專(zhuān)利名稱(chēng)：一種真空滲透輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是甘蔗愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
甘蔗是我國(guó)最為重要的糖料作物，2011/2012榨季，我國(guó)蔗糖產(chǎn)量為1151萬(wàn)噸，蔗糖產(chǎn)量占到全國(guó)食糖總產(chǎn)的91%，可見(jiàn)甘蔗產(chǎn)業(yè)在保障全國(guó)食糖供應(yīng)體系中具有至關(guān)重要的地位。但是，甘蔗種植過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)病蟲(chóng)害頻繁發(fā)生、季節(jié)性干旱以及低溫冷害等問(wèn)題，造成生產(chǎn)損失嚴(yán)重，蔗農(nóng)和制糖 企業(yè)收入受損，導(dǎo)致我國(guó)制糖產(chǎn)業(yè)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力下降。因此，生產(chǎn)上迫切需要提高品種的產(chǎn)量和抗逆境脅迫能力，培育高產(chǎn)、高糖、高抗和高經(jīng)濟(jì)收益的優(yōu)良品種。甘蔗栽培種是由甘蔗屬熱帶種、細(xì)莖野生種、印度種、中國(guó)種等多個(gè)物種間的種間雜交形成的復(fù)合體，染色體數(shù)量多，基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜。甘蔗栽培種對(duì)光周期反應(yīng)敏感，一般只能在低緯度地區(qū)才能開(kāi)花，而且不同基因型的開(kāi)花時(shí)間相差較大，一些重要種質(zhì)材料經(jīng)常由于花期不育等問(wèn)題難以配置雜交組合。因此，甘蔗常規(guī)雜交育種難度大，周期長(zhǎng)，選育一個(gè)品種往往需要10年左右的時(shí)間。而且，由于甘蔗基因組大且復(fù)雜，沒(méi)有純合體，無(wú)法針對(duì)某個(gè)單一性狀進(jìn)行定向回交，新選育的種質(zhì)往往由于單一性狀的缺陷無(wú)法推廣應(yīng)用?；蚬こ淌嵌ㄏ?、快速改良植物性狀的方法，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高植物抗病蟲(chóng)以及干旱、寒害等逆境脅迫方面已經(jīng)有了許多成功報(bào)道。由于甘蔗是營(yíng)養(yǎng)繁殖，Ttl代轉(zhuǎn)基因植株就可以穩(wěn)定目標(biāo)基因性狀，與水稻、玉米等其他作物相比，甘蔗轉(zhuǎn)基因減少了外源基因自交、純合的選育過(guò)程，更容易獲得既保持供體植株原有主要目標(biāo)性狀，又對(duì)某個(gè)單一性狀進(jìn)行改良的效果。因此應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)定向改良甘蔗周期短，效果好，是甘蔗遺傳改良的重要途徑。目前甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)主要是采用基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。基因槍法雖然操作簡(jiǎn)單，但是外源基因插入拷貝數(shù)多，易產(chǎn)生嵌合體，遺傳穩(wěn)定性差。與基因槍轉(zhuǎn)化方法相t匕，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法外源基因插入的拷貝數(shù)低，對(duì)受體傷害小，設(shè)備簡(jiǎn)單。自1998年報(bào)道農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化成功以來(lái)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在甘蔗上的應(yīng)用已有多個(gè)報(bào)道。但是，目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用仍存在一些不足，轉(zhuǎn)化效率一般都在3%以下，轉(zhuǎn)化成本高、時(shí)間長(zhǎng)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗遺傳效率低的主要原因之一是在農(nóng)桿菌菌株和甘蔗愈傷細(xì)胞侵染過(guò)程中工程菌株和愈傷細(xì)胞不能充分接觸，另外在侵染后為了將共培養(yǎng)后的愈傷組織上攜帶的農(nóng)桿菌去除干凈，對(duì)愈傷組織要進(jìn)行水洗、干燥等處理，處理過(guò)程中一方面損失了一部分轉(zhuǎn)化成功的愈傷細(xì)胞，另外對(duì)愈傷細(xì)胞的生長(zhǎng)也有傷害，導(dǎo)致后期獲得轉(zhuǎn)基因植株量減少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種真空滲透輔助根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘蔗的方法，其克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提高甘蔗農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率。一種真空滲透輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗心葉愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟:
(1)甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖；
