS培養(yǎng)基和蔗糖的質(zhì)量濃度為6％海藻酸鈉水溶膠；用玻璃吸管先吸取少量包埋液，再吸入一個(gè)諸葛菜芽，然后滴入質(zhì)量濃度為2％的CaCl2溶液中，絡(luò)合反應(yīng)9-11min形成固態(tài)人工種子；用鑷子取出所述固態(tài)人工種子，放在外種皮包埋液中，使外種皮均勻裹上一層包埋液，所述外種皮包埋液是含有納米二氧化鈦nTiO2、納米二氧化硅nSiO2的質(zhì)量濃度為7％或8％海藻酸鈉水溶膠；用鑷子將人工種子取出，放入質(zhì)量濃度為2％的CaCl2溶液中，絡(luò)合反應(yīng)1.5-2.5min形成雙層包埋的固態(tài)人工種子。
進(jìn)一步，所述步驟(1)中的芽簇誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分包括：MS培養(yǎng)基、2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3％蔗糖、0.65％瓊脂；芽簇誘導(dǎo)過(guò)程的光照強(qiáng)度為2000～3000Lux日光燈照射12小時(shí)。
進(jìn)一步，所述步驟(2)中的芽繁培養(yǎng)基的成分包括：MS培養(yǎng)基、2.5mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3％蔗糖、0.65％瓊脂；芽繁培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2000～3000Lux日光燈照射12小時(shí)。
進(jìn)一步，所述步驟(3)中幼芽在芽繁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)時(shí)間為30天；切取若干個(gè)芽的長(zhǎng)度為8mm。
進(jìn)一步，所述步驟(3)中內(nèi)種皮包埋液的成分包括：質(zhì)量濃度為6％海藻酸鈉水溶膠、0.25-0.3mg/L NAA、10-15g/L nTiO2、1/2MS培養(yǎng)基、3％蔗糖；外種皮包埋液的成分包括：質(zhì)量濃度為7-8％海藻酸鈉水溶膠、30-40g/L nTiO2、15-30g/L nSiO2。
進(jìn)一步，所述nTiO2為銳鈦型納米TiO2，其粒徑為15±5nm；所述nSiO2粒徑為15±5nm；
進(jìn)一步，所述內(nèi)種皮包埋液中NAA為0.25mg/L，nTiO2為15g/L；所述外種皮包埋液中nTiO2為30g/L，nSiO2為15g/L，海藻酸鈉質(zhì)量濃度為7％。
本發(fā)明的有益效果是：
1.因添加納米二氧化鈦，常規(guī)的海藻酸鈉(質(zhì)量濃度小于5％)難以使諸葛菜人工種子固化形成膠囊，本發(fā)明根據(jù)納米二氧化鈦的濃度調(diào)節(jié)海藻酸鈉濃度，選擇6％海藻酸鈉濃度水溶膠作為內(nèi)種皮包埋液，7-8％海藻酸鈉濃度水溶膠作為內(nèi)種皮包埋液，解決了諸葛菜人工種子難以固化的問(wèn)題。
2.本發(fā)明生產(chǎn)的人工種子具有很好的抗菌效果，完全可用于有菌環(huán)境下播種，與單層包埋的諸葛菜人工種子相比具有明顯優(yōu)勢(shì)；可顯著提高種子的萌發(fā)率和生根率，對(duì)植株毒害作用較小，為諸葛菜人工種子從實(shí)驗(yàn)室走進(jìn)大田提供了技術(shù)支持。
3.本發(fā)明開(kāi)展了內(nèi)種皮不同配比的NAA和納米TiO2、外種皮不同配比的納米TiO2和納米SiO2對(duì)諸葛菜人工種子萌發(fā)、生根和抗菌能力影響的實(shí)驗(yàn)；內(nèi)外種皮的最佳組合，實(shí)現(xiàn)了納米二氧化鈦的抗菌和促萌、促生能力和納米二氧化硅的強(qiáng)化種皮機(jī)械強(qiáng)度能力的完美結(jié)合。
4.本發(fā)明通過(guò)將不同成分按不同比例分別加入內(nèi)外種皮包埋液中，使各成分的優(yōu)勢(shì)得以彰顯，劣勢(shì)得以避免，從而使諸葛菜人工種子可以在有菌環(huán)境中生根發(fā)芽，為人工種子技術(shù)進(jìn)一步走向?qū)嶋H應(yīng)用提供技術(shù)支持。
5.實(shí)現(xiàn)內(nèi)外種皮的雙層包埋的人工種子更接近自然界的種子，為種子的形成和萌發(fā)研究提供生物學(xué)模型。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明的實(shí)施例中，一種雙層包埋的諸葛菜人工種子制作方法，包括以下步驟：
步驟1，諸葛菜的芽簇誘導(dǎo)：取諸葛菜幼苗,無(wú)菌水沖洗3分鐘，切取腋芽和頂芽，在超凈工作臺(tái)上完成消毒,無(wú)菌接種在芽簇誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行芽簇誘導(dǎo)培養(yǎng)；芽簇誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分包括：MS培養(yǎng)基、2mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、0.2mg/L NAA(α-萘乙酸)、3％蔗糖、0.65％瓊脂；芽誘導(dǎo)過(guò)程的光照強(qiáng)度2000～3000Lux日光燈照射12小時(shí)。
