專利名稱：利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù)選育甘藍(lán)型油菜隱性核不育系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘藍(lán)型油菜育種領(lǐng)域，具體涉及一種利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù) 選育甘藍(lán)型油菜隱性核不育系的方法。
背景技術(shù)：
甘藍(lán)型油菜游離小孢子的分離技術(shù)簡(jiǎn)單，通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得胚狀體和 再生苗的效率高，而且小孢子培養(yǎng)是研究花粉細(xì)胞分化條件、胚胎發(fā)生和形態(tài)建成機(jī)理的 一種較為理想的方法，因此該技術(shù)一直受到各國(guó)油菜育種家的普遍青睞。多年來(lái)，許多學(xué)者 對(duì)小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基成份、蕾的大小、小孢子培養(yǎng)過(guò)程中溫度的變化、提高再生苗頻率等 諸方面進(jìn)行了廣泛的研究，使得小孢子培養(yǎng)技術(shù)逐步成熟并得到了廣泛的應(yīng)用。在常規(guī)雜交育種中，獲得穩(wěn)定遺傳的后代或株系一般要經(jīng)過(guò)5 8代性狀選擇。 如果對(duì)Fl代植株進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，再生植株為單培體，經(jīng)染色體加倍后產(chǎn)生純合二倍體單 株(double haploid，簡(jiǎn)稱DH)，這種二倍體單株各種遺傳性狀已純合，不會(huì)發(fā)生分離，因此 可以快速使性狀純合；在小孢子培養(yǎng)形成的DH系后代中，沒(méi)有顯性基因掩蓋隱性基因表現(xiàn) 的干擾，有利于對(duì)隱性基因的篩選；DH系后代的性狀理論上是按照配子體基因型(花粉基 因型)分離的，即以2n分離，而F2代的性狀理論上是按照胞質(zhì)體基因型分離的，即以4n分 離，為了得到目標(biāo)性狀單株，前者群體遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于后者，因此甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)在許 多油菜育種計(jì)劃中得到應(yīng)用。20118A是上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫超才研究員于1997年選育的一種新的隱性細(xì)胞核 雄性不育，其不育株花藥空癟，無(wú)花粉，套袋自交不結(jié)實(shí)，且不育性穩(wěn)定，不受環(huán)境條件的影 響。通過(guò)普通遺傳學(xué)研究證明20118A為隱性上位互作遺傳模式，即其不育性受兩對(duì)重疊隱 性不育基因(a和b)與一對(duì)隱性上位抑制基因(rf)互作控制，隱性上位基因純合時(shí)對(duì)隱性 不育基因起作用。不育系可通過(guò)兄妹交保持，不育株的基因型有純合型aabbRfRf和雜合型 aabbRfrf兩種，三對(duì)基因?yàn)殡[性(aabbrfrf)時(shí)可作臨保系，與純合型不育系雜交能夠生產(chǎn) 全不育群體，然后利用全不育系與恢復(fù)系雜交生產(chǎn)雜交種(參見(jiàn)


圖1)。目前由該系統(tǒng)選育 的三個(gè)國(guó)審雙低雜交油菜品種“滬油雜1號(hào)”、“向農(nóng)03”和“滬油雜4號(hào)”正在生產(chǎn)上大面 積的推廣，說(shuō)明該不育系統(tǒng)具有廣闊的應(yīng)用前景與生產(chǎn)利用價(jià)值。但是由于隱性核不育系是受到三對(duì)基因控制(aabbRfRf)，分離群體大，基因型多 且復(fù)雜，導(dǎo)致測(cè)交與測(cè)交種鑒定的工作量大，選育難度很大。利用常規(guī)育種技術(shù)，隱性核不 育系是以隱性核不育純合兩型系的形式應(yīng)用于雜交種生產(chǎn)的，即隱性核不育系需要借助于 純合兩型系兄妹交來(lái)繁殖和保存(圖2)，為了使得純合兩型系中的不育株和可育株遺傳背 景一致，必須經(jīng)過(guò)5代以上兄妹交，因此導(dǎo)致其選育周期長(zhǎng)，而且在生產(chǎn)全不育系時(shí)需要在 母本行中拔除純合兩型系中50%的可育株，影響全不育系的產(chǎn)量與質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育 隱性核不育系的方法，通過(guò)甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)，尋找一種簡(jiǎn)單、可行、高效技術(shù)能 夠快速獲得隱性核不育系(基因型為aabbRfRf)。由于通過(guò)甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得的DH隱性核不育株不能自交保存，需 借助于甘藍(lán)型油菜無(wú)性克隆技術(shù)保存并大量繁殖所得到的DH不育株。因此，本發(fā)明利用無(wú) 性克隆技術(shù)，保存與擴(kuò)繁依據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案得到的DH隱性核不育系，直接將其用于隱性 核不育雜交油菜育種中，從而擺脫了原有隱性核不育三系法制種時(shí)對(duì)隱性核不育純合兩型 系的依賴，同時(shí)減少了全不育系生產(chǎn)時(shí)母本行中拔除純合兩型系內(nèi)可育株的步驟，簡(jiǎn)化了 生產(chǎn)步驟，提高了全不育系種子的純度。