(2)含有目標(biāo)基因的根癌農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)；
(3)真空滲透輔助農(nóng)桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織；
(4)抗性材料的篩選與出苗；
(5)抗性材料鑒定。步驟(I)所述甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖方法是:
(1.0)取甘蔗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)以上不大于6cm的幼嫩心葉作為外植體，無(wú)菌條件下，將消毒好的外植體切成0.5 2.5mm的圓盤(pán)片；
(1.1)將步驟(1.0)的外植體接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于26 28°C的黑暗條件下培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)狀況良好的胚性愈傷組織繼代一次；
(1.2)挑步驟(1.1)的生長(zhǎng)狀況良好的繼代后胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接入新的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)；
愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:MS + 2-4 D (I 4)mg/L +蔗糖30g/ L +瓊脂(7 9)g/ L。步驟(2)所述含有目標(biāo)基因的根癌農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)方法是:
(2.0)挑取含有fer 基因的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105的單菌落；
(2.1)將步驟(2.0)的單菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的Iml YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度為26 28°C、震蕩速度為200 rpm的條件下，培養(yǎng)3 4小時(shí)；
(2.2)取步驟(2.1)的菌液150 300 μ L，涂布于YEP固體培養(yǎng)基(含Rif 50 mg/L和Kan 50mg/L)上，在溫度26 28°C下暗培養(yǎng)24 48小時(shí)，收集YEP固體培養(yǎng)基上的菌體；
(2.3)將所收集的菌體轉(zhuǎn)入100 200 ml含AS 150 μ mol/L的MS液體培養(yǎng)基，160 200 rpm振蕩培養(yǎng)5 6小時(shí)，菌液的OD66tl值達(dá)到0.3 0.6為轉(zhuǎn)化工程菌液；
將制備好的轉(zhuǎn)化工程菌液分裝到三角瓶中備用。步驟(3)所述真空滲透輔助農(nóng)桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織方法是:
(3.1)將步驟(I)活化培養(yǎng)3 7天后的胚性愈傷組織，放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌干燥濾紙上，使表面干燥，將處理好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入步驟(2.3)中裝有制備好的轉(zhuǎn)化工程菌液的三角瓶中，胚性愈傷組織和轉(zhuǎn)化工程菌液在溫度為22 28°C、震蕩速度為80 100rpm條件下共培養(yǎng)5 15分鐘,后放在0.02、.06 Mpa的真空壓力條件下輔助農(nóng)桿菌侵染2 4分鐘，重復(fù)2 3次重復(fù)；
(3.2)步驟(3.1)菌侵染后的愈傷組織轉(zhuǎn)入覆蓋濾紙的共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基(MS + AS150 μ mol/L)上，在溫度為21°C 24°C下暗培養(yǎng)2 5天；
(3.3)將步驟(3.2)中的愈傷組織轉(zhuǎn)接入恢復(fù)培養(yǎng)基(MS + 2,4-D (2^3) mg/L +Timentin (50^100) mg/L +蔗糖30g/L)上，在溫度為26 28 1:下暗培養(yǎng)5 7天。步驟(4)所述抗性材料的篩選與出苗的方法是:
(4.1)將經(jīng)步驟(3.3)恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接入篩選培養(yǎng)基(MS + 2，4-D(2 3)mg/L + Timentin (50 200) mg/L + PPT (1^3) mg/L + 鹿糖 30g/L), 2 周后，挑選抗性愈傷組織進(jìn)行繼續(xù)篩選培養(yǎng)；
(4.2)分化培養(yǎng)，將經(jīng)步驟(4.1) 2代篩選培養(yǎng)后的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(MS + 6-BA (2 3)mg/L + NAA ( 0.Γθ.3)mg/L + Timentin (50 100) mg/L + PPT(Γ3) mg/L +蔗糖30g/L)上，在溫度為26 28 1:下、光強(qiáng)為15001ux、每天光照時(shí)間16小時(shí)的條件進(jìn)行光照培養(yǎng)，分化出苗，獲得抗性植株；
(4.3)抗性植株培養(yǎng)，將步驟(4.2)的生長(zhǎng)到2 4厘米的抗性植株轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(MS + NAA (2 3)mg/L + Timentin (50 100)mg/L + PPT (I 3) mg/L + 鹿糖 30g/L)上，15天后抗性苗生根；
