專利名稱：一種水葫蘆生長抑制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然植物來源的除草劑，特別涉及一種防治水葫蘆的生長抑制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
水葫蘆(Eichhornia crassipes)又名鳳眼蓮，屬雨久花科，水葫蘆屬，為多年生水生植物，原產(chǎn)南美洲。目前，水葫蘆主要廣泛分布在40° N(葡萄牙)到45° S(新西蘭)之間，已經(jīng)成為世界性的水生惡性雜草之一，在我國造成了很大的危害，利用本地物種生物控制水葫蘆的研究十分缺乏。2003年1月國家環(huán)境保護局公布了 16種我國第一批外來入侵物種名單(國務(wù)院2003年第23號公報)，水葫蘆名列其中。水葫蘆于1901年引入中國，現(xiàn)已廣泛分布于華北、華東、華中和華南的19個省、自治區(qū)及直轄市。雖然水葫蘆可以作為飼料、吸附重金屬和稀土元素，但是在適宜條件下，水葫蘆以無性繁殖擴散，生長極快。目前， 水葫蘆在許多地方瘋狂繁殖，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致生物多樣性喪失，造成嚴(yán)重的生物入侵，同時還堵塞河道、影響水運和水利發(fā)電。據(jù)統(tǒng)計，每年水葫蘆災(zāi)害使我國蒙受80-100億元的經(jīng)濟損失。治理水葫蘆的主要方法有人工機械打撈、化學(xué)防治和生物防治等。水葫蘆防治的傳統(tǒng)方法是人工打撈，但是在其快速生長的季節(jié)要消耗大量的人力、物力和財力，我國在人工打撈水葫蘆上每年要花費資金1億元左右，據(jù)上海市河道管理辦公室統(tǒng)計，上海地區(qū) 2002年用于水葫蘆打撈的費用達(dá)1900萬元?；瘜W(xué)防治是治理水葫蘆的主要方法之一，2， 4-D、敵草快和草甘膦對防治水葫蘆都有明顯的效果，但是化學(xué)除草劑容易對水體環(huán)境產(chǎn)生污染，影響其它水生生物的正常生長，破壞水生生態(tài)環(huán)境。世界各國對于如何治理和控制水葫蘆觀點不一，至今尚未研制出一種安全有效的水葫蘆無公害防治劑。2000年，第二屆國際“水葫蘆生物控制和綜合治理”會議中各國的學(xué)者專家認(rèn)為生物控制水葫蘆是可行的、安全的和可持續(xù)的防治措施。生物防治水葫蘆主要利用昆蟲、病原菌及植物代謝產(chǎn)物等。其中利用植物代謝產(chǎn)物抑制水葫蘆的生長受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，已有的研究證明，馬纓丹(Lantana camara)、銀膠菊 (Parthenium hysterophorus)、里予薄荷(Coleus amboinicus)、寬絲子(Cuscutareflexa)禾口黑藻(Hydrilla verticillata)等植物的提取物或干粉懸浮液對水葫蘆的生長有顯著的抑制作用。目前，國內(nèi)學(xué)者關(guān)于利用植物代謝產(chǎn)物防治水葫蘆生長的研究較少，已見報道的有馬纓丹等，但是馬纓丹為熱帶入侵物種，在我國只分布在廣東、海南、福建、臺灣、廣西和云南等省區(qū)，利用本地物種抑制水葫蘆的研究未見報道。海州常山(Clerodendrum trichotomum)為本地物種，又名臭梧桐，屬馬鞭草科，大青屬，為落葉灌木或小喬木，廣泛分布在中國華北、華東、中南和西南各省區(qū)。該植物根、莖、葉和花均可入藥，有降壓、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和殺菌的作用。