步驟2，諸葛菜的芽繁培養(yǎng)：取步驟1芽簇誘導(dǎo)培養(yǎng)的諸葛菜組培苗，切取幼芽，轉(zhuǎn)接到芽繁培養(yǎng)基上進(jìn)行芽繁培養(yǎng)；芽繁培養(yǎng)基的成分包括：MS培養(yǎng)基、2.5mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3％蔗糖及0.65％瓊脂；芽繁培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2000～3000Lux日光燈照射12小時(shí)。
步驟3，諸葛菜芽的雙層包埋和人工種子膠囊制備：取步驟2中在芽繁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)30天的幼芽，切取若干個(gè)8mm的芽，并逐個(gè)放在內(nèi)種皮包埋液表面，內(nèi)種皮包埋液是含15g/L銳鈦型納米二氧化鈦nTiO2(粒徑為15±5nm)、0.25mg/L NAA、1/2MS培養(yǎng)基和3％蔗糖的質(zhì)量濃度為6％海藻酸鈉S.A水溶膠；用玻璃吸管先吸取少量包埋液，再吸入一個(gè)諸葛菜芽，然后滴入質(zhì)量濃度為2％的CaCl2溶液中，絡(luò)合反應(yīng)10min形成固態(tài)人工種子；用鑷子取出所述固態(tài)人工種子，放在外種皮包埋液中，使外種皮均勻裹上一層包埋液，外種皮包埋液是含有30g/L銳鈦型納米二氧化鈦nTiO2(粒徑為15±5nm)、15g/L納米二氧化硅nSiO2(粒徑為15±5nm)的質(zhì)量濃度為7％海藻酸鈉S.A水溶膠；用鑷子將人工種子取出，放入質(zhì)量濃度為2％的CaCl2溶液中，絡(luò)合反應(yīng)2min形成雙層包埋的固態(tài)人工種子，于無(wú)菌水中清洗并吸干表面水分即可。
上述步驟1、步驟2和步驟3中的MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，包括：大量元素：NH4NO3為1650mg/L、KNO3為1900mg/L、CaCl2·2H2O為440mg/L、MgSO4·7H2O為370mg/L、KH2PO4為170mg/L；微量元素：KI為0.83mg/L、H3BO3為6.2mg/L、MnSO4·4H2O為22.3mg/L、ZnSO4·7H2O為8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O為0.25mg/L、CuSO4·5H2O為0.025mg/L、CoCl2·6H2O為0.025mg/L；鐵鹽：FeSO4·7H2O為27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O為37.3mg/L；有機(jī)物質(zhì)：肌醇為100mg/L煙酸為0.5mg/L、鹽酸吡哆醇(維生素B6)為0.5mg/L、鹽酸硫胺素(維生素B1)為0.1mg/L、甘氨酸為2.0mg/L。
下面根據(jù)本發(fā)明制作的諸葛菜人工種子進(jìn)行有菌萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證本發(fā)明制作的諸葛菜人工種子的萌發(fā)、生根和抗菌能力。
調(diào)節(jié)內(nèi)外種皮包埋液成分的配比，進(jìn)行諸葛菜人工種子的有菌萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)組設(shè)置如表1所示，根據(jù)本發(fā)明的制作方法制作諸葛菜人工種子，在珍珠巖上進(jìn)行有菌萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表1雙層包埋諸葛菜人工種子有菌萌發(fā)實(shí)驗(yàn)組
表2雙層包埋諸葛菜人工種子有菌萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從表2可看出，12個(gè)實(shí)驗(yàn)組中萌發(fā)率、生根率和污染率綜合表現(xiàn)較好的是A8組，內(nèi)種皮包埋液成分為6％S.A+15g/L nTiO2+0.25mg/L NAA，外種皮包埋液成分為7％S.A+30g/L nTiO2+15g/Ln SiO2，萌發(fā)率為91.7％，生根率為75％，30d污染率僅為25％。
以上對(duì)本發(fā)明所提供的一種雙層包埋的諸葛菜人工種子制作方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理和實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，所要說(shuō)明的是，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。