專利名稱：一種石莼孢子的采集和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種石莼孢子的采集和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)我國(guó)沿海各海區(qū)污損生物的調(diào)查結(jié)果可以看出，石莼、滸苔、水云等大型藻類 均為秋、冬、春季節(jié)常見(jiàn)的藻類污損生物優(yōu)勢(shì)種。藻類的附著會(huì)顯著增大波浪和海流對(duì)海洋 設(shè)施產(chǎn)生的動(dòng)力載荷效應(yīng)，引發(fā)漂移甚至傾覆；堵塞水產(chǎn)養(yǎng)殖網(wǎng)箱、籠具、圍網(wǎng)等的網(wǎng)孔，影 響內(nèi)外環(huán)境水體交換，降低內(nèi)部環(huán)境的溶解氧，妨礙養(yǎng)殖對(duì)象的正常生長(zhǎng)發(fā)育。
石莼(Ulva lactuca)可食用和藥用，多生長(zhǎng)在中、低潮帶的巖石上或石沼中，也可 附生在大型海藻和各類人工設(shè)施上，在世界各地沿海均有分布，中國(guó)則多分布在中國(guó)東海 和南海沿岸。其藻體一般高10 30cm，最高可達(dá)40cm，黃綠色，近似卵圓形，邊緣稍呈波 狀，或呈廣寬的葉片狀，為兩層細(xì)胞構(gòu)成的膜狀體，基部由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞延伸成假根絲，形成固 著器。通過(guò)無(wú)性生殖和有性生殖方式進(jìn)行繁殖。生活史屬于同形世代交替，由孢子體和配 子體兩種世代的同形藻體交替出現(xiàn)以延續(xù)后代。生長(zhǎng)盛期在2 6月，為秋、冬、春期間主 要污損性藻類。 目前，有關(guān)石莼的研究涉及化學(xué)組分、生理生態(tài)、分類遺傳等方面，近來(lái)Bhattarai 等人還報(bào)道了孔石莼(U.pertusa)和裂片石莼(U. fasciata)孢子低溫儲(chǔ)存技術(shù)以期在污 染、附著機(jī)理和防除測(cè)試等領(lǐng)域應(yīng)用。然而，該方法不僅沒(méi)涉及石莼孢子的采集技術(shù)，而且
整個(gè)過(guò)程較為煩瑣、復(fù)雜首先把新鮮采集、用過(guò)濾海水洗凈的藻體浸泡在4t:氨芐青霉素 濃度為100i! g/ml的f/2配方培養(yǎng)基中1天，再用高壓消毒海水漂洗，然后室溫下在層流潔 凈臺(tái)上干燥10小時(shí)，再浸泡于過(guò)濾海水中10分鐘，4000rpm離心5分鐘收集釋放的游孢子， 最后通過(guò)光吸引選擇活潑的游孢子。 為便于開(kāi)展防污劑篩選和環(huán)保監(jiān)測(cè)方面的研究工作，簡(jiǎn)化、縮短孢子采集過(guò)程和 掌握孢子附著萌發(fā)培養(yǎng)技術(shù)極為關(guān)鍵。另外，考慮到石莼又是重要的經(jīng)濟(jì)海藻，具有較高的 營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，掌握其孢子采集和培養(yǎng)技術(shù)，在大規(guī)模養(yǎng)殖和人工栽培領(lǐng)域也具有廣闊 的應(yīng)用前景。 可以說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)中并沒(méi)有探討大量采集石莼游孢子的方法，而且也沒(méi)有提出借 助何種方法和設(shè)備可簡(jiǎn)便、持續(xù)、穩(wěn)定地大量獲得其游孢子并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。因此，了解和 掌握石莼孢子大量采集的方法和在此基礎(chǔ)上的培養(yǎng)技術(shù)，是本技術(shù)領(lǐng)域中亟待開(kāi)發(fā)的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過(guò)人工生物培養(yǎng)技術(shù)，能在小 水體中短時(shí)間內(nèi)采集到大量石莼孢子并進(jìn)行培養(yǎng)的方法。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的 —種石莼孢子的采集和培養(yǎng)方法，是取成熟的石莼片段置于載玻片上并滴加適量 海水，用光照強(qiáng)度3500 4200Lx的光照射剌激，時(shí)間控制在10分鐘以內(nèi)(具體時(shí)間的長(zhǎng)
