本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化的外植體選擇方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大豆是重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，是食用植物油和植物蛋白的主要來(lái)源，在飼料加工和生物能源開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域均占有重要位置。轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)的良好社會(huì)效益和巨大經(jīng)濟(jì)效益推動(dòng)了大豆轉(zhuǎn)基因應(yīng)用研究的迅猛發(fā)展，但受制于基因型依賴，大豆遺傳轉(zhuǎn)化依然是植物基因工程領(lǐng)域的難點(diǎn)之一。當(dāng)前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)是應(yīng)用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因研究的主要技術(shù)方法，其中子葉節(jié)法因具有實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、外植體獲得便利、轉(zhuǎn)化周期較短等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前大豆轉(zhuǎn)基因研究應(yīng)用最廣，轉(zhuǎn)化效率最穩(wěn)定的方法。

大豆子葉節(jié)外植體經(jīng)器官發(fā)生途徑獲得再生植株，其中經(jīng)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的不定芽源自具有再生能力的分生細(xì)胞，種子萌發(fā)過(guò)程中，子葉節(jié)外植體的分生細(xì)胞也在不斷變化，不同狀態(tài)的分生細(xì)胞其細(xì)胞活力存在差異，而細(xì)胞活力是影響轉(zhuǎn)化再生的關(guān)鍵因素之一，通常靶細(xì)胞活力越強(qiáng)，其分生能力和生命力越旺盛，與農(nóng)桿菌的互作能力越強(qiáng)，有助于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的獲得和再生。因此，研究不同生長(zhǎng)狀態(tài)子葉節(jié)外植體分生細(xì)胞的活力及其對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性，有助于提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備大豆目標(biāo)子葉節(jié)外植體的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)檢測(cè)待測(cè)大豆種子在6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率和叢生芽率，選擇滿足如下A和B，作為外植體制備候選萌發(fā)時(shí)期；

A為6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率中顯著高的某個(gè)萌發(fā)狀態(tài)或某幾個(gè)萌發(fā)狀態(tài)；

B為6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的叢生芽率中顯著高的某個(gè)萌發(fā)狀態(tài)或某幾個(gè)萌發(fā)狀態(tài)；

2)檢測(cè)待測(cè)大豆種子在所述外植體制備候選萌發(fā)時(shí)期下子葉節(jié)外植體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率，選擇所有候選萌發(fā)時(shí)期子葉節(jié)外植體的轉(zhuǎn)化率顯著高的某個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期或某幾個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期，作為外植體制備時(shí)期；

3)對(duì)所述外植體制備時(shí)期的待測(cè)大豆種子截取子葉節(jié)，得到待測(cè)大豆目標(biāo)子葉節(jié)外植體；

上述顯著為0.05水平的顯著性檢驗(yàn)，即P<0.05。

所述6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)為如下(1)-(6)：

(1)Y狀態(tài)：子葉呈白色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為White Group 155A或155B),下胚軸包裹在種皮中；

(2)YL狀態(tài)：子葉呈白色，下胚軸突破種皮且呈白色；

(3)HG狀態(tài)：子葉呈白色，下胚軸突破種皮且呈黃綠色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為Yellow-Green Group 145A或144B)。

(4)HG+CG狀態(tài)：子葉近下胚軸處呈黃綠色其余部分呈白色，下胚軸突破種皮且呈綠色(The RHS Colour Chart描述Green Group 143B或143C)；

(5)CG狀態(tài)：子葉全部呈黃綠色，下胚軸突破種皮且呈綠色；

(6)G狀態(tài)：子葉葉邊緣呈墨綠色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為Green Group 139A)，下胚軸突破種皮且呈綠色；

選取處于如下6種萌發(fā)形態(tài)的種子為從萌發(fā)開(kāi)始至148h這個(gè)時(shí)間段選取。

上述方法中，步驟1)中，所述檢測(cè)待測(cè)大豆種子在6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的方法包括如下步驟：將報(bào)告基因分別轉(zhuǎn)入6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體，得到每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因外植體，檢測(cè)所述轉(zhuǎn)基因外植體中轉(zhuǎn)入報(bào)告基因的外植體，計(jì)算所述每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因外植體中轉(zhuǎn)入報(bào)告基因的外植體與所述每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的數(shù)量比或數(shù)量百分比，得到每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率；

