專利名稱：黃瓜游離小孢子的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是黃瓜游離小孢子的培養(yǎng)方法，涉及黃瓜小孢子游離、純化及懸浮液制備和 游離小孢子培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單倍體是指僅攜有配子染色體數(shù)目的個體，在作物育種實踐和遺傳育種理論研究中 均具有重要意義。單倍體經(jīng)染色體加倍即可獲得純合的雙單倍體。在育種實踐中，對單 倍體進(jìn)行染色體加倍當(dāng)代就可以獲得純系即雙單倍體群體，而利用常規(guī)育種手段培育自 交系需要6 7年，甚至更長的時間。同時，雙單倍體是絕對純合的，基因型與表現(xiàn)型完 全一致，而通過高代自交獲得的自交系仍會有少數(shù)位點是雜合的。因此，利用單倍體或 雙單倍體進(jìn)行新品種選育和品種改良可以大大縮短育種周期，提高選擇效率。在遺傳育 種理論研究中，雙單倍體在遺傳上具有絕對的純合性，是進(jìn)行AFLP、 RFLP和RAPD等 分子標(biāo)記和遺傳圖譜繪制研究的良好材料，也是進(jìn)行物種進(jìn)化研究、遺傳分析和植物基 因克隆篩選的理想材料。此外，從一些特殊材料中誘導(dǎo)獲得的單倍體具有特異的染色體 組成，如單體、三體和易位系等。譬如對遠(yuǎn)緣雜交種Fi進(jìn)行花粉培養(yǎng)可以得到異源附加 系、代換系和異位系等。這些材料都是非常好的染色體工程材料。
單倍體材料的獲得途徑包括自然發(fā)生單倍體及人工誘導(dǎo)單倍體。前者發(fā)生頻率極低，
難以應(yīng)用。目前人工誘導(dǎo)單倍體的方法主要有化學(xué)藥劑誘導(dǎo)孤雌生殖獲得單倍體、種間 遠(yuǎn)緣授粉或輻射花粉授粉誘導(dǎo)孤雌生殖獲得單倍體、延遲授粉、未授粉子房和胚珠培養(yǎng)、 花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)等。其中前3種方法需要種植較大的植株群體進(jìn)行人工誘導(dǎo)， 工作量巨大，周期長，耗時耗力，成本較高且誘導(dǎo)率低，難以利用；而未授粉子房和胚 珠培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率和植株再生率較低，并存在體細(xì)胞干擾的問題，對再生 植株鑒定的工作量增大。而游離小孢子培養(yǎng)與其他幾個方法相比具有明顯的優(yōu)勢直接 從花藥或者花蕾中游離出來的小孢子是天然分散的單倍體細(xì)胞，數(shù)量巨大，基因型豐富， 便于進(jìn)行多種遺傳操作和研究小孢子離體發(fā)育機制，能夠在較寬的基因范圍內(nèi)以較高的 誘導(dǎo)率得到小孢子胚和再生植株，可以排除體細(xì)胞影響，更易獲得純合體植株，小孢子 培養(yǎng)獲得的植株后代一般表現(xiàn)整齊，生活力穩(wěn)定。因此該技術(shù)越來越受到關(guān)注，應(yīng)用最 為廣泛，是人工獲得單倍體的重要途徑。同時，在游離小孢子培養(yǎng)過程中也有可能發(fā)生 染色體加倍，直接獲得雙單倍體材料。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種黃瓜游離小孢子培養(yǎng)方法，有效地游離純化黃瓜小孢子，制備小孢子懸浮液，并進(jìn)行小孢子離體培養(yǎng)獲得再生植株。該方法可用于黃 瓜游離小孢子培養(yǎng)獲得單倍體、雙單倍體等黃瓜材料，也為其他作物的小孢子游離、純 化、小孢子懸浮液制備及游離小孢子培養(yǎng)提供借鑒。
技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種黃瓜游離小孢子的培養(yǎng)方法。其過程是將單核靠邊期 小孢子從花藥中游離出來，之后純化小孢子、制備小孢子懸浮液進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)， 獲得再生植株。具體步驟如下
1) 取樣與預(yù)處理在盛花期于晴天上午9: 00 10: OO從健壯植株上取花蕾。采用 顯微鏡鏡檢的方法鑒定小孢子發(fā)育時期。選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾進(jìn)行低 溫預(yù)處理。