(4.4)生根培養(yǎng)，將步驟(4.3)的抗性苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為:MS + NAA (I 3)mg/L + Timentin (50 200)mg/L + PPT (I 3) mg/L + 蔗糖 50g/L,待根長(zhǎng)3 5cm時(shí)，將瓶苗在溫室中煉苗5 7天；
(4.5)將步驟(4.4)的瓶苗假植于苗圃基質(zhì)中，獲得抗性植株。步驟(5)所述抗性植株鑒定的方法是:
將獲得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用目標(biāo)基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以pCAMBIA 3301質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)；
取PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株葉片，提取RNA，根據(jù)目標(biāo)基因特異引物進(jìn)行RT-PCR分析；
取PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株葉片，用SDS方法大量提取DNA，進(jìn)行southern blot分析。本發(fā)明具有如下突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步:本發(fā)明采用的真空滲透輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化方法，在真空的情況下可促使農(nóng)桿菌通過(guò)愈傷組織細(xì)胞間的空隙進(jìn)入到深層的細(xì)胞，而且會(huì)在細(xì)胞的表面引起小傷口，致使植物分泌一些酚類(lèi)物質(zhì)以激活Ti質(zhì)粒中T-DNA的剪切和轉(zhuǎn)移，本發(fā)明完善了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化體系，與普通農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，本發(fā)明顯著提高 了甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化率。


圖1是本發(fā)明的操作流程圖。
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明；
參考圖1，一種真空滲透輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗心葉愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟:
(1)甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖；
(2)含有目標(biāo)基因的根癌農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)；
(3)真空滲透輔助農(nóng)桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織；
(4)抗性材料的篩選與出苗；
(5)抗性植株鑒定。實(shí)施例1:
步驟(I)的甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖:
(1.0)以甘蔗品種粵糖00— 236為轉(zhuǎn)化受體材料，晴天，取健康甘蔗梢部剝?nèi)ネ鈱尤~鞘后，經(jīng)0.1%升汞溶液滅菌15 20min，用無(wú)菌水沖洗3 4次，取甘蔗莖尖頂部生長(zhǎng)點(diǎn)3 5cm的幼嫩心葉作為脫毒組培用外植體。在無(wú)菌條件下，將外植體切成厚約I 2_的圓盤(pán)片，(1.1)將步驟(1.0)的外植體接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS + 2,4-D (2^3) mg/L +蔗糖30g/ L +瓊脂8 g/ L)上，再置于26 28°C的黑暗條件下培養(yǎng)15天后得到胚性愈傷組織，挑選淡黃色、分散性好的胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)一次，
(1.2)選取淡黃色，分散性好的繼代后胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接入新的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(同
1.1)上，進(jìn)行活化培養(yǎng)。步驟(2)的含有目標(biāo)基因的根癌農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng):
(2.0)挑取含有fer基因的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105的單菌落；
(2.1)將步驟(2.0)的單菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的Iml YEP液體培養(yǎng)基中，27 °C, 200 rpm培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)3 4小時(shí)；
(2.2)取步驟(2.1)的菌液150 300 μ L，涂布于YEP固體培養(yǎng)基(含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L)上，27 V下暗培養(yǎng)36小時(shí)，收集YEP固體培養(yǎng)基上的菌體；