所述檢測(cè)待測(cè)大豆種子在6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的叢生芽率的方法包括如下步驟：用農(nóng)桿菌分別侵染6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體，得到每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染后外植體，將所述每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染后外植體進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)對(duì)應(yīng)的叢生芽誘導(dǎo)后外植體；檢測(cè)所述叢生芽誘導(dǎo)后外植體中帶有叢生芽的外植體，計(jì)算所述每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)對(duì)應(yīng)的叢生芽誘導(dǎo)后外植體中帶有叢生芽的外植體與所述每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的數(shù)量比或數(shù)量百分比，得到每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的叢生芽率；

步驟2)中，所述檢測(cè)待測(cè)大豆種子在所述外植體制備候選萌發(fā)時(shí)期下子葉節(jié)外植體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率的方法包括如下步驟：將外源基因分別轉(zhuǎn)入每個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期下子葉節(jié)外植體，得到每個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染后外植體，將所述每個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染后外植體依次進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，得到再生植株，檢測(cè)再生植株中轉(zhuǎn)入外源基因的再生植株，計(jì)算每個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期對(duì)應(yīng)的再生植株中轉(zhuǎn)入外源基因的再生植株與所述每個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期下子葉節(jié)外植體的數(shù)量比或數(shù)量百分比，得到每個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期下子葉節(jié)外植體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率。

上述方法中，

所述報(bào)告基因?yàn)镚US；

或，所述農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌，具體為EHA105；

或，所述外源基因?yàn)镋PSPS基因；

或，所述外源基因通過(guò)表達(dá)其的載體GR16導(dǎo)入外植體，

或，所述待測(cè)大豆的品種為Jack、中黃10號(hào)或水里站。

上述方法中，所述檢測(cè)所述轉(zhuǎn)基因外植體中轉(zhuǎn)入報(bào)告基因的外植體的時(shí)間為將外源基因轉(zhuǎn)入6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的第3天；

或所述檢測(cè)所述叢生芽誘導(dǎo)后外植體中帶有叢生芽的外植體的時(shí)間為所述誘導(dǎo)培養(yǎng)第15-30天。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種選擇大豆子葉節(jié)外植體制備候選萌發(fā)時(shí)期的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括上述方法的步驟1)。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種選擇大豆子葉節(jié)外植體制備時(shí)期的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括上述方法的步驟1)-2)。

本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種制備大豆子葉節(jié)外植體的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，包括參數(shù)采集系統(tǒng)和可讀性載體；

所述參數(shù)采集系統(tǒng)包括采集所述可讀性載體中涉及的子葉顏色、下胚軸顏色和形態(tài)的參數(shù)采集設(shè)備和參數(shù)采集試劑；

所述可讀載體記載如下6種種子萌發(fā)形態(tài)：

(1)Y狀態(tài)：子葉呈白色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為White Group 155A或155B),下胚軸包裹在種皮中；

(2)YL狀態(tài)：子葉呈白色，下胚軸突破種皮且呈白色；

(3)HG狀態(tài)：子葉呈白色，下胚軸突破種皮且呈黃綠色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為Yellow-Green Group 145A或144B)。

(4)HG+CG狀態(tài)：子葉近下胚軸處呈黃綠色其余部分呈白色，下胚軸突破種皮且呈綠色(The RHS Colour Chart描述Green Group 143B或143C)；

(5)CG狀態(tài)：子葉全部呈黃綠色，下胚軸突破種皮且呈綠色；

(6)G狀態(tài)：子葉葉邊緣呈墨綠色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為Green Group 139A)，下胚軸突破種皮且呈綠色；