3短取決于孢子釋放狀況，且需適時(shí)滴加少量海水防止蒸發(fā)導(dǎo)致藻體干枯)，發(fā)現(xiàn)游孢子大量 釋放時(shí)即將其收集，收集后進(jìn)行培養(yǎng)。 本發(fā)明上述的方法優(yōu)選是在顯微鏡下完成，并利用顯微鏡的內(nèi)置光源來(lái)照射；承 載成熟的石莼片段優(yōu)選采用載玻片，但載玻片并非本發(fā)明實(shí)施的唯一方式，與載玻片起到 相同或相近似作用的承載物仍然是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述成熟的石莼是指黃綠色、邊緣呈褐色的藻體。 為更好地實(shí)施本發(fā)明，在上述采集方法的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)，所 述培養(yǎng)是完成采集后將采集到的游孢子計(jì)數(shù)并用海水稀釋至特定濃度，室溫下置于黑暗環(huán) 境中使其均勻分布，均勻分布后進(jìn)行間歇性光照培養(yǎng)。 孢子采集是觀察分析藻類孢子附著萌發(fā)狀況的基礎(chǔ)，沒(méi)有足夠數(shù)量的孢子就不能 滿足生物統(tǒng)計(jì)分析的要求，從而妨礙利用這種我國(guó)沿海常見(jiàn)的大型海洋藻類孢子開(kāi)展防除 測(cè)試及環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面的工作；然而，如果沒(méi)有一個(gè)適當(dāng)?shù)逆咦痈街劝l(fā)培養(yǎng)技術(shù)來(lái)匹配， 即使能采集到大量孢子仍然無(wú)法開(kāi)展相關(guān)方面的研究，因此，孢子采集和培養(yǎng)技術(shù)的這兩 個(gè)環(huán)節(jié)是相互相承、作為一個(gè)專有技術(shù)的整體而存在，任一環(huán)節(jié)的缺失都不能完成相關(guān)測(cè) 試分析工作，故將其分割開(kāi)來(lái)僅掌握其中一個(gè)方面沒(méi)有任何意義。 所述室溫下進(jìn)行間歇性光照培養(yǎng)是每天光照強(qiáng)度為900 1300Lx照射12小時(shí)， 培養(yǎng)4天為優(yōu)選方案；室溫為26 28°C 。 所述用海水稀釋至特定濃度是為了將游孢子接種培養(yǎng)時(shí)的密度調(diào)整為3. 5X10—2 個(gè)/mm2;本發(fā)明采用這一孢子密度進(jìn)行接種培養(yǎng)，是因?yàn)樵撁芏认伦钜走M(jìn)行觀察和操作，能 更好地實(shí)施本發(fā)明。 所述黑暗環(huán)境下使游孢子均勻分布的時(shí)間為2小時(shí)，這是由于游孢子具趨光性， 在黑暗環(huán)境下可使之均勻分布在培養(yǎng)皿底部；本發(fā)明所述的2小時(shí)是優(yōu)選方案。
所述海水為天然海水，但為更好地實(shí)現(xiàn)為本發(fā)明，海水需經(jīng)過(guò)濾、煮沸消毒、冷卻 至室溫的消毒處理后，放置于經(jīng)高溫消毒的器皿中備用。 本發(fā)明所述培石莼孢子的培養(yǎng)在直徑為60mm左右的培養(yǎng)皿中進(jìn)行，是一種在小 水體中培養(yǎng)石莼孢子的方法。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明為本技術(shù)領(lǐng)域提供了一種簡(jiǎn) 便可行的大量采集石莼孢子并進(jìn)行培養(yǎng)觀察其附著萌發(fā)狀況的方法，填充了這一技術(shù)領(lǐng)域 中的空白。 本發(fā)明通過(guò)對(duì)成熟的石莼進(jìn)行強(qiáng)光照射，可促進(jìn)游孢子的釋放，滿足大量采集的 需要。本發(fā)明的培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)便，實(shí)用性強(qiáng)，周期短，對(duì)藻體成熟度要求不高，不僅可穩(wěn)定 持續(xù)獲得石莼孢子，而且產(chǎn)量大，孢子繁殖力強(qiáng)，并便于觀察其附著萌發(fā)狀況，為大規(guī)模人 工培養(yǎng)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，可用于解決穩(wěn)定、持續(xù)、大量獲得其孢子的難題，確保防污測(cè)試、環(huán) 境毒理研究、培苗育種等方面工作的順利進(jìn)行，滿足基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域工作的需 要，在海藻養(yǎng)殖及防除測(cè)試研究等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
