一種培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子高效獲得再生植株的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子高效獲得再生植株的方法。該方法包括(1)胚胎發(fā)生，(2)胚萌發(fā)和再生植株的獲得步驟，其中(1)胚胎發(fā)生中將分離出的小孢子置于18±0.5℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，直至有肉眼可見(jiàn)的胚狀體產(chǎn)生；將小胚狀體轉(zhuǎn)到25±0.5℃、黑暗、50～55rpm搖床上震蕩培養(yǎng)，至子葉胚狀體形成。應(yīng)用此方法，可批量獲得遺傳上純合的雙單倍體植株材料，加速種質(zhì)資源創(chuàng)新，縮短育種進(jìn)程。本發(fā)明也可在結(jié)球甘藍(lán)分子標(biāo)記育種、突變體篩選及細(xì)胞全能性的模式體系等研究領(lǐng)域中推廣應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子高效獲得再生植株的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子高效獲得再生植株 的方法。 技術(shù)背景
[0002] 結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata L.)簡(jiǎn)稱(chēng)甘藍(lán)，在中國(guó)又稱(chēng)為包 菜、圓白菜、洋白菜、卷心菜等，是十字花科蕓薹屬中最重要的蔬菜作物之一。甘藍(lán)為異花授 粉植物，雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯。但是，作為綠體春化植物，受條件的限制，一般一年只能自交繁 殖一代，育成一個(gè)穩(wěn)定的自交系至少需要5?6年的時(shí)間。游離小孢子培養(yǎng)是快速獲得純 合雙單倍體的最佳方法之一，對(duì)加快農(nóng)作物的新品種選育，提高育種效率具有重要作用。此 夕卜，游離小孢子培養(yǎng)還可應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、誘變、基因轉(zhuǎn)化、突變體篩選等的研宄。同 時(shí)，小孢子胚胎誘導(dǎo)和發(fā)育作為一種研宄細(xì)胞全能性及胚胎發(fā)育的模式體系也引起越來(lái)越 多的關(guān)注。
[0003] 在蕓薹屬植物中，30?35°C熱激預(yù)處理被作為游離小孢子培養(yǎng)中誘導(dǎo)胚胎發(fā)生 的一個(gè)先決條件。目前結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)使用的誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的脅迫條件為30? 35°C熱激24?48h后再置于25°C培養(yǎng)，在此基本培養(yǎng)體系下，已有較多胚胎誘導(dǎo)成功的報(bào) 道。但是，許多基因型胚胎發(fā)生率還是很低，尤其是一些農(nóng)藝性狀重要的基因型在小孢子胚 胎形成時(shí)表現(xiàn)出頑抗性，限制了該技術(shù)在甘藍(lán)育種中大規(guī)模應(yīng)用。同時(shí)，相較于其他作物小 孢子培養(yǎng)的植株再生率，結(jié)球甘藍(lán)胚狀體的植株再生較為困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)體系存在的胚胎發(fā)生率、植株再 生頻率低的問(wèn)題，提供一種由結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子高效獲得再生植株的新方法。
[0005] 本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子獲得再生植株的方法，包括以下步驟：
[0007] (1)胚胎發(fā)生
[0008] 1)供體材料選?。哼x取健康結(jié)球甘藍(lán)植株處于單核后期的花蕾為供體花蕾；
[0009] 2)供體材料滅菌；
[0010] 3)小孢子的分離、分裝；
[0011] 4)小孢子胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上一步分離出的小孢子置于18±0. 5°C培養(yǎng)箱中 暗培養(yǎng)，直至有肉眼可見(jiàn)的胚狀體產(chǎn)生；
[0012] 5)子葉胚形成：將小胚狀體轉(zhuǎn)到25±0. 5°C、黑暗、50?55rpm搖床上震蕩培養(yǎng)， 至子葉胚狀體形成；
[0013] (2)胚萌發(fā)和再生植株的獲得
[0014] 1)胚萌發(fā)在60001x光照14h/d、25±0. 5°C條件下，將子葉胚轉(zhuǎn)接在胚萌發(fā)固體培 養(yǎng)基上于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，直至胚萌發(fā)；
[0015] 2)植株再生2?3周后，轉(zhuǎn)入植株再生固體培養(yǎng)基上，于三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)1-2 周長(zhǎng)成幼苗。