上述試劑盒中，

所述參數(shù)采集設(shè)備包括種子萌發(fā)容器；

所述參數(shù)采集試劑包括用于種子萌發(fā)的培養(yǎng)基或培養(yǎng)體系。

上述試劑盒中，所述參數(shù)采集設(shè)備包括種子萌發(fā)容器；

所述參數(shù)采集試劑包括用于種子萌發(fā)的培養(yǎng)基或培養(yǎng)體系。

上述的試劑盒在制備大豆子葉節(jié)外植體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述的試劑盒中的所述可讀性載體或所述參數(shù)采集系統(tǒng)在制備大豆子葉節(jié)外植體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述的試劑盒中的所述可讀性載體或所述參數(shù)采集系統(tǒng)在選擇大豆子葉節(jié)外植體制備的種子候選萌發(fā)時(shí)期中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述方法或上述的試劑盒中的所述可讀性載體或所述參數(shù)采集系統(tǒng)在大豆轉(zhuǎn)基因研究或轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將外源基因?qū)胩幱诓煌N子萌發(fā)狀態(tài)的某品種大豆子葉節(jié)中，選取穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率顯著高的狀態(tài)，為該品種大豆子葉節(jié)外植體最佳制備期?，F(xiàn)有的方法僅選擇大豆某一萌發(fā)時(shí)期的子葉節(jié)外植體，會(huì)造成外植體選取的不全面。本發(fā)明的方法選取的外植體全面，有助于提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化的效率。

附圖說(shuō)明

圖1為大豆品種外植體狀態(tài)分類示意圖。

其中，圖1A為Jack品種外植體狀態(tài)分類示意圖；圖1B為中黃10號(hào)品種外植體狀態(tài)分類示意圖；圖1C為水里站品種外植體狀態(tài)分類示意圖。

圖2為大豆品種外植體狀態(tài)隨萌發(fā)時(shí)間變化趨勢(shì)圖：

其中，圖2A為Jack品種外植體狀態(tài)隨萌發(fā)時(shí)間變化趨勢(shì)圖；圖2B為中黃10號(hào)品種外植體狀態(tài)隨萌發(fā)時(shí)間變化趨勢(shì)圖；圖2C為水里站品種外植體狀態(tài)隨萌發(fā)時(shí)間變化趨勢(shì)圖。

圖3為Jack、中黃10號(hào)和水里站三個(gè)品種在兩種外植體制備方法條件下不同狀態(tài)外植體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率差異分析結(jié)果圖。

圖4為Jack品種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率、叢生芽率、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率分析結(jié)果圖；

其中圖4A為Jack品種不同狀態(tài)外植體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率分析結(jié)果圖；圖4B為Jack品種不同狀態(tài)外植體叢生芽率分析結(jié)果圖；圖4C為Jack品種不同狀態(tài)外植體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率分析結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所采用的外植體制備方法傳統(tǒng)的劃痕法(S)記載在如下文獻(xiàn)中：Hinchee M A W,Connor-Ward D V,Newell C A,McDonnell R E,Sato S J,Gasser C S,Fischhoff D A,Re D B,Fraley R T,Horsch R B.Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer.Biotechnology.1988,6:915–922；

下述實(shí)施例中所采用的外植體制備方法超聲波與表面活性劑協(xié)同處理法(B+C)記載在如下文獻(xiàn)中：Guo B F,Guo Y,wang J,et al.Co-Treatment with Surfactant and Sonication Significantly Improves Agrobacterium-mediated Resistant Bud Formation and Transient Expression Efficiency in Soybean.Journal of Integrative Agriculture.2014,Doi:10.1016/S2095-3119(14)60907-2。

下述實(shí)施例中所用數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS。

下述實(shí)施例中的Jack記載在如下文獻(xiàn)中：Venkata S.Tavva,Yul-Ho Kim,Isabelle A.Kaganetal.,Plant cell rep(2007)26:61-70.Increasedα-tocopherol content in soybean seed overexpressing the Perillafrutescensγ-tocopherolmethyltransferase gene；

下述實(shí)施例中的中黃10號(hào)記載在如下文獻(xiàn)中：<<中國(guó)大豆品種志>>，邱麗娟、王曙明主編，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007；

下述實(shí)施例中的水里站品種記載在如下文獻(xiàn)中：《中國(guó)大豆品種資源目錄》，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所主編，農(nóng)業(yè)出版社，1982；

上述品種公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的pSoy17記載在如下參考文獻(xiàn)：楊曉鳳，盧濤，周正劍，等.α-硫辛酸對(duì)大豆農(nóng)桿菌介導(dǎo)GUS瞬時(shí)表達(dá)和芽誘導(dǎo)的影響.大豆科學(xué).2011,30(4):552-556；公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。pSoy17載體含有GUS基因。