本發(fā)明所述的利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育甘藍(lán)型油菜隱性核不育系的方法，首先以 優(yōu)良的品種/系與隱性核不育系或臨保系雜交，獲得F1代；然后以甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng) 技術(shù)對(duì)F1代植株的游離小孢子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)而獲得DH株系；再以表現(xiàn)為不育的DH株系與 臨保系測(cè)交，測(cè)交種為100%不育，則對(duì)應(yīng)的不育DH株系為本發(fā)明所述的隱性核不育系 ’然 后借助于無(wú)性克隆技術(shù)保存并擴(kuò)繁不育的DH株系，應(yīng)用于雜交種生產(chǎn)。所述方法具體包括以下步驟a、以F1代植株為供體，在花蕾期，每次從油菜花序上取3 4mm大小的蕾，表面 消毒后用無(wú)菌水清洗3次；加入B5培養(yǎng)液研磨，用40 μ m尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液經(jīng)過(guò)IOOg離心 5-8min，吸去上清液后，再向離心管中加含秋水仙堿的NLN-16培養(yǎng)液密封，置于32°C的恒 溫箱中暗培養(yǎng)48h，然后重復(fù)上述步驟離心，吸去上清液，加入NLN-13培養(yǎng)液分裝到培養(yǎng)皿 中，密封，置于25°C的恒溫箱中暗培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見(jiàn)到胚狀體后轉(zhuǎn)到25°C搖床上繼續(xù)暗培 養(yǎng)1-2周。b、將上述a步中的胚狀體轉(zhuǎn)移到固體B5培養(yǎng)基上，在10°C的光照培養(yǎng)室中誘導(dǎo)形 成小植株，然后置于25°C的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，并將每個(gè)不同基因型的小植株擴(kuò)繁多個(gè)拷 貝，以保證每個(gè)基因型都能存活。C、將上述b步中的小植株分不同基因型種植到田間，到花期，將加倍成功的不育 DH株系與隱性核不育臨保系測(cè)交。d、將上述c步中測(cè)交種進(jìn)行鑒定，若測(cè)交種為全部不育，則對(duì)應(yīng)的單株即為本發(fā) 明的隱性核不育系。f、將上述d步中鑒定的優(yōu)良隱性核不育系進(jìn)行無(wú)性克隆，并擴(kuò)繁得到生產(chǎn)上需要 的大量不育株，用于生產(chǎn)全不育系，進(jìn)而生產(chǎn)商用雜交種。由于甘藍(lán)型油菜種子的繁殖系數(shù)為1 1000左右，所以利用無(wú)性克隆擴(kuò)繁不育株 的方法無(wú)論是在理論上還是實(shí)踐中都有可行性，利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù)快速獲得 甘藍(lán)型油菜隱性核不育系在甘藍(lán)型油菜隱性核不育雜交育種體系中的應(yīng)用價(jià)值很高。所述F1代是以優(yōu)良的品種/系為母本，以隱性核不育臨保系為父本雜交而成。所述優(yōu)良的品種/系母本為滬油15，系上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫超才研究員選育而 成，是上海市第一個(gè)通過(guò)國(guó)家油菜品種審定和獲得國(guó)家植物新品種保護(hù)的甘藍(lán)型雙低油菜 品種，被國(guó)家科技部和農(nóng)業(yè)部列為國(guó)家級(jí)成果重點(diǎn)推廣品種之一，含油率為42. 43%，芥酸 含量為0. 38%，硫苷含量為19. 01 ymol/g，農(nóng)藝性狀優(yōu)良。
所述隱性核不育臨保系為臨保系M-6029，基因型為aabbrfrf，可育，與隱性核不 育20118A(aabbRfRf)雜交，其后代基因型為aabbRfrf，仍不育，但是該不育性只能保持 一代，其后代會(huì)發(fā)生育性分離，故稱基因型aabbrfrf的M-6029為甘藍(lán)型油菜隱性核不育 20118A的臨保系，系上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫超才于1999年在隱性核不育20118A的測(cè)交組合 中通過(guò)連續(xù)的自交，測(cè)交選育而成。利用上述隱性核不育臨保系M-6029對(duì)不育株的DH株系進(jìn)行基因型鑒定。其中，上述方法中所用到的B5培養(yǎng)液為B5基本組份+130g蔗糖/L ；固體B5培養(yǎng) 基為B5基本組份+25g蔗糖+7g瓊脂粉/L ；NLN-13培養(yǎng)液為NLN基本組份+130g蔗糖/L ； NLN-16培養(yǎng)液為NLN基本組份+160g蔗糖+IOOmg秋水仙素/L。B5基本組份和NLN基本組 份的配方如下表1所示。 表IB5基本組份和NLN基本組份的配方(mg/L)
名稱B5NLN大 I=TKNO3 CaCl,2H202500 150125里MgS04.7H20250125元KH2PO4-125素(NH4)2SO4134-NaH2P04'2H20150-(20 X )Ca(NO3)2 ·4Η20-500鐵鹽FeS04.7H2027.827.8(20 X )Na2.EDTA37.337.3微KI0.750.83I=IH3BO336.2里MnS04.H201017.37元ZnSOWH2O210.59素Na2Mo04.2H200.250.25CaS04'5H200.0250.025(200X )COC12.6H200.0250.025肌醇0.10.1煙酸15有廿氨酸 鹽酸硫氨(Bi)102 0.5機(jī)鹽酸吡哆素(B6)10.5物 (200 X )絲氨酸 谷胱甘肽 葉酸 生物素 谷氨酸胺-0.1 0.03 0.5 0.05 0.8