[0016] 所述的小孢子的分離、分裝方法優(yōu)選：將滅菌后的花蕾放入無(wú)菌研缽中，加入小 孢子提取培養(yǎng)基，用研棒輕輕擠壓，使小孢子從花藥中游離到溶液中，45 ym孔徑的尼龍 篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，l〇〇Xg離心3次，每次3min ;最后1次離心后，棄上清，將小孢子沉 淀懸浮在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，調(diào)整小孢子密度為1 X 105個(gè)/mL，于每個(gè)無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿 (①60mm)中分裝2mL懸浮液，并加入lOOyL 1%的活性炭，Parafilm封口。
[0017] 所述的小孢子提取培養(yǎng)基配方為：B5+蔗糖130g/L+甘露醇7g/L，pH5. 8。
[0018] 所述的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：NLN+蔗糖130g/L+阿拉伯半乳糖12mg/L， pH6. 0〇
[0019] 所述的小孢子胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中優(yōu)選將上一步分裝后的小孢子懸浮液置 于18±0. 5°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，直至有肉眼可見(jiàn)的胚狀體產(chǎn)生。
[0020] 所述的胚萌發(fā)固體培養(yǎng)基配方為：B5+蔗糖20g/L+瓊脂10g/L+6-BA 0. 15mg/L，pH 5. 8〇
[0021] 所述的植株再生固體培養(yǎng)基配方為：B5+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8。
[0022] 供體材料滅菌方法優(yōu)選先用純凈水清洗花蕾，然后在超凈工作臺(tái)中用體積比75% 酒精消毒30s，之后用體積比7%的次氯酸鈉溶液表面消毒15min，再用無(wú)菌水沖洗3次，每 次 5min〇
[0023] 有益效果
[0024] 本研宄以結(jié)球甘藍(lán)為材料，建立了高效的游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生與植株再生體 系，為結(jié)球甘藍(lán)育種、細(xì)胞、基因工程等的研宄奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的一種高效獲得結(jié) 球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)再生植株的新方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0025] (1)本發(fā)明小孢子胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為18±0. 5°C低溫培養(yǎng)直至有肉眼 可見(jiàn)的胚狀體產(chǎn)生，該培養(yǎng)條件與32. 5 ±0. 5°C高溫?zé)峒ぬ幚?4h后置于25 ±0. 5°C培養(yǎng)相 比，不但獲得了較高的胚胎發(fā)生率，而且胚狀體的質(zhì)量也得到很大改善（圖1)。
[0026] (2)本發(fā)明在胚胎發(fā)生中，不但觀察到32. 5±0. 5°C高溫?zé)峒ぬ幚?4h，再置于 25±0. 5°C培養(yǎng)下的無(wú)胚柄的多細(xì)胞類(lèi)胚結(jié)構(gòu)（圖4a)，也觀察到與合子胚相似的具有胚柄 的多細(xì)胞類(lèi)胚結(jié)構(gòu)（圖4b)，該細(xì)胞學(xué)事件為體外合子胚的發(fā)育模式研宄提供了技術(shù)平臺(tái)。
[0027] (3)本發(fā)明在植株再生中使用B5-2固體培養(yǎng)基，比使用MS-2固體培養(yǎng)基植株再生 率提尚。
[0028] (4)本發(fā)明在游離、純化小孢子的B5-13液體提取培養(yǎng)基添加7g/L甘露醇，降低小 孢子培養(yǎng)中小孢子的死亡率，提高了結(jié)球甘藍(lán)小孢子的胚胎發(fā)生。
[0029] (5)本發(fā)明在懸浮培養(yǎng)小孢子的NLN-13液體培養(yǎng)基中添加12mg/L阿拉伯半乳糖 蛋白，對(duì)小孢子胚狀體誘導(dǎo)有明顯的促進(jìn)作用，特別是誘導(dǎo)了部分難出胚基因型的胚胎發(fā) 生，這對(duì)于難出胚材料是一個(gè)較大的突破。
[0030] (6)本發(fā)明在胚萌發(fā)的B5-2固體培養(yǎng)基中添加了 0. 15mg/L 6-BA，比不添加任何 調(diào)節(jié)劑的植株再生率提高顯著。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1(a) 32. 5±0.5 °C高溫?zé)峒ぬ幚?4h再置于25±0.5°C培養(yǎng)下獲得的胚狀體； (b)18±0.5°C低溫培養(yǎng)下獲得的胚狀體；
[0032] 圖2胚狀體萌發(fā)；
[0033] 圖3植株再生；
[0034] 圖4 (a) 32. 5 ±0. 5 °C高溫?zé)峒ぬ幚?4h再置于25 ±0. 5 °C培養(yǎng)中獲得的無(wú)胚柄的 多細(xì)胞類(lèi)胚結(jié)構(gòu)；(b) 18±0. 5°C低溫培養(yǎng)中獲得的具有胚柄的多細(xì)胞類(lèi)胚結(jié)構(gòu)。 具體實(shí)施方案
[0035] 本發(fā)明所提供的結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)和植株再生的方法，通過(guò)以下實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不局限于此：