實(shí)施例1
培養(yǎng)介質(zhì)為天然海水，海水經(jīng)過(guò)濾、煮沸消毒、冷卻至室溫后，放置于經(jīng)高溫消毒 的器皿中備用。 將采集的新鮮石莼置于消毒海水中通氣暫養(yǎng)。 取黃綠色、邊緣呈褐色藻體約2cm于載玻片上并滴加少量消毒海水，置于Nikon MD-TS100型顯微鏡載物臺(tái)上。 孢子采集試驗(yàn)分三個(gè)組，分別為A組，光強(qiáng)度3500Lx ;B組，光強(qiáng)度500 3000Lx ; C組，對(duì)照組，室內(nèi)自然光照射。光照時(shí)間均為IO分鐘，期間適時(shí)滴加海水防止蒸發(fā)導(dǎo)致藻 體干枯。鏡檢，用吸管吸取釋放的發(fā)現(xiàn)游孢子，即以吸管吸取，置于50ml小燒杯中備用。重 復(fù)以上步驟繼續(xù)采集孢子2次。另?yè)Q新鮮藻體片段，重復(fù)上述步驟采集孢子。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B組和C組的光照強(qiáng)度對(duì)藻體的成熟度要求較高，常因藻體成熟度 較差而不能有效地釋放足夠數(shù)量的孢子；A組光照強(qiáng)度則較為理想，在其剌激下，能穩(wěn)定、 持續(xù)、大量獲得所需孢子?？梢?jiàn)，強(qiáng)度為3500Lx的光照射可促進(jìn)游孢子的釋放，方便在短時(shí) 間內(nèi)大量采集游孢子。
實(shí)施例2 培養(yǎng)介質(zhì)為天然海水，海水經(jīng)過(guò)濾、煮沸消毒、冷卻至室溫后，放置于經(jīng)高溫消毒 的器皿中備用。 將采集的新鮮石莼置于消毒海水中通氣暫養(yǎng)。 取黃綠色、邊緣呈褐色藻體約2cm于載玻片上并滴加少量消毒海水，置于Nikon MD-TS100型顯微鏡載物臺(tái)上，以4000Lx的光照強(qiáng)度剌激5分鐘。鏡檢發(fā)現(xiàn)游孢子即以吸管 吸取，置于50ml小燒杯中備用。重復(fù)以上步驟繼續(xù)采集孢子2次。另?yè)Q新鮮藻體片段，重 復(fù)上述步驟采集孢子。 取少量燒杯中的孢子液于血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定每毫升水體中游孢子的數(shù) 量，用消毒海水將其稀釋為濃度不同的孢子液稀釋液。 將孢子液稀釋液置于直徑為60mm培養(yǎng)皿中，置于黑暗環(huán)境下培養(yǎng)2小時(shí)后游孢子 均勻分布，再移至光照藻類培養(yǎng)架上，每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為900Lx，26 2『C下培
養(yǎng)4天。 實(shí)驗(yàn)分5個(gè)組進(jìn)行，區(qū)別在于孢子的接種密度分別為1. 7X 10—2個(gè)/mm2 ;3. 5X 10—2 個(gè)/mm2 ;1. 7X10—1個(gè)/mm2 ;3. 5 X 10—1個(gè)/mm2 ;7. 0 X 10—1個(gè)/mm2。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)接種培養(yǎng)時(shí)孢子密度大于或等于1. 7X 10—1個(gè)/mm2時(shí)，可以發(fā)現(xiàn) 培養(yǎng)皿底部附著萌發(fā)的孢子數(shù)量過(guò)多，密度極大，嚴(yán)重妨礙統(tǒng)計(jì)觀察的進(jìn)行；而當(dāng)孢子密度 為3. 5 X 10—2個(gè)/mm2時(shí)，附著在培養(yǎng)皿底部的孢子數(shù)量最為合適，便于觀察統(tǒng)計(jì)其附著萌發(fā) 狀況。 實(shí)施例3 培養(yǎng)介質(zhì)為天然海水，海水經(jīng)過(guò)濾、煮沸消毒、冷卻至室溫后，放置于經(jīng)高溫消毒 的器皿中備用。 將采集的新鮮石莼置于消毒海水中通氣暫養(yǎng)。 取黃綠色、邊緣呈褐色藻體約2cm于載玻片上并滴加少量消毒海水，置于Nikon MD-TS100型顯微鏡載物臺(tái)上，以420Q Lx的光照強(qiáng)度剌激3分鐘。鏡檢發(fā)現(xiàn)游孢子釋放即 以吸管吸取，置于50ml小燒杯中備用。重復(fù)以上步驟繼續(xù)采集孢子2次。另?yè)Q新鮮藻體片段，重復(fù)上述步驟采集孢子。 取少量燒杯中的孢子液于血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定每毫升水體中游孢子的數(shù) 量，用消毒海水將其稀釋為濃度為不同濃度的孢子液稀釋液。 