本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種卡特蘭組培繁殖方法。

背景技術(shù)：

卡特蘭，是國際上最有名的蘭花之一。原產(chǎn)美洲熱帶，為巴西、哥倫比亞等國國花。品種在數(shù)千個以上，顏色有白、黃、綠、紅紫等。繁殖用分株、組織培養(yǎng)或無菌播種，性喜溫暖、潮濕和充足的光照?？ㄌ靥m高效繁殖的主要手段就是組織培養(yǎng)。國外一些發(fā)達國家常常采用工廠化育苗技術(shù)以及組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，不僅可以創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益，同時也培育了很多優(yōu)良品種，然而我國關(guān)于卡特蘭組織培養(yǎng)的快繁技術(shù)研究仍然處于初級階段，在很大程度上阻礙了卡特蘭的規(guī)模化生產(chǎn)。并且現(xiàn)有的其他蘭花品種的組織培養(yǎng)不能直接運用到卡特蘭培養(yǎng)上，所以現(xiàn)在目前急需一種卡特蘭組培繁殖方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種消毒效果好、培養(yǎng)繁殖快、成苗率高、褐變率低的卡特蘭組培繁殖方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種卡特蘭組培繁殖方法，包括以下步驟：

(1)材料選?。哼x取無病蟲害長勢良好的卡特蘭植株，進行5～8d的遮光處理，遮光處理后，選取長勢健壯植株上的新芽作為外植體；

(2)外植體預處理：用抗氧化劑溶液洗滌剛切割的外植體花芽傷口表面；

(3)外植體消毒：用軟刷毛將選取的外植體花芽在水池中進行初步清洗，去除表面的泥沙，然后用洗潔精清洗干凈，置于流水下沖洗30min，然后在超凈臺上剝除外植體花芽最外面的一層苞葉，在經(jīng)高溫滅菌過的75％酒精中浸泡1～2s，然后在浸泡在10％的次氯酸鈉溶液中初次消毒10min，初次消毒后，用無菌水沖洗5遍，再剝?nèi)ヒ粚影~，放入5％的次氯酸鈉溶液中再次消毒5min，接著采用重復消毒的方式，每次次氯酸鈉的濃度為上次消毒的一半，消毒時間也為上次消毒的一半，直至剝至留下最后的芽體，最后切取5mm左右的芽尖，泡在0.5％的次氯酸鈉溶液中消毒1min，用無菌水沖洗6～8次，用消毒濾紙吸干表面水分后放置于培養(yǎng)皿中備用；

(4)誘導培養(yǎng)：將消毒后的外植體，接種在誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，先進行7～10d的弱光照培養(yǎng)，光照強度為500～700lx，然后在進行常規(guī)光照培養(yǎng)，光照強度為1500～2000lx，培養(yǎng)溫度為24～26℃，光照時間為13h/d；所述誘導培養(yǎng)基為：1/2MS+0.4～0.8mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+10～15％椰汁+490～510mg/L檸檬酸+5～7g/L PVP，pH值為5.4～5.5；

(5)增殖培養(yǎng)：誘導培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+2～4mg/L 6-BA+0.4～0.6mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+10～15％椰汁+490～510mg/L檸檬酸+2～4g/L PVP，pH值為5.4～5.5；培養(yǎng)溫度25～28℃，光照時間為13h/d，光照強度為1500～2000lx；

(6)壯苗生根：增殖培養(yǎng)后，選擇高2cm以上、外植體上有明顯突起的小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為：MS+1.4～1.6mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/LNAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+10～15％椰汁+8～12％香蕉汁+7～10％土豆泥，pH值為5.4～5.5；培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度25～28℃，光照時間為13h/d，光照強度為1500～2000lx；

(7)移栽：當試管苗生長至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養(yǎng)苗，用清水洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，清洗時注意不要損害根部，然后移栽至培養(yǎng)基質(zhì)中，保持濕度和通風，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃。

如上所述的一種卡特蘭組培繁殖方法，進一步說明為，所述誘導培養(yǎng)基為：1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L瓊脂+13％椰汁+500mg/L檸檬酸+6g/L PVP。

如上所述的一種卡特蘭組培繁殖方法，進一步說明為，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L瓊脂+13％椰汁+500mg/L檸檬酸+3g/L PVP。

如上所述的一種卡特蘭組培繁殖方法，進一步說明為，所述生根培養(yǎng)基為：MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L瓊脂+13％椰汁+10％香蕉汁+9％土豆泥。

如上所述的一種卡特蘭組培繁殖方法，進一步說明為，所述抗氧化劑溶液選用谷胱甘肽。

本發(fā)明的有益效果是：通過本發(fā)明能對卡特蘭進行快速培養(yǎng)繁殖，并且培養(yǎng)后的卡特蘭苗株成苗率高，苗株品質(zhì)好，栽培后適應(yīng)性強，通過生物技術(shù)手段在短時間內(nèi)，滿足了商業(yè)化生產(chǎn)的需求，為企業(yè)規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)卡特蘭提供了技術(shù)支持。同時本組培繁殖方法消毒效果好、褐變率低，從而大大提高了成苗率及工作效率，節(jié)約了資源。

附圖說明

圖1為本發(fā)明流程示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式做進一步的闡述。

如圖1所示，本發(fā)明提供的一種卡特蘭組培繁殖方法，包括以下步驟：材料選取、外植體預處理、外植體消毒、誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗生根和移栽，本方法消毒效果好、培養(yǎng)繁殖快、成苗率高及褐變率低，從而能夠降低卡特蘭在組培過程中的褐變率，增大成苗率，提高工作效率，下面對方法中的每個步驟做詳細闡述。