[0036] 實(shí)施例1
[0037] (1)胚胎發(fā)生
[0038] 1)供體材料選取選擇生長(zhǎng)健康的供體植株不同長(zhǎng)度的花蕾，使用鑷子擠出部分小 孢子，醋酸洋紅或4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI)熒光染料染色后在顯微鏡下對(duì) 其小孢子發(fā)育時(shí)期進(jìn)行觀察，選擇小孢子處于單核后期的花蕾為供體花蕾。不同基因型最 適培養(yǎng)時(shí)期對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度存在差異，但基本上在3. 5?4. 5_范圍內(nèi)的花蕾中處于單核 后期的小孢子比例最高。
[0039] 2)供體材料滅菌用純凈水清洗花蕾，然后在超凈工作臺(tái)中用體積比75 %酒精 消毒30s，之后用體積比7%的次氯酸鈉溶液表面消毒15min，再用無(wú)菌水沖洗3次，每次 5min〇
[0040] 3)甘露醇處理對(duì)滅菌后的花蕾用添加0(CK)、4、7、10、15g ? I71甘露醇的B5-13液 體提取培養(yǎng)基進(jìn)行游離、純化。與對(duì)照相比，隨提取培養(yǎng)基中甘露醇濃度提高，各材料的 平均出胚量隨之提高，并在Tg*!/ 1甘露醇處理時(shí)達(dá)到最高；之后，隨甘露醇濃度繼續(xù)提 高，平均出胚量又顯著下降。
[0041] 4)阿拉伯半乳糖處理將分離純化后的小孢子用添加0(CK)、6、12、20、30mg/L阿 拉伯半乳糖的NLN-13胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，觀察小孢子出胚情況。結(jié)果表明，在 NLN-13培養(yǎng)基中加入一定濃度的阿拉伯半乳糖，對(duì)小孢子胚狀體誘導(dǎo)有顯著影響。當(dāng)阿拉 伯半乳糖達(dá)到12mg/L時(shí)，供試品種的小孢子胚狀體誘導(dǎo)率最高。
[0042] 5)小孢子的分離、分裝將滅菌后的花蕾放入無(wú)菌研缽中，加入適量B5+蔗糖130g/ L+甘露醇7g/L，pH5. 8提取培養(yǎng)基，用研棒輕輕擠壓，使小孢子從花藥中游離到溶液中， 45 ym孔徑的尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，100 Xg離心3次，每次3min。最后1次離心后，棄上 清，將小孢子沉淀懸浮在NLN+蔗糖130g/L+阿拉伯半乳糖12mg/L，pH6. 0液體培養(yǎng)基中，調(diào) 整小孢子密度為1 X 105個(gè)/mL，于每個(gè)無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿（〇60mm)中分裝2mL懸浮液，并加 入100 yLl%的活性炭，Parafilm封口。
[0043] 6)誘導(dǎo)培養(yǎng)條件處理將上述培養(yǎng)皿分別置于32. 5±0. 5°C高溫?zé)峒ぬ幚?4h再置 于25±0. 5°C培養(yǎng)；18±0. 5°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，直至有肉眼可見(jiàn)的胚狀體產(chǎn)生。結(jié)果表明， 18±0. 5°C培養(yǎng)條件與32. 5±0. 5°C高溫?zé)峒ぬ幚?4h再置于25±0. 5°C培養(yǎng)相比，不但獲 得了較高的胚胎發(fā)生率，而且胚狀體的質(zhì)量也得到很大改善。
[0044] 7)子葉胚形成將小胚狀體轉(zhuǎn)到25±0. 5°C、黑暗、50-55rpm搖床上震蕩培養(yǎng)，至子 葉胚狀體形成（圖1)。
[0045] (2)胚萌發(fā)和再生植株的獲得
[0046] 1)胚萌發(fā)B5-2固體培養(yǎng)基中6-BA處理設(shè)置添加0 (CK)、0? 15mg/L、0. 3mg/L 6-BA 的B5-2固體培養(yǎng)基進(jìn)行胚萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：添加0. 15mg/L 6-BA促進(jìn)了胚萌發(fā)，并且降 低了胚褐化、玻璃化的現(xiàn)象。
[0047] 2)植株再生培養(yǎng)基處理胚萌發(fā)后，分別將其置于B5-2 (瓊脂7 % )、MS-2 (瓊脂 7%)固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果表明：B5-2培養(yǎng)基顯著提高了植株再生頻率。
[0048] 3)胚萌發(fā)在60001x光照14h ? cTdSiO. 5°C條件下，將子葉胚轉(zhuǎn)接在B5+蔗糖 2(^/1+瓊脂1(^/1+6-84 0.1511^/14115.8固體培養(yǎng)基上于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，直至胚萌 發(fā)（圖2)。
[0049] 4)植株再生2?3周后，轉(zhuǎn)入B5+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8的固體培養(yǎng)基 上，于三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)1?2周長(zhǎng)成幼苗（圖3)。