2) 花蕾消毒將花蕾先在75%酒精溶液里浸30 s，然后用0.1%升汞消毒8 min，最 后用無菌水沖洗3次，每次30 60s;
3) 游離、純化小孢子及懸浮液制備采用擠壓法游離小孢子，使用過濾和離心的 方法純化小孢子，之后用用液體培養(yǎng)基懸浮小孢子，并用血球計數(shù)板計數(shù)調(diào)整小孢子密度。
4) 胚狀體誘導(dǎo)用直徑60mm的培養(yǎng)皿分裝小孢子懸浮液，用Parafilm封口膜封 口后，在25'C下靜止暗培養(yǎng)至產(chǎn)生肉眼可見的胚狀體，之后進(jìn)行60fmin"振蕩暗培養(yǎng) 至形成子葉形胚。
5) 胚狀體萌發(fā)將子葉形胚轉(zhuǎn)移至胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基上，在25 °C、4000LX、16h-d—1 下光照培養(yǎng)，至形成無根苗或根較弱的再生植株。
6) 誘導(dǎo)生根與植株再生將無根苗以及根較弱的再生植株轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上，在 25°C、 4000 LX、 16tvd"下進(jìn)行光照培養(yǎng)至形成健壯的根。
7) 馴化與移栽將生長健壯的再生植株從培養(yǎng)瓶中取出并用無菌水洗凈培養(yǎng)基，然 后轉(zhuǎn)移到裝有滅菌土的育苗穴盤。將穴盤苗置于小拱棚中馴化，2周后將其移栽定植于大 棚溫室。
8) 染色體鑒定參照陳勁楓和錢春桃(陳勁楓，錢春桃.利用幾種園藝作物巻須制 片鑒定染色體數(shù)目的研究.園藝學(xué)報，2002,29 (4): 378 380)的方法對再生植株進(jìn)行 體細(xì)胞染色體計數(shù)，確定其倍性。
9) SSR分析SSR以孟德爾方式遺傳，呈共顯性，可鑒別純合子和雜合子。參照 Katzir (Katzir N， Danin Y, Tzuri G. Length polymorphism and homologies of microsatellites in several Cucurbitacese species. Theor. Appl. Genet, 1996, 93: 1282-1290)的方法在分子水平
(SSR)上鑒定再生植株的純合性。 有益效果
1)本發(fā)明首次在黃瓜中利用游離小孢子培養(yǎng)獲得了胚狀體和雙單倍體再生植株，可 用于研究離體雄核發(fā)育機制，同時雙單倍體可作為育種材料，也可用于遺傳分析、遺傳圖譜繪制等理論研究。
2) 黃瓜(C"c"m" L.)屬葫蘆科甜瓜屬，是一種被廣泛種植的重要的蔬菜 作物。然而，由于黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源有限，僅采用常規(guī)育種手段選育新品種 不僅耗時耗力、效率低，且難以使新品種在抗性和品質(zhì)等方面有顯著提高。而利用本發(fā) 明方法可快速獲得純系和突變體，不僅可以縮短育種年限，提高育種效率，而且可以提 供新的種質(zhì)資源，使新品種在抗性和品質(zhì)等方面得到顯著提高。應(yīng)用本發(fā)明獲得的雙單 倍體中性狀優(yōu)良的個體當(dāng)代即可直接作為育種材料用于新品種的培育。
3) 雙單倍體在遺傳上具有絕對的純合性，由其組成的群體是一個純合的永久性群 體，可避免二倍體由于來自雙親的兩條染色體在DNA堿基序列的細(xì)微差異，可以多年 多點對同一群體進(jìn)行重復(fù)試驗，從而大大提高基因定位標(biāo)圖的準(zhǔn)確性，并且保證了研究 的延續(xù)性，所以是進(jìn)行AFLP、 RFLP和RAPD等分子標(biāo)記和遺傳圖譜繪制研究，以及物 種進(jìn)化研究、遺傳分析和植物基因克隆篩選等的理想材料。
4) 本發(fā)明是基于植物細(xì)胞全能性學(xué)說即植物體的每一個細(xì)胞都攜帶有一套完整的 基因組，并具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力和對黃瓜小孢子游離、純化方法和懸浮液 制備方法的研究及黃瓜游離小孢子培養(yǎng)影響因素包括基因型、小孢子發(fā)育時期、溫度處 理和培養(yǎng)基成分等系統(tǒng)研究的工作基礎(chǔ)。小孢子具有單倍性、結(jié)構(gòu)簡單、基因型豐富、 發(fā)育同步和群體數(shù)量大等優(yōu)點，因此對小孢子進(jìn)行離體培養(yǎng)可以更好地控制雄核發(fā)育條 件和研究雄核發(fā)育機制，可以快速獲得多種基因型的單倍體或雙單倍體材料。同時游離 小孢子培養(yǎng)是對單倍性的單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，因此更易發(fā)生基因突變，擴大黃瓜基因池， 提供新種質(zhì)?？傊?，本方法具有堅實的理論依據(jù)，科學(xué)性強、方法較簡便，易于操作和 實際應(yīng)用。