下述實(shí)施例中的GR16記載在如下參考文獻(xiàn)：華中農(nóng)業(yè)大學(xué).改造合成的蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白基因Cry1C^*.中國(guó):1483823A.2004-03-24；公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。GR16載體含有EPSPS除草劑抗性基因。

下述實(shí)施例中的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105記載在如下文獻(xiàn)中：XQ Wang,X Shen,HE Yun-Mian,et al.An Optimized Freeze-thaw Method for Transformation of Agrobacterium Tumefaciens EHA105and LBA4404.Pharmaceutical Biotechnology.2011,18(5):382-386；公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的萌發(fā)培養(yǎng)基按照如下方法配置，B5粉3.2g，蔗糖30g，加水定容至1L，用5M KOH調(diào)節(jié)PH至5.85，瓊脂8g；121℃,20min高壓滅菌后分裝。

下述實(shí)施例中的重組菌浸染外植體的共培養(yǎng)培養(yǎng)液按照如下方法配置：B5粉0.32g/L，MES 3.9g/L，蔗糖30g/L，6-BA 1.67mg/L，PH為5.45，瓊脂8g/L。121℃,20min高壓滅菌，加入過(guò)濾除菌的GA3 0.25mg/L，乙酰丁香酮39mg/L。4℃冰箱中備用。

下述實(shí)施例中的共培養(yǎng)基按照如下方法配置：：B5粉0.32g/L，MES 3.9g/L，蔗糖30g/L，6-BA 1.67mg，PH為5.45，瓊脂5.4g/L。121℃,20min高壓滅菌，加入過(guò)濾除菌的GA3 0.25mg/L，乙酰丁香酮39mg/L。

下述實(shí)例中的GUS染色液的配置方法如下：稱15mg X-Gluc,用N，N-二甲基甲酰胺溶解，溶解后添加至GUS stain buffer母液中定容至30ml，得到染色液。其中，200ml GUS stain buffer母液按照如下方法配制：取NaH₂PO₄.2H₂0 3.12g，0.5M EDTA 9.30g，20％Triton X-100 1ml，用水定容至200ml，pH＝8.0(調(diào)pH時(shí)用NaOH固體粉末調(diào)節(jié)，加到7.7-7.8時(shí)緩慢加，pH值要準(zhǔn)確)。

下述實(shí)施例中的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配置方法如下：B5粉0.32g/L，蔗糖30g/L，MES0.6g/L，6-BA 1.67mg/L，PH為5.75，瓊脂8.4g/L。121℃,20min高壓滅菌，加入過(guò)濾除菌的噻孢霉素150mg/L，羧芐青霉素250mg/L，篩選劑草甘膦15mg/L。

下述實(shí)施例中的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基按照如下方法配置：MS粉4.3g/L，MES 0.6g/L，蔗糖30g/L，B5有機(jī)10ml/L，天冬氨酸50mg/L，谷氨酰胺50mg/L，PH為5.7，瓊脂9.23g/L。121℃,20min高壓滅菌，加入過(guò)濾除菌的IAA 0.3mg/l，GA3 0.5mg/L，噻孢霉素150mg/L，羧芐青霉素350mg/L，篩選劑草甘膦3mg/L，。

下述實(shí)施例中的再生苗生根培養(yǎng)基按照如下方法配置：MS粉4.3g/L，MES0.6g/L，蔗糖30g/L，B5有機(jī)10ml/L，天冬氨酸50mg/L，谷氨酰胺50mg/L，PH為5.7，瓊脂9.23g/L。121℃,20min高壓滅菌。

下述實(shí)施例中農(nóng)桿菌侵染外植體方法如下：每個(gè)三角瓶中放30-40個(gè)制備的葉節(jié)外植體，加入含有重組菌體的侵染液35ml-45ml，使大豆子葉節(jié)外植體浸沒(méi)在侵染液中，再24℃培養(yǎng)30min，得到侵染后的外植體，期間并不時(shí)地輕搖三角瓶以使重組根癌農(nóng)桿菌和外植體充分接觸。