5
本發(fā)明與原有隱性核不育系(原有的隱性核不育系是以隱性核不育純合兩型系 的形式應(yīng)用于雜交種生產(chǎn)的)的選育相比具有以下優(yōu)勢(shì)1.與原有隱性核不育系的選育相比效率更高從原有的以優(yōu)良的品種(系)與 隱性核不育臨保系或不育系雜交，獲得F1代，以基因型為AaBbRfrf為例，利用常規(guī)的育種 方法自交，從F2代植株中獲得不育系的概率為1/64 (參見(jiàn)表2)，而利用甘藍(lán)型油菜小孢子 技術(shù)選育不育系，其DH后代實(shí)際上為8種雄配子基因型中的一個(gè)，故不育系的出現(xiàn)頻率為 1/8，因此選育效率更高。表2F1自交后代的表現(xiàn)型
權(quán)利要求
一種利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù)選育甘藍(lán)型油菜隱性核不育系的方法，其特征在于，包括以下步驟a、以F1代植株為供體，在花蕾期，每次從油菜花序上取3～4mm大小的蕾，表面消毒后用無(wú)菌水清洗3次；加入B5培養(yǎng)液研磨，用40μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液經(jīng)過(guò)100g離心5 8min，吸去上清液后，再向離心管中加含秋水仙堿的NLN 16培養(yǎng)液密封，置于32℃的恒溫箱中暗培養(yǎng)48h，然后重復(fù)上述步驟離心，吸去上清液，加入NLN 13培養(yǎng)液分裝到培養(yǎng)皿中，密封，置于25℃的恒溫箱中暗培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見(jiàn)到胚狀體后轉(zhuǎn)到搖床上繼續(xù)培養(yǎng)1 2周；b、將上述a步中的胚狀體轉(zhuǎn)移到固體B5培養(yǎng)基上，在10℃的光照培養(yǎng)室中誘導(dǎo)形成小植株，然后置于25℃的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，并將每個(gè)不同基因型的小植株擴(kuò)繁多個(gè)拷貝；c、將上述b步中的小植株分不同基因型種植到田間，到花期，將加倍成功，且表現(xiàn)為不育的DH株系與隱性核不育臨保系測(cè)交；d、將上述c步中測(cè)交種進(jìn)行鑒定，若測(cè)交種為全部不育，則對(duì)應(yīng)的單株即為隱性核不育系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù)選育甘藍(lán)型油菜隱性核不 育系的方法，其特征在于，所述F1代是以優(yōu)良的品種/系與隱性核不育系或臨保系雜交而 成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù)選育甘藍(lán)型油菜隱性核不 育系的方法，其特征在于，所述優(yōu)良的品種/系為滬油15。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù)選育甘藍(lán)型油菜隱性核不 育系的方法，其特征在于，所述隱性核不育臨保系為臨保系M-6029，基因型為aabbrfrf，可育。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù)選育甘藍(lán)型油菜隱性核不 育系的方法，其特征在于，利用隱性核不育臨保系M-6029對(duì)表現(xiàn)為不育的DH株系進(jìn)行基因型鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù)選育甘藍(lán)型油菜隱性核不 育系的方法，其特征在于，通過(guò)無(wú)性克隆技術(shù)對(duì)所獲得的隱性核不育系進(jìn)行永久保存，并擴(kuò) 繁得到生產(chǎn)上需要的大量不育株，用于生產(chǎn)全不育系，進(jìn)而生產(chǎn)商用雜交種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用小孢子培養(yǎng)和無(wú)性克隆技術(shù)選育甘藍(lán)型油菜隱性核不育系的方法，通過(guò)優(yōu)良的品種/系與隱性核不育不育系或臨保系雜交，獲得F1代；然后以甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)對(duì)F1代植株的游離小孢子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得DH株系；再以表現(xiàn)為不育性狀的DH株系和臨保系測(cè)交，測(cè)交種為100％不育，對(duì)應(yīng)的不育DH株系即為本發(fā)明所述的隱性核不育系，然后利用無(wú)性克隆技術(shù)可以快速獲得大量用于全不育生產(chǎn)的不育系植株。本發(fā)明可以快速獲得遺傳背景穩(wěn)定優(yōu)良的不育系并在甘藍(lán)型油菜隱性核不育雜交育種上得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101946715SQ20101027467
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者周熙榮, 周音, 孫超才, 莊靜, 張智奇, 李延莉, 楊立勇, 王偉榮, 蔣美艷, 顧龍弟 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院