(2.3)將所收集的菌體轉(zhuǎn)入100 200 ml含AS 150 μ mol/L的MS液體培養(yǎng)基中，160 200 rpm振蕩培養(yǎng)5 6小時(shí)，菌液的OD66tl值達(dá)到0.3 0.6為轉(zhuǎn)化工程菌液，將制備好的轉(zhuǎn)化工程菌液分裝到三角瓶中備用。步驟(3)的真空滲透輔助農(nóng)桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織:
(3.1)取步驟(1.2)活化培養(yǎng)3天的胚性愈傷組織，放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌干燥濾紙上，吹風(fēng)30分鐘左右至表面干燥，將處理好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入步驟(2)中裝有制備好的轉(zhuǎn)化工程菌液的三角瓶中，80 rpm，22 28°C培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)5 15分鐘；后放置于已進(jìn)行無(wú)菌處理的容器中，打開(kāi)三角瓶的封口膜，給予0.05 Mpa的真空壓力下輔助農(nóng)桿菌侵染3分鐘，重復(fù)2次；
(3.2)將步驟(3.1)輔助農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織轉(zhuǎn)入覆蓋濾紙的共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基(MS + AS 150 μ mol/L)上，在溫度為22°C下暗培養(yǎng)72小時(shí)；
(3.3)將步驟(3.2)中的愈傷組織轉(zhuǎn)接入恢復(fù)培養(yǎng)基(MS+ 2,4-D 3.0 mg/L +Timentin 80mg/L + 鹿糖 30g/L)上，27 °C,暗培養(yǎng) 7 天。步驟(4)所述抗性材料的篩選與分化出苗:
(4.1)篩選培養(yǎng)，將經(jīng)步驟(3.3)恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接入篩選培養(yǎng)基(MS +2，4-D 3.0 mg/L + Timentin 100 mg/L + PPT 2 mg/L + 鹿糖 30g/L ),2 周后，挑選抗性愈傷組織進(jìn)行繼續(xù)篩選培養(yǎng)；
(4.2)分化培養(yǎng)，將經(jīng)2代篩選培養(yǎng)后的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(MS +6-BA 2.0 mg/L + NM 0.1 mg/L + Timentin 100 mg/L + PPT 2 mg/L + 鹿糖30g/L)上，在溫度為27°C下、光強(qiáng)為15001UX、每天光照時(shí)間16小時(shí)的條件進(jìn)行光照培養(yǎng)，分化出苗，獲得抗性植株；
(4.3)抗性植株培養(yǎng)，將步驟(4.2)的生長(zhǎng)到2 4厘米的抗性植株轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(MS + NAA 2.0 mg/L + Timentin 100mg/L + PPT 2 mg/L + 鹿糖 30g/L)上，15 天后抗性苗生根；
(4.4)生根培養(yǎng)，將步驟(4.3)的抗性苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為:MS + NAA 2.0 mg/L + Timentin 100mg/L + PPT 2 mg/L + 蔗糖 50g/L，待根長(zhǎng) 3 5cm時(shí)，將瓶苗在溫室中煉苗5 7天；
(4.5)將步驟(4.4)的瓶苗假植于苗圃基質(zhì)中，獲得抗性植株，苗圃基質(zhì)的中蛭石、珍珠巖和泥炭土的比例為1: 1:3。步驟(5 )抗性材料的PCR鑒定:
將獲得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用Bar基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以pCAMBIA 3301質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)；
取PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株葉片，提取RNA，根據(jù)目標(biāo)基因特異引物進(jìn)行RT-PCR分析；
取PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株葉片，用SDS方法大量提取DNA，進(jìn)行southern blot分析。轉(zhuǎn)基因植株的抗除草劑鑒定:以除草劑Basta 40mg/L溶液涂抹轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的頂部I 3葉片，3 5天后觀察除草劑效果，結(jié)果表明，通過(guò)本本實(shí)施的步驟I 4獲得的抗性植株具 有抗除草劑Basta 40mg/L性能。實(shí)施例2:
本實(shí)施例的各步驟與實(shí)施例1相同，本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于:
步驟(3)的真空滲透輔助農(nóng)桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織:
(3.1)取步驟(1.2)活化培養(yǎng)3天的胚性愈傷組織，放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌干燥濾紙上，吹風(fēng)30分鐘左右至表面干燥，將處理好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入步驟(2)中裝有制備好的轉(zhuǎn)化工程菌液的三角瓶中，80 rpm，22 28°C培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)5 15分鐘；后放置于已進(jìn)行無(wú)菌處理的容器中，打開(kāi)三角瓶的封口膜，給予0.04 Mpa的真空壓力下輔助農(nóng)桿菌侵染2分鐘，重復(fù)3次；
(3.2)將步驟(3.1)輔助農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織轉(zhuǎn)入覆蓋濾紙的共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基(MS + AS 150 μ mol/L)上，在溫度為22°C下暗培養(yǎng)72小時(shí)；
(3.3)將步驟(3.2)中的愈傷組織轉(zhuǎn)接入恢復(fù)培養(yǎng)基(MS+ 2,4-D 3.0 mg/L +Timentin 100mg/L + 鹿糖 30g/L)上，27 °C,暗培養(yǎng) 7 天。轉(zhuǎn)基因植株的抗除草劑鑒定:以除草劑Basta 40mg/L溶液涂抹轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的頂部I 3葉片，3 5天后觀察除草劑效果，結(jié)果表明，通過(guò)本實(shí)施的步驟I 4獲得的抗性植株具有抗除草劑Basta 40mg/L性能。
權(quán)利要求
1.一種真空滲透輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗心葉愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟: (1)甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖； (2)含有目標(biāo)基因的根癌農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)； (3)真空滲透輔助農(nóng)桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織； (4)抗性材料的篩選與出苗； (5)抗性植株鑒定； 其特征在于: 步驟(1)所述甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖方法是: (1.0)取甘蔗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)以上不大于6cm的幼嫩心葉作為外植體，無(wú)菌條件下，將消毒好的外植體切成0.5 2.5mm的圓盤(pán)片； (1.1)將步驟(1.0)的外植體接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于26 28°C的黑暗條件下培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)狀況良好的胚性愈傷組織繼代一次； (1.2)挑步驟(1.1) 的生長(zhǎng)狀況良好的繼代后胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接入新的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)； 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:MS + 2，4-D (I 4) mg/L +蔗糖30g/ L +瓊脂(7 9) g/L ； 步驟(2)所述含有目標(biāo)基因的根癌農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)方法是: (2.0)挑取含有fer基因的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105的單菌落； (2.1)將步驟(2.0)的單菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的Iml YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度為26 28 °C、震蕩速度為200 rpm的條件下，培養(yǎng)3 4小時(shí)； (2.2)取步驟(2.1)的菌液 150 300 μ L，涂布于含 Rif 50mg/L 和 Kan 50mg/L的YEP固體培養(yǎng)基上，在溫度26 28 1:下暗培養(yǎng)24 48小時(shí)，收集YEP固體培養(yǎng)基上的菌體； (2.3)將所收集的菌體轉(zhuǎn)入100 200 ml含AS 150 μ mol/L的MS液體培養(yǎng)基，160 .200 rpm振蕩培養(yǎng)5 6小時(shí)，菌液的OD66tl值達(dá)到0.3 0.6為轉(zhuǎn)化工程菌液； 將制備好的轉(zhuǎn)化工程菌液分裝到三角瓶中備用； 步驟(3)所述真空滲透輔助農(nóng)桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織方法是: (3.1)將步驟(1.2)活化培養(yǎng)3 7天后的胚性愈傷組織無(wú)菌干燥處理后轉(zhuǎn)入步驟(2)中裝有制備好的轉(zhuǎn)化工程菌液的三角瓶中，胚性愈傷組織和轉(zhuǎn)化工程菌液在溫度為.22 28°C，震蕩速度為80 100 rpm條件下共培養(yǎng)5 15分鐘；后在0.02 0.06Mpa無(wú)菌真空壓力條件下輔助農(nóng)桿菌侵染2 4分鐘，重復(fù)2 3次； (3.2)步驟(3.1)菌侵染后的愈傷組織轉(zhuǎn)入覆蓋濾紙的共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，在溫度為21 24°C下暗培養(yǎng)2 