下述實(shí)施例中的萌發(fā)條件為溫度25℃，光強(qiáng)3000lx，D/N為16h/8h。

實(shí)施例1、大豆子葉節(jié)外植體最佳種子萌發(fā)時(shí)期選擇

一、大豆子葉節(jié)外植體制備的最佳種子萌發(fā)時(shí)期的選擇

1、對(duì)不同萌發(fā)階段種子進(jìn)行分類

根據(jù)種子萌發(fā)后子葉和下胚軸顏色及狀態(tài)差異設(shè)定種子萌發(fā)形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)如下：

(1)Y狀態(tài)：子葉呈白色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為White Group 155A或155B),下胚軸包裹在種皮中；

(2)YL狀態(tài)：子葉呈白色，下胚軸突破種皮且呈白色；

(3)HG狀態(tài)：子葉呈白色，下胚軸突破種皮且呈黃綠色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為Yellow-Green Group 145A或144B)。

(4)HG+CG狀態(tài)：子葉近下胚軸處呈黃綠色其余部分呈白色，下胚軸突破種皮且呈綠色(The RHS Colour Chart描述Green Group 143B或143C)；

(5)CG狀態(tài)：子葉全部呈黃綠色，下胚軸突破種皮且呈綠色；

(6)G狀態(tài)：子葉葉邊緣呈墨綠色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為Green Group 139A)，下胚軸突破種皮且呈綠色；

將大豆Jack品種、中黃10號(hào)品種和水里站品種的種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中培育，每個(gè)品種種子100粒。按照上述種子萌發(fā)形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同品種種子從開(kāi)始萌發(fā)至萌發(fā)148h這段時(shí)期的種子形態(tài)進(jìn)行分類，結(jié)果如圖1所示，其中A為Jack、B為中黃10號(hào)、C為水里站。

對(duì)相同萌發(fā)時(shí)間、不同狀態(tài)的種子數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖2所示，A為Jack、B為中黃10號(hào)、C為水里站，縱坐標(biāo)為某一萌發(fā)時(shí)間下處于某萌發(fā)狀態(tài)的種子數(shù)占在此萌發(fā)時(shí)間下所有種子數(shù)量的百分比；可以看出，雖因品種、種子活力不同，不同狀態(tài)外植體的比例有所差異，但趨勢(shì)相同，即隨萌發(fā)時(shí)間增加，外植體狀態(tài)發(fā)生顯著變化，依次出現(xiàn)Y、YL、HG、HG+CG、CG、G六種狀態(tài)，且相同時(shí)間條件下，存在至少一種外植體狀態(tài)，其數(shù)量顯著高于其它狀態(tài)外植體。表明，在一定程度上，可用外植體萌發(fā)狀態(tài)來(lái)指示萌發(fā)進(jìn)程，進(jìn)而可以作為指標(biāo)，指示外植體制備的最佳時(shí)期。

2、利用報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)及叢生芽率選擇子葉節(jié)外植體制備的候選種子萌發(fā)形態(tài)

分別選取大豆Jack品種、中黃10號(hào)品種和水里站品種的六種萌發(fā)形態(tài)Y、YL、HG、HG+CG、CG、G種子；

每種狀態(tài)均采用如下兩種方式制備子葉節(jié)外植體：

A、傳統(tǒng)的劃痕法；

B、超聲波與表面活性劑協(xié)同處理法。

1)瞬時(shí)表達(dá)報(bào)告基因GUS

將表達(dá)GUS基因的載體pSoy17轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，得到重組菌；再將重組菌侵染上述1)制備的各種子葉節(jié)外植體，侵染3天后，得到轉(zhuǎn)基因外植體，將轉(zhuǎn)基因外植體GUS染色，統(tǒng)計(jì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率。

每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率＝每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)入GUS外植體的數(shù)量/每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的數(shù)量

