專利名稱：甘藍(lán)型油菜小孢子簡化高效培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及油菜小孢子培養(yǎng)方法，尤其涉及甘藍(lán)型油菜小孢子簡化高效培養(yǎng)方法，屬植物新品種培育新方法。
背景技術(shù)：
甘藍(lán)型油菜是我國主要油料作物，其遺傳育種、基因組學(xué)研究、代謝組學(xué)研究、種質(zhì)資源創(chuàng)新、細(xì)胞遺傳學(xué)研究和分子遺傳學(xué)研究十分活躍。油菜小孢子離體培養(yǎng)在上述領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用。Lichter于1982年利用甘藍(lán)型油菜游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株，隨后各國學(xué)者對影響油菜小孢子培養(yǎng)及其成苗的諸多因素進(jìn)行了廣泛的研究，使得油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)更為簡化、效率更高、便于操作。我國學(xué)者根據(jù)我國溫室栽培條件不足、取材主要來自大田的實(shí)際情況，研究了大田油菜小孢子培養(yǎng)的制約因素及相關(guān)技術(shù)，形成了一套有別于國外的甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。但是，盡管如此，甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)仍然繁瑣，效率低下，存在進(jìn)一步簡化和提高效率的要求和余地。目前甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)主要來自Lichter的方法，主要包括初花期從主花序和上部一次分枝花序上摘取處于單核晚期的花蕾16個(gè)，用75%的酒精進(jìn)行Imin的表面消毒，再在0. 的升汞中消毒lOmin。用無菌水洗滌3次，在含13%蔗糖的B5液體培養(yǎng)基(含B5大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分，pH5. 8)中研磨成勻漿，用40 μ m的尼龍網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)800r/min離心5min，除去上清液，重復(fù)3次。加8mL含16%蔗糖和50mg/L 的秋水仙素的NLN液體培養(yǎng)基中，于32°C恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2天，使小孢子加倍。將加倍后的小孢子懸浮液經(jīng)800r/min離心5min，除去上清液。再加8mL含16%蔗糖的NLN液體培養(yǎng)基，將上述小孢子懸浮液分裝于10個(gè)直徑9cm的一次性無菌培養(yǎng)皿中，添加NLN液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)皿底部覆蓋。密封后將培養(yǎng)皿置于32°C恒溫培養(yǎng)箱中熱激暗培養(yǎng)2天，然后移到25°C恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至有肉眼可見的胚狀體出現(xiàn)，轉(zhuǎn)至搖床繼續(xù)培養(yǎng)(40r/min， 25°C，黑暗)至胚狀體長大。之后將胚狀體轉(zhuǎn)移到含2%蔗糖的B5固體培養(yǎng)基(含B5大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分，0.8%瓊脂，pH5.8)的培養(yǎng)瓶中，在2°C低溫生長箱中春化處理10d，再在25°C、16h光照及弱光下光照培養(yǎng)，長大后移栽到大田。從上述的小孢子培養(yǎng)過程可以看出，甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)過程繁瑣、復(fù)雜、效率低、成本高。尤其是每次取樣折斷整個(gè)花序，使得每個(gè)單株只能取樣一次，取樣的群體要求較大。對于只有少數(shù)種子的材料難以進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，而且由于取樣來自不同的單株，單株間基因型的差別影響利用小孢子培養(yǎng)獲得的DH群體用來研究遺傳規(guī)律。而且，為了加快研究進(jìn)程，我國大部分科研、教學(xué)單位在夏季到青海加代進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，胚狀體苗的長途無菌運(yùn)輸也成為制約油菜小孢子培養(yǎng)成敗的一個(gè)因素。針對上述油菜小孢子培養(yǎng)中存在的問題進(jìn)行研究，簡化培養(yǎng)過程、提高培養(yǎng)效率、 降低培養(yǎng)成本是決定油菜小孢子培養(yǎng)能否推廣普及的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)中存在的問題，本發(fā)明在取樣時(shí)期、時(shí)間、方式、 提取液、培養(yǎng)方法、加倍方法和長途無菌運(yùn)輸?shù)燃夹g(shù)方面分別行了改進(jìn)，目的是大幅度提高甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)效率、簡化培養(yǎng)方法和培養(yǎng)程序、降低培養(yǎng)成本。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，技術(shù)方案如下
1、將取樣時(shí)期由過去的初花期提前到現(xiàn)蕾期目前油菜小孢子培養(yǎng)的取樣時(shí)間通常在油菜初花后。由于油菜花期升溫快、可供取樣的適合培養(yǎng)時(shí)間短，往往造成小孢子的培養(yǎng)時(shí)間緊，后期田間大量試驗(yàn)任務(wù)與室內(nèi)小孢子培養(yǎng)工作重疊。為了增加小孢子培養(yǎng)時(shí)間、緩解開花后期田間與室內(nèi)工作的矛盾，我們改進(jìn)了取樣時(shí)期，將現(xiàn)在的初花后取樣提前到現(xiàn)蕾以后，提前的時(shí)間大約9天左右。具體方法為在青海省西寧市青海農(nóng)科院試驗(yàn)田，在現(xiàn)蕾期、氣溫在20°C的上午或下午，選取 31005(H155XQva)每個(gè)單株上所有2. 8mm 3. 5mm單核靠邊期的花蕾40個(gè)，放入裝有碎冰的50mL離心管中，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。去掉碎冰，將30mL 84消毒液倒入50mL離心管中，蓋上蓋子，滅菌lOmin，其間反復(fù)上下?lián)u晃，使84消毒液與花蕾和管壁充分接觸滅菌。 在超凈工作臺(tái)內(nèi)將滅過菌的花蕾移入另外一個(gè)無菌的50mL離心管中，用4°C無菌水洗滌3 次。然后按照小孢子培養(yǎng)程序進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。表1取樣時(shí)期對小孢子培養(yǎng)效果的影響