本發(fā)明研究了本地物種海州常山的葉片提取液對水葫蘆生長的抑制作用，將海州常山提取液均勻地噴施在水葫蘆葉片上，極顯著地抑制了水葫蘆的生長，同時本發(fā)明通過測定葉綠素、過氧化氫酶活性和丙二醛的含量的變化來分析海州常山提取液對水葫蘆生長的生理生化抑制機理，為生物抑制劑防治水葫蘆提供新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種有效防治水葫蘆的生物抑制劑及其制備方法，所述抑制劑顯著抑制水葫蘆的生長。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種水葫蘆生長抑制劑，所述抑制劑由海州常山葉片提取液、甘油和表面活性劑組成，所述海州常山葉片提取液與甘油和表面活性劑的體積比為85 95 1 4，所述表面活性劑為非離子表面活性劑，優(yōu)選為吐溫-20、十二烷基磺酸鈉或聚乙二醇辛基苯基醚； 所述海州常山葉片提取液是海州常山葉片于浸提液中研磨12 36小時，離心，上清液為海州常山葉片提取液，所述浸提液為0 0. 05mol ·Γ\ρΗ 5. 6 5. 8的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水；所述海州常山葉片提取液的有效量以海州常山葉片質(zhì)量計為0. 04g新鮮葉片/ml浸提液。所述水葫蘆生長抑制劑的制備方法為1)取新鮮海州常山葉片于0 0. 05mol ·Ι^、ρΗ 5. 6 5. 8的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水中研磨，5000 IOOOOg離心15分鐘， 上清液為海州常山葉片提取液a ；2)將海州常山葉片提取液a與甘油和表面活性劑混合均勻，獲得水葫蘆生長抑制劑a ；所述海州常山葉片提取液a與甘油和表面活性劑的體積比為 85 95 1 4，所述海州常山葉片提取液a的有效量以海州常山葉片質(zhì)量計為0.04g新鮮葉片/ml浸提液；所述表面活性劑為吐溫-20、十二烷基磺酸鈉或聚乙二醇辛基苯基醚。所述水葫蘆生長抑制劑有效量以海州常山葉片提取液中海州常山新鮮葉片投料的生藥量計為3 ^ig新鮮葉片/ml抑制劑。此外，一種水葫蘆生長抑制劑，所述抑制劑由海州常山葉片提取液、甘油和表面活性劑組成，所述海州常山葉片提取液與甘油和表面活性劑的體積比為85 95 1 4，所述表面活性劑為吐溫-20、十二烷基磺酸鈉或聚乙二醇辛基苯基醚；所述海州常山葉片提取液為取干燥海州常山葉片于的粉末于浸提液中浸泡M 36h，離心，上清液即為海州常山葉片提取液b，所述浸提液為0. 01 0. 05mol · L—1、pH 5. 6 5. 8的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水，所述海州常山葉片提取液的有效量以干燥海州常山葉片質(zhì)量計為0. 04g粉末/ml浸提液。此外，所述水葫蘆生長抑制劑的制備方法為1)將新鮮海州常山葉片于40 60°C 下烘干20 25h，粉碎，取粉末于0. 01 0. 05mol ·Ι^、ρΗ5. 6 5. 8的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水中浸泡24 36h，5000 IOOOOg離心15分鐘，上清液為海州常山葉片提取液b ;2)將海州常山葉片提取液b與甘油和表面活性劑混合均勻，獲得水葫蘆生長抑制劑b ；所述海州常山葉片提取液b與甘油和表面活性劑的體積比為25 35 1 4，所述海州常山葉片提取液b的有效量以干燥海州常山葉片質(zhì)量計為0. 04g粉末/ml浸提液，所述表面活性劑為非離子表面活性劑，優(yōu)選為吐溫-20、十二烷基磺酸鈉或聚乙二醇辛基苯基醚，更優(yōu)選為吐溫—20 ο所述水葫蘆生長抑制劑有效量以海州常山葉片提取液中干燥海州常山葉片投料的生藥量計為3 ^ig粉末/ml抑制劑。