結(jié)果如圖3所示，Z-S為pSoy17侵染中黃10號(hào)品種由劃痕法制備的外植體；Z-B+C為pSoy17侵染中黃10號(hào)品種由超聲波與表面活性劑協(xié)同處理法制備的外植體；J-S為pSoy17侵染Jack品種由劃痕法制備的外植體；J-B+C為pSoy17侵染Jack品種由超聲波與表面活性劑協(xié)同處理法制備的外植體；Slz-S為pSoy17侵染水里站品種由劃痕法制備的外植體；Slz-B+C為pSoy17侵染水里站品種由超聲波與表面活性劑協(xié)同處理法制備的外植體；橫坐標(biāo)為種子不同萌發(fā)狀態(tài)，縱坐標(biāo)為染色率(瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率)＝該品種在某萌發(fā)狀態(tài)的染色外植體數(shù)/該品種在該萌發(fā)狀態(tài)的所有外植體數(shù)；可以看出，在分別利用傳統(tǒng)的劃痕法和超聲波與表面活性劑協(xié)同處理法制備外植體的條件下，各品種不同狀態(tài)外植體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率具有相同的趨勢(shì)，即水里站品種外植體所有的制備方法下在Y狀態(tài)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率效率顯著高；中黃10號(hào)品種外植體所有的制備方法在HG、HG+CG、CG狀態(tài)下瞬時(shí)表達(dá)外源基因效率顯著高(同上)；Jack品種外植體所有的制備方法在HG、HG+CG、CG狀態(tài)下瞬時(shí)表達(dá)外源基因效率顯著高(同上)(圖4A)。

2)外植體再生叢生芽率

用農(nóng)桿菌EHA105侵染上述1(A)法制備的六種萌發(fā)形態(tài)Y、YL、HG、HG+CG、CG、G的Jack品種子葉節(jié)外植體，將侵染3天后的外植體分別置于含有0mg/l草甘膦的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到叢生芽誘導(dǎo)后外植體。

每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的叢生芽率＝每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)對(duì)應(yīng)的帶有叢生芽的外植體數(shù)量/每個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的數(shù)量。

結(jié)果如圖4B所示，可以看出，Jack品種的HG狀態(tài)下制備外植體叢生芽率顯著高，但其余幾個(gè)狀態(tài)也有比較高的叢生芽率。

選取瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率顯著高的狀態(tài)和叢生芽率顯著高的狀態(tài)均作為外植體制備候選萌發(fā)時(shí)期，如Jack品種HG、HG+CG、CG為外植體制備候選萌發(fā)時(shí)期。

3、利用穩(wěn)定表達(dá)外源基因EPSPS選擇子葉節(jié)外植體制備的最佳種子萌發(fā)形態(tài)作為外植體制備時(shí)期

以Jack品種為例，具體如下：

1)子葉節(jié)外植體的制備

分別選取大豆Jack品種的外植體制備候選萌發(fā)時(shí)期HG、HG+CG、CG采用劃痕法(S)制備子葉節(jié)外植體。以其他狀態(tài)Y、YL、G作為對(duì)照。

2)穩(wěn)定表達(dá)EPSPS基因

將表達(dá)EPSPS基因的載體GR16轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，得到重組菌；再將重組菌侵染上述1)制備的各種子葉節(jié)外植體，將侵染3天后的轉(zhuǎn)染后外植體分別置于含有15mg/l草甘膦的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)后外植體；將叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)后外植體在芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中芽伸長(zhǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到芽伸長(zhǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后外植體；將芽伸長(zhǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后外植體在再生苗生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)30天，得到再生植株。

分別提取不同萌發(fā)狀態(tài)得到的再生植株的基因組DNA，檢測(cè)目標(biāo)基因，用LEP-eF2，LEP-eR2引物對(duì)草甘膦抗性基因EPSPS進(jìn)行擴(kuò)增：

LEP-eF2：5’-ATGACCCCGGCCCCAGCT-3’(序列1)

LEP-eR2：5’-ACCACCATCAATCTCGAAACG-3’(序列2)；目的條帶大小為1337bp。

PCR擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)的EPSPS基因大小相符的條帶，同時(shí)測(cè)序結(jié)果也與EPSPS基因相一致，則認(rèn)為該植株為轉(zhuǎn)入外源基因的再生植株(陽(yáng)性植株)。

統(tǒng)計(jì)每個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期下子葉節(jié)外植體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率＝(每個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)入外源基因的再生植株的數(shù)量/每個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期下子葉節(jié)外植體的數(shù)量)*100％。