距離群體初花的時(shí)間(大)接種花蕾數(shù)出胚數(shù)山胚率(枚/個(gè))
Days after first flower in No.of No. of obtained Yield of embryos
population bloomed_inoculated buds embryos_(embryo no. /bud)_
-92050625.29
-63083927.99
-340126831.71
O(CK)40136334.08
340131032.76
640103725.94
940115728.93
123576521.87
153046815.60由表1可以看出，在初花前9天(見附


圖1)，取樣培養(yǎng)可以獲得胚狀體，只是可以用來培養(yǎng)的合適大小的花蕾較少，所得的胚狀體較少，但是出賠率較高。隨著時(shí)間的推移， 可以用于培養(yǎng)的花蕾增多，出胚率也顯著增加。初花前后一周可用于培養(yǎng)的合適大小的花蕾數(shù)量大，出胚率達(dá)到最高。初花后15天以后適合培養(yǎng)的花蕾數(shù)量急劇下降，出胚率也顯著降低。所以，將小孢子培養(yǎng)的時(shí)間提前到現(xiàn)蕾期，不僅可以獲得較為理想的培養(yǎng)效果，而且可以將培養(yǎng)時(shí)間增加30%左右，緩解油菜初花期后的用工壓力。2、在一天中氣溫達(dá)到20°C左右取樣出胚率最高
多年的油菜小孢子培養(yǎng)實(shí)踐表明，取樣時(shí)的氣溫對出胚率存在較大的影響。為了提高培養(yǎng)效率，需要探究合適的取樣溫度。我們在一天的上午7點(diǎn)、上午10點(diǎn)、下午14點(diǎn)、 下午17點(diǎn)四個(gè)不同的時(shí)間取樣，發(fā)現(xiàn)出胚率明顯不同。由表2可見，一天中，上午7點(diǎn)取樣沒有得到胚狀體，上午10點(diǎn)和下午17點(diǎn)取樣能夠獲得胚狀體，但出胚率較低。下午14點(diǎn)取樣出胚率最高，培養(yǎng)效果最好。在西寧8月中旬，早上7點(diǎn)的氣溫較低(10°C左右)，下午 14點(diǎn)氣溫可達(dá)到20°C左右，上午10點(diǎn)和下午17點(diǎn)氣溫都低于20°C。表2取樣時(shí)間對小孢子培養(yǎng)效果的影響
權(quán)利要求
1.甘藍(lán)型油菜小孢子簡化高效培養(yǎng)方法，包括取樣、培養(yǎng)基提取小孢子、小孢子培養(yǎng)、 胚狀體的長途無菌運(yùn)輸及胚狀體培養(yǎng)，其特征在于，對各環(huán)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)，具體如下在甘藍(lán)型油菜現(xiàn)蕾期、氣溫20°c時(shí)，H155XQva選取每個(gè)單株上所有2. 8mm 3. 5mm單核靠邊期的花蕾30-50個(gè)，放入裝有碎冰的離心管中；去掉碎冰，將84消毒液倒入離心管中，滅菌，其間反復(fù)上下?lián)u晃；將滅過菌的花蕾，用4°C的無菌水洗滌；倒掉無菌水，在離心管中滴入4°C 的無菌13%蔗糖溶液，快速研磨成勻漿，用尼龍網(wǎng)過濾小孢子至另一無菌離心管中，加4°C 的無菌13%的蔗糖溶液，密封，離心，棄上清液，加含16%蔗糖的NLN液體培養(yǎng)基，將小孢子懸浮液分裝于培養(yǎng)皿中，添加NLN液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)皿底部覆蓋，密封；然后將培養(yǎng)皿置于 32°C恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至有肉眼可見的胚狀體出現(xiàn)，轉(zhuǎn)至搖床繼續(xù)培養(yǎng)至胚狀體長大； 將胚狀體轉(zhuǎn)入含2 %蔗糖、B5固體培養(yǎng)基的三角瓶中，或者將胚狀體裝入含13 %蔗糖、B5液體培養(yǎng)基的離心管中，密封，運(yùn)輸；之后將胚狀體轉(zhuǎn)移到含2%蔗糖、B5固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在2°C低溫生長箱中春化處理10d，再在25°C、16h光照及弱光下光照培養(yǎng)，直至移栽到溫室；等再生苗長至5 10片葉時(shí)，將苗子挖出，洗凈，用秋水仙素溶液浸根4-5小時(shí)，再將苗子栽于溫室；花期將有花粉的單株套袋，自交獲得DH種子。
2.如權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜小孢子簡化高效培養(yǎng)方法，其特征在于，取樣時(shí)期提前至蕾期、多次反復(fù)取樣、在環(huán)境溫度達(dá)到20°C以上時(shí)取樣、用蔗糖溶液替代B5培養(yǎng)液作提取液、根據(jù)胚狀體的多少選擇適當(dāng)?shù)拈L途運(yùn)輸方式等。
全文摘要
本發(fā)明涉及油菜小孢子培養(yǎng)方法，公開了一種甘藍(lán)型油菜小孢子簡化高效培養(yǎng)方法，屬植物新品種培育新方法。針對目前甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)中存在的問題，在取樣時(shí)期、時(shí)間、方式、提取液、培養(yǎng)方法、加倍方法和長途無菌運(yùn)輸?shù)燃夹g(shù)方面分別行了改進(jìn)，使得甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)效率大幅度提高，培養(yǎng)方法和培養(yǎng)程序簡化，降低了培養(yǎng)成本，方便推廣和應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102217532SQ201010147898
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者張書芬, 文雁成, 朱家成, 王建平, 趙磊 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所