圖l黃瓜游離小孢子培養(yǎng)的流程圖 圖2單核靠邊期小孢子(200x)
圖3黃瓜小孢子離體發(fā)育過程和植株再生。A.新接種的單核靠邊期小孢子(200 x); B.膨大的細(xì)
胞(200 x)，箭頭所指即為膨大的細(xì)胞；C培養(yǎng)4d后，細(xì)胞發(fā)生第一次均等分裂(200 x); D.培
養(yǎng)14d后，形成肉眼可見的球形胚(20 x); E.培養(yǎng)20d后形成的心形胚(40 x); F.培養(yǎng)30d后
形成的子葉形胚(20 x): G子葉形胚萌發(fā)及未能正常萌發(fā)的胚狀體；H.根芽葉俱全的再生小植株
圖4馴化再生植株
圖5移栽定植后的再生植株
圖6 染色體計數(shù)，2n- 14(1000x)
圖7 SSR帶型，CMAG59:引物代號
具體實施例方式
單倍體及雙單倍體在作物遺傳育種理論研究和育種實踐中均具有重要意義和廣闊的 應(yīng)用前景。單倍體材料的獲得途徑包括自然發(fā)生單倍體及人工誘導(dǎo)單倍體。前者發(fā)生頻 率極低；后者以游離小孢子培養(yǎng)應(yīng)用最為廣泛。游離小孢子培養(yǎng)是以從花藥中游離出來 的小孢子作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的一種方法。小孢子具有單倍性、結(jié)構(gòu)簡單、基因型 豐富、發(fā)育同步和群體數(shù)量大等優(yōu)點，因此對小孢子進(jìn)行離體培養(yǎng)可以更好地控制雄核 發(fā)育條件，快速獲得多種基因型的單倍體或雙單倍體材料，也更易發(fā)生基因突變，獲得 新種質(zhì)，擴大黃瓜基因池。我們應(yīng)用本發(fā)明的方法，獲得了雙單倍體黃瓜材料。
本實例就以'Poinsett97'(楊寅桂，李為觀，婁群峰，陳勁楓.黃瓜苗期熱害癥狀 及其發(fā)生發(fā)展規(guī)律研究.中國瓜菜，2007(5):1 3)作為材料，采用本發(fā)明方法獲取了雙單 倍體。實施過程如下
1. 在盛花期于晴天上午9: 00 10: OO從健壯植株上取花蕾。采用顯微鏡鏡檢的方 法鑒定小孢子發(fā)育時期，即，將花藥從花蕾中剝出，置于載玻片上，滴幾滴去離子水浸 沒花藥，用鑷子輕軋花藥使小孢子游離出來，去除殘留的花藥組織，蓋上蓋玻片，在 OLYMPUS顯微鏡下鑒定小孢子發(fā)育時期。選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期(圖，2)的 花蕾用于游離小孢子培養(yǎng)。
2. 將小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾置于4 'C下低溫預(yù)處理2d。
3. 將花蕾先在75免酒精溶液里浸30s，然后用0.1免升汞消毒8min，最后用無菌水沖 洗3次，每次30 60s。
4. 將消毒后的花蕾置于IO mL離心管中，加入4 5 mL配方為Bs+質(zhì)量比13%蔗 糖，pH為5.8，經(jīng)0.22 ^m微孔濾膜過濾滅菌的Bs-13提取液，用玻璃棒擠壓花蕾使小 孢子釋放出來；使用孔徑為76的細(xì)胞篩過濾；濾液在600 r.min-1的轉(zhuǎn)速下離心5 min， 重復(fù)離心3次，至上清無色透明；棄上清，用配方為NLN+0.5 mg丄4 2，4-D+0.2 mg-U1 6-BA+質(zhì)量比13%蔗糖，pH為5.8，用0.22 /mi微孔濾膜過濾滅菌的液體培養(yǎng)基懸浮小 孢子；最后使用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整小孢子密度約為1.0x105個.mU1 (圖2, A)。
5. 用直徑60mm的培養(yǎng)皿分裝小孢子懸浮液，每皿2mL，用Parafilm封口膜封口 后，在25 'C下進(jìn)行靜止暗培養(yǎng)，至產(chǎn)生肉眼可見的胚狀體(圖3， D和E)，之后進(jìn)行 60rmii^振蕩暗培養(yǎng)，至形成子葉形胚(圖3， F)。