結(jié)果如圖4C所示，可以看出，Jack品種的候選種子萌發(fā)狀態(tài)HG、HG+CG、CG中HG+CG狀態(tài)下制備外植體轉(zhuǎn)化效率顯著高，且也高于對(duì)照的萌發(fā)狀態(tài)Y、YL、G，因此HG+CG為Jack品種的最佳種子萌發(fā)形態(tài)，作為外植體制備時(shí)期。

因此，可以根據(jù)如下方法確定大豆種子子葉節(jié)外植體制備時(shí)期：

1)檢測(cè)待測(cè)大豆種子在6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率和叢生芽率，選擇滿足如下A和B，作為外植體制備候選萌發(fā)時(shí)期；

A為6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率中顯著高的某個(gè)萌發(fā)狀態(tài)或某幾個(gè)萌發(fā)狀態(tài)；

B為6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)下子葉節(jié)外植體的叢生芽率中顯著高的某個(gè)萌發(fā)狀態(tài)或某幾個(gè)萌發(fā)狀態(tài)；

2)檢測(cè)待測(cè)大豆種子在所述外植體制備候選萌發(fā)時(shí)期下子葉節(jié)外植體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率，選擇所有候選萌發(fā)時(shí)期子葉節(jié)外植體的轉(zhuǎn)化率顯著高的某個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期或某幾個(gè)候選萌發(fā)時(shí)期，作為外植體制備時(shí)期；

3)對(duì)所述外植體制備時(shí)期的待測(cè)大豆種子截取子葉節(jié)，得到待測(cè)大豆目標(biāo)子葉節(jié)外植體；

所述6個(gè)萌發(fā)狀態(tài)為如下(1)-(6)：

(1)Y狀態(tài)：子葉呈白色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為White Group 155A或155B),下胚軸包裹在種皮中；

(2)YL狀態(tài)：子葉呈白色，下胚軸突破種皮且呈白色；

(3)HG狀態(tài)：子葉呈白色，下胚軸突破種皮且呈黃綠色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為Yellow-Green Group 145A或144B)。

(4)HG+CG狀態(tài)：子葉近下胚軸處呈黃綠色其余部分呈白色，下胚軸突破種皮且呈綠色(The RHS Colour Chart描述Green Group 143B或143C)；

(5)CG狀態(tài)：子葉全部呈黃綠色，下胚軸突破種皮且呈綠色；

(6)G狀態(tài)：子葉葉邊緣呈墨綠色(根據(jù)The RHS Colour Chart描述，該顏色為Green Group 139A)，下胚軸突破種皮且呈綠色。

二、大豆子葉節(jié)外植體制備

截取上述Jack品種的HG+CG萌發(fā)狀態(tài)種子的子葉節(jié)，得到大豆目標(biāo)子葉節(jié)外植體。

實(shí)施例2、大豆子葉節(jié)外植體的應(yīng)用

將表達(dá)EPSPS基因的載體GR16轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，得到重組菌；再將重組菌轉(zhuǎn)染實(shí)施例1制備的Jack品種目標(biāo)子葉節(jié)外植體(HG+CG萌發(fā)狀態(tài)種子的子葉節(jié))，將侵染3天后的外植體置于含有15mg/l草甘膦的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到帶有叢生芽外植體；將帶有叢生芽外植體在芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天時(shí)間，得到帶有伸長(zhǎng)苗外植體；將帶有伸長(zhǎng)苗外植體在再生苗生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)生根培養(yǎng)30天，得到再生植株。

分別提取再生植株的基因組DNA，檢測(cè)目標(biāo)基因，用LEP-eF2，LEP-eR2引物對(duì)草甘膦抗性基因EPSPS進(jìn)行擴(kuò)增：

LEP-eF2：5’-ATGACCCCGGCCCCAGCT-3’(序列1)

LEP-eR2：5’-ACCACCATCAATCTCGAAACG-3’(序列2)；目的條帶大小為1337bp。

PCR擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)的EPSPS基因大小相符的條帶，同時(shí)測(cè)序結(jié)果也與EPSPS基因相一致，則認(rèn)為該植株為陽(yáng)性植株。

統(tǒng)計(jì)子葉節(jié)外植體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率＝(轉(zhuǎn)入外源基因的再生植株的數(shù)量/子葉節(jié)外植體的數(shù)量)*100％。

結(jié)果如圖4C，可以看出，得到1.8％的轉(zhuǎn)化率。