5天；共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基是:MS + AS 150 μ mol/L ； (3.3)將步驟(3.2)中的愈傷組織轉(zhuǎn)接入恢復(fù)培養(yǎng)基上，在溫度為26 28 °C下暗培養(yǎng) 5 7 天，恢復(fù)培養(yǎng)基是:MS + 2, 4-D (2 3)mg/L + Timentin (50^100) mg/L + 蔗糖 30g/L ； 步驟(4)所述抗性材料的篩選與出苗的方法是: (4.1)篩選培養(yǎng)，將經(jīng)步驟(3.3)恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接入篩選培養(yǎng)基，2周后，挑選抗性愈傷組織于篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行繼續(xù)篩選培養(yǎng)；篩選培養(yǎng)基是:MS+ 2，4-D (2^3)mg/L + Timentin (50 200)mg/L + PPT (I 3)mg/L + 鹿糖 30g/L); (4.2)分化培養(yǎng)，將經(jīng)步驟(4.1)2代篩選培養(yǎng)后的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，在溫度為26 28 1:下、光強(qiáng)為15001UX、每天光照時(shí)間16小時(shí)的條件進(jìn)行分化培養(yǎng)，分化出苗，獲得抗性植株，分化培養(yǎng)基是:MS + 6-BA (2^3)mg/L + NAA (0.Γθ.3) mg/L+ Timentin (50 ^200) mg/L + PPT (I 3)mg/L + 鹿糖 30g/L ; (4.3)抗性植株培養(yǎng)，將步驟(4.2)中生長(zhǎng)到2 4厘米的抗性植株轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上，15天后抗性苗生根；篩選培養(yǎng)基是:MS + NAA (2 3) mg/L + Timentin (50 200)mg/L + PPT (I 3) mg/L + 鹿糖 30g/L ; (4.4)生根培養(yǎng)，將步驟(4.3)的抗性苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；生根培養(yǎng)基，待根長(zhǎng)3 5cm時(shí)，將瓶苗在溫室中煉苗5 7天；生根培養(yǎng)基是:MS + NAA ( f 3) mg/L+ Timentin (50 200) mg/L + PPT (I 3) mg/L + 鹿糖 50g/L ; (4.5)將步驟(4.4)的瓶苗假植于苗圃基質(zhì)中，獲得抗性植株； 步驟(5)所述抗性植株鑒定的方法是: 將獲得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用目標(biāo)基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以pCAMBIA 3301質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)； 取PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株葉片，提取RNA，根據(jù)目標(biāo)基因特異引物進(jìn)行RT-PCR分析； 取PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株葉片，用SDS方法大量提取DNA，進(jìn)行southern blot分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提出一種真空滲透輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其包括步驟(1)甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖；(2)含有目標(biāo)基因的根癌農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)；(3)真空滲透輔助農(nóng)桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織；(4)抗性材料的篩選與出苗；(5)抗性材料鑒定。本發(fā)明采用的真空滲透輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化方法，在真空的情況下可促使農(nóng)桿菌通過(guò)愈傷組織細(xì)胞間的空隙進(jìn)入到深層的細(xì)胞，而且會(huì)在細(xì)胞的表面引起小傷口，致使植物分泌一些酚類(lèi)物質(zhì)以激活Ti質(zhì)粒中T-DNA的剪切和轉(zhuǎn)移，本發(fā)明完善了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化體系。與普通農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，本發(fā)明顯著提高了甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化率。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103205459SQ20131008889
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月20日
發(fā)明者樊麗娜, 齊永文, 李奇?zhèn)? 鄧海華, 勞方業(yè), 李昱, 羅青文, 周文靈, 何慧怡, 陳月桂 申請(qǐng)人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所