(1)材料選?。哼x取無病蟲害長勢良好的卡特蘭植株，進行5～8d的遮光處理，遮光處理后，選取長勢健壯植株上的新芽作為外植體；采用無病蟲害長勢良好的卡特蘭植株能夠降低苗株的發(fā)病率，保證在組培過程中不受其他因素的干擾，增加外植體成活率，并且經(jīng)過遮光處理，能夠降低褐變率。

(2)外植體預處理：用抗氧化劑溶液洗滌剛切割的外植體花芽傷口表面；能夠最大程度地減少氧氣與外植體切面接觸的機會，同時充分的析出外植體中水溶性的多酚物質(zhì)和醌類物質(zhì)，較少酚類物質(zhì)的氧化，從而有效地減輕卡特蘭外植體在組織培養(yǎng)過程中的褐變，作為優(yōu)選，所述抗氧化劑選用谷胱甘肽溶液，還可以選用抗壞血酸，還可以將幾種抗氧化劑結(jié)合在一起使用。

(3)外植體消毒：用軟刷毛將選取的外植體花芽在水池中進行初步清洗，去除表面的泥沙，然后用洗潔精清洗干凈，置于流水下沖洗30min，然后在超凈臺上剝除外植體花芽最外面的一層苞葉，在經(jīng)高溫滅菌過的75％酒精中浸泡1～2s，然后在浸泡在10％的次氯酸鈉溶液中初次消毒10min，初次消毒后，用無菌水沖洗5遍，再剝?nèi)ヒ粚影~，放入5％的次氯酸鈉溶液中再次消毒5min，接著采用重復消毒的方式，每次次氯酸鈉的濃度為上次消毒的一半，消毒時間也為上次消毒的一半，直至剝至留下最后的芽體，例如接下來用2.5％的次氯酸鈉溶液再次消毒2.5min，沖洗后剝?nèi)ヒ粚影~，再用1.25％的次氯酸鈉溶液再次消毒1.25min，依次類推；最后切取5mm左右的芽尖，泡在0.5％的次氯酸鈉溶液中消毒1min，用無菌水沖洗6～8次，用消毒濾紙吸干表面水分后放置于培養(yǎng)皿中備用。采用階梯式消毒法，在不斷剝?nèi)グ碌耐瑫r，采用不同的濃度的次氯酸鈉溶液進行消毒，可以使消毒效果更好，減少細菌污染的同時，提高成活率。

(4)誘導培養(yǎng)：將消毒后的外植體，接種在誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，先進行7～10d的弱光照培養(yǎng)，光照強度為500～700lx，然后在進行常規(guī)光照培養(yǎng)，光照強度為1500～2000lx，培養(yǎng)溫度為24～26℃，光照時間為13h/d；先進行一段時間的弱光照培養(yǎng)，能夠使外植體在培養(yǎng)過程中逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件，有利于存活，同時抑制褐變的發(fā)生。所述誘導培養(yǎng)基為：1/2MS+0.4～0.8mg/L6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+10～15％椰汁+490～510mg/L檸檬酸+5～7g/L PVP，pH值為5.4～5.5；表1為誘導培養(yǎng)基的多種實施例：

作為優(yōu)選，所述誘導培養(yǎng)基為：1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L瓊脂+13％椰汁+500mg/L檸檬酸+6g/L PVP，即為表1中培養(yǎng)基1的成分及用量。

(5)增殖培養(yǎng)：誘導培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+2～4mg/L 6-BA+0.4～0.6mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+10～15％椰汁+490～510mg/L檸檬酸+2～4g/L PVP，pH值為5.4～5.5；培養(yǎng)溫度25～28℃，光照時間為13h/d，光照強度為1500～2000lx；表2為增殖培養(yǎng)基的多種實施例：

作為優(yōu)選，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L瓊脂+13％椰汁+500mg/L檸檬酸+3g/L PVP，即為表2中培養(yǎng)基7的成分及用量。

(6)壯苗生根：增殖培養(yǎng)后，選擇高2cm以上、外植體上有明顯突起的小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為：MS+1.4～1.6mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/LNAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+10～15％椰汁+8～12％香蕉汁+7～10％土豆泥，pH值為5.4～5.5；培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度25～28℃，光照時間為13h/d，光照強度為1500～2000lx；表3為生根培養(yǎng)基的多種實施例：

作為優(yōu)選，所述生根培養(yǎng)基為：MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L瓊脂+13％椰汁+10％香蕉汁+9％土豆泥，即為表3中培養(yǎng)基13的成分及用量。

(7)移栽：當試管苗生長至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養(yǎng)苗，用清水洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，清洗時注意不要損害根部，然后移栽至培養(yǎng)基質(zhì)中，保持濕度和通風，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃。通過本發(fā)明能對卡特蘭進行快速培養(yǎng)繁殖，并且培養(yǎng)后的卡特蘭苗株成苗率高，苗株品質(zhì)好，栽培后適應(yīng)性強，通過生物技術(shù)手段在短時間內(nèi)，滿足了商業(yè)化生產(chǎn)的需求，為企業(yè)規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)卡特蘭提供了技術(shù)支持。同時本組培繁殖方法消毒效果好、褐變率低，從而大大提高了成苗率及工作效率，節(jié)約了資源。

本發(fā)明并不限于上述實例，在本發(fā)明的權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員不經(jīng)創(chuàng)造性勞動即可做出的各種變形或修改均受本專利的保護。