6. 將子葉形胚轉(zhuǎn)移至配方為MS+0.2mg1—16-BA+質(zhì)量比3%蔗糖+質(zhì)量比0.8%瓊脂， pH為5.8，在121 。C下高壓滅菌20min的胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基MS-BA上，在25 。C、4000LX、 16h《i下光照培養(yǎng)，20 25d后形成無根苗或根較弱的再生植株(圖3， G)。
7. 將無根苗以及根較弱的再生植株轉(zhuǎn)接至配方為MS+0.2 mg七—1 IBA+質(zhì)量比3免蔗 糖+質(zhì)量比0.8%瓊脂，pH為5.8，在121 。C下高壓滅菌20min的生根培養(yǎng)基MS-IBA上，在 25°C、 4000LX、 161vd—工下進(jìn)行光照培養(yǎng)，10 d后即可獲得大量的根，形成完整的再生植株(圖3， H)。
8. 生長健壯的再生植株從培養(yǎng)瓶中取出并用無菌水洗凈培養(yǎng)基,然后轉(zhuǎn)移到裝有的 在121 'C下高壓滅菌20 min滅菌土 (蛭石草木灰=1:1)的育苗穴盤。將穴盤苗置于小 拱棚中馴化，相對濕度80 90%，溫度20 25'C。 l周后揭開小拱棚，馴化2周后將再生 植株移栽定植于大棚溫室(圖4和5)。
9. 參照陳勁楓和錢春桃(陳勁楓，錢春桃.利用幾種園藝作物巻須制片鑒定染色體 數(shù)目的研究.園藝學(xué)報，2002,29 (4): 378 380)的方法對再生植株進(jìn)行體細(xì)胞染色體 計數(shù)，確定染色體數(shù)為2n-14，初步表明小孢子再生植株為雙單倍體(圖6)。
10. 通常供體材料SSR位點是雜合的，而雙單倍體的位點為純合的，所以可以利用 SSR手段在分子水平上鑒定再生植株的純合性。參照Katzir等的方法(Katzir N, Danin Y， Tzuri G. Length polymorphism and homologies of microsatellites in several Cucurbitacese species. Theor. Appl. Genet, 1996， 93:1282-1290)檢測SSR位點的多態(tài)性。由上海生工代 理合成16對SSR引物，擴增反應(yīng)體系總體積25uL (其中dNTPs0.2mM;前后引物0.2 uM;模板DNA50ng; Taq酶lunit)。擴增反應(yīng)在PTC-100 PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為 94。C預(yù)變性5min; 94 。C30s， 55。C 30s， 72°C 80s， 35個循環(huán);72。C延伸5min，最后在 4匸下保存。PCR產(chǎn)物在9X聚丙烯酰胺上電泳，采用改良的Charters的銀染方法檢測。 根據(jù)再生植株和供體二倍體材料'Poinsett97，經(jīng)SSR分析后條帶的類型來鑒定再生植株 的純合性'Poinsett97'有兩條帶，小孢子單倍體再生植株只有一條，進(jìn)一步表明小孢 子再生植株為雙單倍體(圖7)。
雙單倍體在遺傳上是絕對純合的，基因型和表現(xiàn)型相一致。由雙單倍體構(gòu)成的群體 是一個穩(wěn)定純合的永久性群體。因此，雙單倍體在黃瓜育種實踐和理論研究中都具有十 分重要的意義。
首先，在黃瓜新品種培育和品種改良中利用雙單倍體可以縮短育種周期，提高選擇 效率。自交系選育是現(xiàn)代優(yōu)勢雜交育種的關(guān)鍵。采用傳統(tǒng)育種手段需要自交6 7代，甚 至更長時間才能夠獲得純系，而應(yīng)用本發(fā)明僅需5 6個月即可獲得純系，其中性狀優(yōu)良 的可以直接作為育種材料，進(jìn)行新品種培育或品種改良，大大縮短育種年限。雙單倍體 具有純合性，顯隱性基因當(dāng)代就可以得到完全表達(dá)，因此可以提高目標(biāo)性狀的選擇效率。 其次，雙單倍體群體在黃瓜遺傳育種理論研究中也具有重要作用。雙單倍體植株經(jīng)自交 繁種，次年即可創(chuàng)建雙單倍體群體，該群體具有絕對的純合性，是一個永久性群體，因 此利用該群體進(jìn)行AFLP、 RFLP和RAPD等分子標(biāo)記和遺傳圖譜繪制研究，物種進(jìn)化研 究、遺傳分析、植物基因克隆篩選等研究可以多年多點對同一群體進(jìn)行重復(fù)試驗，從而 使結(jié)果更加準(zhǔn)確，并保證了研究的延續(xù)性。