將孢子液稀釋液置于直徑為60mm培養(yǎng)皿中，置于黑暗環(huán)境下培養(yǎng)2小時(shí)后游孢子 均勻分布，再移至光照藻類培養(yǎng)架上，每天光照12時(shí)，光照強(qiáng)度為1300Lx，26 2『C下培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)分三個(gè)組進(jìn)行，區(qū)別在于培養(yǎng)時(shí)間分別為2天、4天和6天。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為2天時(shí)，孢子尚未萌發(fā)，不便觀察；而當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為6
天時(shí)，孢子已發(fā)育形成完整的幼孢子體；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為4天時(shí)，孢子開(kāi)始發(fā)育形成葉狀體的
細(xì)胞團(tuán)，故此時(shí)觀察孢子的附著萌發(fā)狀況最為理想。
權(quán)利要求
一種石莼孢子的采集和培養(yǎng)方法，其特征是取成熟的石莼片段置于載玻片上并滴加海水，用光照強(qiáng)度3500～4200Lx的光照射刺激，發(fā)現(xiàn)游孢子釋放即將其收集，收集后進(jìn)行培養(yǎng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的采集和培養(yǎng)方法，其特征在于所述光照的光源采用顯微鏡的內(nèi)置光源；所述光照射剌激的時(shí)間不超過(guò)10分鐘。
3. 如權(quán)利要求2所述的采集和培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)是將收集到的游孢子用海水稀釋，室溫下置于黑暗環(huán)境中使其均勻分布，均勻分布后進(jìn)行間歇性光照培養(yǎng)。
4. 如權(quán)利要求3所述的采集和培養(yǎng)方法，其特征在于所述室溫下進(jìn)行間歇性光照培養(yǎng)是每天光照強(qiáng)度為900 1300Lx照射12小時(shí)，培養(yǎng)4天，室溫為26 28°C 。
5. 如權(quán)利要求4所述的采集和培養(yǎng)方法，其特征在于所述游孢子的接種密度為3. 5X10—2個(gè)/mm2 。
6. 如權(quán)利要求5所述的采集和培養(yǎng)方法，其特征在于所述置于黑暗環(huán)境下使游孢子均勻分布時(shí)間為2小時(shí)。
7. 如權(quán)利要求1 6所述的任一種采集和培養(yǎng)方法，其特征在于所述海水經(jīng)過(guò)濾、煮沸消毒、冷卻至室溫的消毒處理。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種石莼孢子的采集和培養(yǎng)方法，是取成熟的石莼片段置于載玻片上并滴加海水，用光照強(qiáng)度3500～4200Lx的光照射刺激，發(fā)現(xiàn)游孢子釋放即將其收集，然后進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明通過(guò)對(duì)成熟的石莼進(jìn)行強(qiáng)光照射，可促使游孢子的釋放，滿足大量采集的需要；本發(fā)明的采集培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)便實(shí)用，對(duì)藻體成熟度要求不高，不僅可為實(shí)驗(yàn)工作穩(wěn)定持續(xù)提供具備正常生長(zhǎng)發(fā)育能力的大量孢子，而且便于大批量觀察孢子的附著萌發(fā)狀況。所提供的方法填補(bǔ)了石莼孢子采集培養(yǎng)領(lǐng)域的空白，為大規(guī)模人工培養(yǎng)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，在海藻養(yǎng)殖及防除測(cè)試研究等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01G33/00GK101692787SQ200910042348
公開(kāi)日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月1日
發(fā)明者嚴(yán)濤, 劉姍姍, 謝恩義 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所;