本發(fā)明所述的水葫蘆生長抑制劑適合在水葫蘆生長和擴散的初期使用，直接噴灑在水葫蘆葉面上使用，致使水葫蘆葉片干枯腐爛至衰亡，恢復(fù)一周后水葫蘆枯葉率仍然有 90%，可以有效的控制水葫蘆的繁殖。該抑制劑既很好地抑制水葫蘆的生長又不會污染水體環(huán)境。由于水葫蘆具有安全越冬的特點，氣溫最低時水葫蘆的覆蓋率仍然很高，當(dāng)氣溫升高后，水葫蘆開始腐爛下沉，覆蓋率降低，然后氣溫轉(zhuǎn)暖，水葫蘆的越冬腋芽萌發(fā)成為新的植株。我們的抑制劑年初投放選擇在新的植株生長和擴散的初期，即5、6月份。之后的月份若水葫蘆有萌發(fā)趨勢，可以選擇再次投放抑制劑進行控制。本發(fā)明所述海州常山葉片提取液a和海州常山葉片提取液b均為海州常山葉片提取液，所述水葫蘆抑制劑a和水葫蘆抑制劑b均為水葫蘆抑制劑，為便于區(qū)分不同方法和步驟獲得的海州常山葉片提取液或水葫蘆抑制劑而命名。本發(fā)明所述海州常山葉片提取液是本發(fā)明抑制劑的主要成份，它能抑制水葫蘆的生長，損傷水葫蘆的生物膜系統(tǒng)，導(dǎo)致水葫蘆的葉片干枯腐爛。所述甘油為丙三醇，它的作用為保水、保濕，使溶液滯留在葉片上。所述非離子表面活性劑的作用是溶解非水溶性物質(zhì)，常作為水包油型乳化劑，使其它物質(zhì)均勻在溶液中分散，增加乳劑的穩(wěn)定性。表面活性劑和甘油的添加有效地促進了水葫蘆葉片對于海州常山葉片提取液的吸收，處理組不添加表面活性劑和甘油時，對水葫蘆沒有顯著的抑制效果。推測這是因為水葫蘆是水生植物，噴施的溶液無法長時間的滯留在葉片上，充分的發(fā)揮抑制作用。但是，甘油使處理組的溶液噴在葉片上均勻分布，形成膜狀，可能會堵塞氣孔，使氣孔導(dǎo)度下降，導(dǎo)致胞間(X)2濃度下降，蒸騰作用也可能受到影響。本發(fā)明所述的水葫蘆生長抑制劑對水葫蘆進行抑制測試，包括對葉綠素含量，過氧化氫酶活性和丙二醛含量的影響，所述葉綠素含量采用Arnon法、過氧化氫酶活性采用分光光度計法、丙二醛含量采用雙組分分光光度計法。本發(fā)明的抑制劑可以直接噴灑在水葫蘆葉面上使用，結(jié)果表明，該抑制劑可以有效地抑制水葫蘆葉片葉綠素的合成，活性氧積累，生物膜系統(tǒng)受到損傷，從而導(dǎo)致水葫蘆葉片干枯腐爛至衰亡。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在1)海州常山提取液作為水葫蘆生長抑制劑相對于其它的抑制劑有著明顯的優(yōu)勢； 海州常山提取液相對于化學(xué)除草劑更加安全，不會破壞水生生態(tài)系統(tǒng)，不易造成二次污染； 效果明顯且見效快，10天枯葉率達(dá)到90%，18天枯葉率達(dá)到99%，死亡率也達(dá)到85% ；作用持久，恢復(fù)一周后枯葉率仍然有90% ；2)雖然用烘干研磨方法制備海州常山葉片提取液需要更多原材料，在烘干過程中也會損失一部分揮發(fā)性物質(zhì)和破壞一些有效成分，但是其制備方法簡單，便于規(guī)?；闹苽洌瑫r海州常山干粉也更方便于運輸和貯存；3)海州常山提取液作為水葫蘆生長抑制劑可以很好的控制水葫蘆的生長，適合在 5、6月份水葫蘆生長和擴散的初期使用，既很好地抑制水葫蘆的生長又不會污染水體環(huán)境。4)海州常山為本地物種，非入侵物種，分布廣泛，于我國的華北、華東、中南和西南各省區(qū)均有分布，海州常山的廣泛適應(yīng)性和良好的生長能力為生物控制鳳眼蓮提供了很好的條件，用其提取液進行水葫蘆的生物控制可以在一定范圍地進行人工種植。因此，海州常山提取液是一種更安全的、有效的、持久的和易制備的水葫蘆生長抑制劑，該抑制劑可以有效地抑制水葫蘆葉片葉綠素的合成，活性氧積累，生物膜系統(tǒng)受到損傷，從而導(dǎo)致水葫蘆葉片干枯腐爛至衰亡。