[0050] 綜上所述，在對(duì)花蕾進(jìn)行消毒后最好使用B5+蔗糖130g/L+甘露醇7g/L，pH5. 8 的液體提取培養(yǎng)基游離、純化小孢子，然后懸浮在NLN+蔗糖130g/L+阿拉伯半乳糖12mg/ L，pH6.0的液體胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于18±0.5°C暗培養(yǎng)；現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的胚狀體后，將其 轉(zhuǎn)到25±0. 5°C、50?55rpm搖床上震蕩培養(yǎng)；胚萌發(fā)培養(yǎng)基配方為B5+蔗糖20g/L+瓊 脂10g/L+6-BA 0? 15mg/L，pH 5. 8,植株再生培養(yǎng)基配方為：B5+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8〇
[0051] 附：培養(yǎng)基配方
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一種培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子獲得再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 胚胎發(fā)生 1) 供體材料選?。哼x取健康結(jié)球甘藍(lán)植株處于單核后期的花蕾為供體花蕾； 2) 供體材料滅菌； 3) 小孢子的分離、分裝； 4) 小孢子胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上一步分離出的小孢子置于18±0. 5°C培養(yǎng)箱中暗培 養(yǎng)，直至有肉眼可見(jiàn)的胚狀體產(chǎn)生； 5) 子葉胚形成：將小胚狀體轉(zhuǎn)到25±0. 5°C、黑暗、50?55rpm搖床上震蕩培養(yǎng)，至子 葉胚狀體形成； (2) 胚萌發(fā)和再生植株的獲得 1) 胚萌發(fā)在60001x光照14h/d、25±0. 5°C條件下，將子葉胚轉(zhuǎn)接在胚萌發(fā)固體培養(yǎng)基 上于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，直至胚萌發(fā)； 2) 植株再生2?3周后，轉(zhuǎn)入植株再生固體培養(yǎng)基上，于三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)1?2周長(zhǎng) 成幼苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的小孢子的分離、分裝方法為：將滅 菌后的花蕾放入無(wú)菌研缽中，加入小孢子提取培養(yǎng)基，用研棒輕輕擠壓，使小孢子從花藥中 游離到溶液中，45 y m孔徑的尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，100 X g離心3次，每次3min ;最后1 次離心后，棄上清，將小孢子沉淀懸浮在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，調(diào)整小孢子密度為1 X 105個(gè) /mL，于每個(gè)無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿（?60mm)中分裝2mL懸浮液，并加入100yL 1%的活性炭， Parafilm 封口。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的小孢子提取培養(yǎng)基配方為：B5+蔗糖 130g/L+甘露醇 7g/L，pH5.8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：NLN+ 鹿糖130g/L+阿拉伯半乳糖12mg/L，pH6. 0。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2?4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述的小孢子胚狀體的誘 導(dǎo)培養(yǎng)步驟中將分裝后的小孢子懸浮液置于18±0. 5°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，直至有肉眼可見(jiàn) 的胚狀體產(chǎn)生。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的胚萌發(fā)固體培養(yǎng)基配方為：B5+蔗 糖 20g/L+ 瓊脂 10g/L+6-BA 0? 15mg/L，pH 5. 8。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的植株再生固體培養(yǎng)基配方為：B5+ 鹿糖 20g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 5. 8。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于供體材料滅菌方法為先用純凈水清洗花 蕾，然后在超凈工作臺(tái)中用體積比75%酒精消毒30s，之后用體積比7%的次氯酸鈉溶液表 面消毒15min，再用無(wú)菌水沖洗3次，每次5min。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104429952SQ201410655306
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】曾愛(ài)松, 嚴(yán)繼勇, 宋立曉, 高兵 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院