權(quán)利要求
1、黃瓜游離小孢子的培養(yǎng)方法，包含下列步驟1)取樣在盛花期于晴天上午9:00～10:00從健壯植株上取花蕾，將花藥從花蕾中剝出，置于載玻片上，滴幾滴去離子水浸沒花藥，用鑷子輕軋花藥使小孢子游離出來，去除殘留的花藥組織，蓋上蓋玻片，在OLYMPUS顯微鏡下觀察，選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾用于游離小孢子培養(yǎng)，將花蕾置于4℃下預(yù)處理2d；2)花蕾消毒將花蕾先在75％酒精溶液里浸30s，然后用0.1％升汞消毒8min，最后用無菌水沖洗3次，每次30～60s；3)游離、純化小孢子將消毒后的花蕾置于10mL離心管中，加入4～5mL配方為B5+質(zhì)量比13％蔗糖，pH為5.8，用0.22μm微孔濾膜過濾滅菌的B5-13提取液，用玻璃棒擠壓花蕾使小孢子釋放出來；使用孔徑為76μm的細(xì)胞篩過濾；濾液在600r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心5min，重復(fù)離心3次，至上清無色透明；棄上清，用配方為NLN+0.5mg·L-12，4-D+0.2mg·L-16-BA+質(zhì)量比13％蔗糖，pH為5.8，用0.22μm微孔濾膜過濾滅菌的液體培養(yǎng)基懸浮小孢子；最后使用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整小孢子密度約為1.0×105個·mL-1；4)胚狀體誘導(dǎo)用直徑60mm的培養(yǎng)皿分裝小孢子懸浮液，每皿2mL，用Parafilm封口膜封口后，在25℃下進(jìn)行靜止暗培養(yǎng)至產(chǎn)生肉眼可見的胚狀體，之后進(jìn)行60r·min-1振蕩暗培養(yǎng)至形成子葉形胚；5)胚狀體萌發(fā)將子葉形胚轉(zhuǎn)移至配方為MS+0.2mg·L-1 6-BA+質(zhì)量比3％蔗糖+質(zhì)量比0.8％瓊脂，pH為5.8，在121℃下高壓滅菌20分鐘的MS-BA胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基上，在25℃、4000LX、16h·d-1下光照培養(yǎng)，20～25d后形成無根苗或根較弱的再生植株；6)誘導(dǎo)生根與植株再生將無根苗以及根較弱的再生植株轉(zhuǎn)接至配方為MS+0.2mg·L-1IBA+質(zhì)量比3％蔗糖+質(zhì)量比0.8％瓊脂，pH為5.8，在121℃下高壓滅菌20分鐘的生根培養(yǎng)基上，在25℃、4000LX、16h·d-1下進(jìn)行光照培養(yǎng)，10d后即獲得完整的再生植株。
全文摘要
本發(fā)明是一種黃瓜游離小孢子培養(yǎng)的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括取花蕾，鑒定小孢子發(fā)育時期，預(yù)處理，花蕾消毒，用B₅-13提取液采用擠壓法游離小孢子，用76μm細(xì)胞篩過濾，離心，純化小孢子，在25℃下進(jìn)行靜止暗培養(yǎng)至產(chǎn)生肉眼可見的胚狀體，之后60r·min^-1振蕩暗培養(yǎng)形成子葉形胚，在MS-BA胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基上形成再生植株或無根苗，最后在生根培養(yǎng)基MS-IBA上誘導(dǎo)生根獲得完整的再生植株。本發(fā)明可以獲得單倍體或雙單倍體。雙單倍體既是良好的育種材料，可用于新品種的選育或品種改良，大大縮短育種年限，提高選擇效率；也是進(jìn)行AFLP、RFLP和RAPD等分子標(biāo)記和遺傳圖譜繪制研究和進(jìn)行物種進(jìn)化研究、遺傳分析、植物基因克隆篩選等的理想材料。
文檔編號A01H1/04GK101317548SQ200810022098
公開日2008年12月10日 申請日期2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者婁群峰, 艷 詹, 錢春桃, 陳勁楓 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)