圖1水葫蘆生長抑制劑對水葫蘆生長狀況的影響A1為組1施藥前，Bl為組2施藥前，Cl為組3施藥前，Dl為組4施藥前；A2為組1施藥后，B2為組2施藥后，C2為組3施藥后，D2為組4施藥后；圖2水葫蘆生長抑制劑對水葫蘆葉片健康比例況的影響；圖3水葫蘆生長抑制劑對水葫蘆葉片死亡比例況的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此本發(fā)明所用水葫蘆(Eichhornia crassipes)和海州常山 (Clerodendrumtrichotomum)均取自杭州西溪國家濕地公園，水葫蘆的挑選標(biāo)準(zhǔn)為葉片 9 12片，株高約20cm，根長約25cm，鮮重150g左右。實施例1水葫蘆生長抑制劑的制備方法取新鮮海州常山葉片4g，加0. 05mol · L-1、pH 5. 8的磷酸鈉緩沖液IOOml研磨， 5000 IOOOOg離心15分鐘，上清液即為海州常山葉片提取液，濾液可以直接使用，也可以在4°C條件下保存?zhèn)溆?；?5ml海州常山葉片提取液(海州常山葉片生藥投藥量為3. 6mg 新鮮葉片/ml抑制劑)與細(xì)1的吐溫-20和Iml的甘油混合均勻，即為水葫蘆生長抑制劑 100ml。實施例2水葫蘆生長抑制劑的制備方法將新鮮海州常山葉片于60°C下烘干Mh，粉碎，取4g粉末，加0.05mol ·Ι^、ρΗ 5.6 的磷酸鈉緩沖液IOOmL,浸泡36h，5000 IOOOOg離心15分鐘，上清液即為海州常山葉片提取液。將海州常山葉片提取液25ml(海州常山葉片生藥投藥量為3mg粉末/ml抑制劑)與 4ml的吐溫-20和Iml的甘油混合均勻，即為水葫蘆生長抑制劑30ml。實施例3水葫蘆生長抑制劑的制備方法將新鮮海州常山葉片于40°C下烘干Mh，粉碎，取4g粉末，加蒸餾水IOOmL,浸泡 24h，5000 IOOOOg離心15分鐘，上清液即為海州常山葉片提取液。將海州常山提取液 35ml (海州常山葉片生藥投藥量為^ig粉末/ml抑制劑)與細(xì)1的吐溫-20和Iml的甘油混合均勻，即為水葫蘆生長抑制劑40ml。實施例4水葫蘆生長抑制劑對水葫蘆的影響1)水葫蘆生長抑制劑對水葫蘆健康和死亡葉片比例的影響將水葫蘆置于60CmX40CmX30Cm的白色塑料箱中，每箱10株，共20箱200株， 箱中預(yù)置自來水50L，試驗共設(shè)四個組組1(處理1)為空白組，組2(處理幻為對照組，組 3(處理3)為實施例1制備的海州常山葉片提取液組，組4(處理4)為實施例2制備的海州常山葉片提取液組，每個組設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)10株水葫蘆；然后用容量為500mL的帶刻度的噴壺將實施例1和實施例2制備的海州常山提取液分別均勻地噴灑在組3和組4的水葫蘆的葉片上，空白組和對照組分別噴灑等量的緩沖液和甘油-吐溫20的混合物，每株每次10mL，每天早晚各一次，持續(xù)18天，18天后停止噴施提取液，恢復(fù)一周。每箱10株水葫蘆分置兩側(cè)，其中5株從2009年8月3日起每天記錄一次葉片總數(shù)、健康葉片數(shù)和死亡葉片數(shù)，計算健康葉片比例、枯葉率和死亡葉片比例，取均值，結(jié)果見表1，圖1 圖3。健康葉片指葉面的95%以上沒有出現(xiàn)干枯腐爛的葉片，健康葉片比例= 健康葉片數(shù)/葉片總數(shù)；枯葉率=1-健康葉片比例；死亡葉片指整個葉面全部出現(xiàn)干枯腐爛或者衰亡掉落的葉片，死亡葉片比例=死亡葉片數(shù)/總?cè)~片數(shù)。另外5株水葫蘆從2009 年8月5日起，根據(jù)下述方法每隔一天測定一次葉片的葉綠素含量、過氧化氫酶的活性和丙二醛含量，持續(xù)18天，18天后停止噴施提取液，取均值，結(jié)果見表2。表1噴施提取液對水葫蘆健康葉片比例和死亡葉片比例的影響
權(quán)利要求
1.一種水葫蘆生長抑制劑，其特征在于所述抑制劑由海州常山葉片提取液、甘油和表面活性劑組成，所述海州常山葉片提取液與甘油和表面活性劑的體積比為85 95 1 4，所述表面活性劑為吐溫-20、十二烷基磺酸鈉或聚乙二醇辛基苯基醚；所述海州常山葉片提取液是海州常山新鮮葉片于浸提液中研磨12 36小時，離心，上清液為海州常山葉片提取液，所述浸提液為0. 01 0. 05mol · L—1、pH 5. 6 5. 8的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水；所述海州常山葉片提取液的有效量以海州常山葉片質(zhì)量計為0. 04g新鮮葉片/ml浸提液。
2.如權(quán)利要求1所述的水葫蘆生長抑制劑，其特征在于所述水葫蘆生長抑制劑的制備方法為1)取新鮮海州常山新鮮葉片于0. 01 0. 05mol · ΛρΗ 5. 6 5. 8的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水中研磨，5000 IOOOOg離心15分鐘，上清液為海州常山葉片提取液；2)將海州常山葉片提取液與甘油和表面活性劑混合均勻，獲得水葫蘆生長抑制劑；所述海州常山葉片提取液與甘油和表面活性劑的體積比為85 95 1 4，所述海州常山葉片提取液的有效量以海州常山葉片質(zhì)量計為0. 04g新鮮葉片/ml浸提液；所述表面活性劑為吐溫-20、 十二烷基磺酸鈉或聚乙二醇辛基苯基醚。
3.如權(quán)利要求1所述的水葫蘆生長抑制劑，其特征在于所述水葫蘆生長抑制劑有效量以海州常山葉片提取液中海州常山新鮮葉片投料的生藥量計為3 ^ig新鮮葉片/ml抑制劑。
4.一種水葫蘆生長抑制劑，其特征在于所述抑制劑由海州常山葉片提取液、甘油和表面活性劑組成，所述海州常山葉片提取液與甘油和表面活性劑的體積比為85 95 1 4，所述表面活性劑為吐溫-20、十二烷基磺酸鈉或聚乙二醇辛基苯基醚；所述海州常山葉片提取液為取干燥海州常山葉片的粉末于浸提液中浸泡M 36h，離心，上清液即為海州常山葉片提取液，所述浸提液為0. 01 0. 05mol · L-1、pH 5. 6 5. 8的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水，所述海州常山葉片提取液的有效量以干燥海州常山葉片質(zhì)量計為0. 04g粉末/ml浸提液。
5.如權(quán)利要求4所述的水葫蘆生長抑制劑，其特征在于所述水葫蘆生長抑制劑的制備方法為1)將新鮮海州常山新鮮葉片于40 60°C下烘干20 25h，粉碎，取粉末于0 0. 05mol · ΛρΗ 5. 6 5. 8的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水中浸泡24 36h，5000 IOOOOg離心15分鐘，上清液為海州常山葉片提取液；2)將海州常山葉片提取液b與甘油和表面活性劑混合均勻，獲得水葫蘆生長抑制劑b ；所述海州常山葉片提取液b與甘油和表面活性劑的體積比為25 35 1 4，所述海州常山葉片提取液的有效量以海州常山葉片質(zhì)量計為 0. 04g粉末/ml浸提液，所述表面活性劑為吐溫-20、十二烷基磺酸鈉或聚乙二醇辛基苯基醚。
6.如權(quán)利要求4所述的水葫蘆生長抑制劑，其特征在于所述水葫蘆生長抑制劑有效量以海州常山葉片提取液中干燥海州常山葉片投料的生藥量計為3 ^ig粉末/ml抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水葫蘆生長抑制劑及其制備方法，所述抑制劑由海州常山(Clerodendrum trichotomum)葉片提取液、甘油和表面活性劑組成，所述海州常山葉片提取液與甘油和表面活性劑的體積比為85～95∶1∶4，所述表面活性劑為吐溫-20；本發(fā)明所述水葫蘆生長抑制劑可以有效地抑制水葫蘆葉片葉綠素的合成，活性氧積累，生物膜系統(tǒng)受到損傷，從而導(dǎo)致水葫蘆葉片干枯腐爛至衰亡。
文檔編號A01P13/02GK102511508SQ20111035759
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者傅智慧, 盧劍波, 李霞, 鄭彬 申請人:杭州師范大學(xué)